精准前沿丨联合空间转录组和单细胞转录组绘制人类肺部远端气道细胞图谱

本期《精准前沿》栏目分享美国杜克大学医学院Purushothama研究团队发表于Nature（IF=69.504）上的一篇研究‍‍‍[1]，‍研究利用空间转录组和微切割的单细胞转录组测序技术，详细绘制了肺部远端气道的细胞转录图谱，并且新发现了一些位于TRBs（终末期和呼吸性细支气管）的独特细胞类型，包括LGR5阳性的成纤维细胞、TRB特异的肺泡0型细胞（AT0）和分泌型细胞（TRB-SCs）。受体配体连接组分析（connectome）和类器官实验表明，LGR5+成纤维细胞是形成气道生态位的信号枢纽结构的主要细胞。AT0细胞和TRB-SCs在灵长类动物的肺部发育过程中基本不分化，而在人类肺部中呈现动态变化。利用非人类的灵长类肺损伤动物模型，结合人类来源的类器官和肺组织样本，发现参与肺部再生的AT2细胞向肺泡I型细胞或TRB-SCs细胞转化时，会存在短暂的AT0状态。这种转化关系先前并未在小鼠的肺部中发现。此外，该研究在临床样本中进一步验证AT0双向转化的潜能。

研究背景

气道（airway）是人类呼吸系统的重要组成部分，主要的功能是气体传导和交换。在解剖学上，气道主要结构组成包括气管（Trachea）、支气管（bronchus）、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。远端气道（Terminal and respiratory bronchioles，TRBs），包括终末细支气管和呼吸性细支气管。研究表明，远端气道病理性重塑与特发性肺部纤维化（IPF, idiopathic pulmonary fibrosis）和慢性阻塞性肺病（COPD, chronic obstructive pulmonary disease）等呼吸性疾病的发病机制密切相关。单细胞组学技术的发展使得我们对组织的细胞组成和分子特征有了更深的理解。如今，人们已经利用单细胞组学技术绘制了多张肺细胞图谱。然而，这些研究获取细胞的方式大多数依赖于活检样本或通过气管刷取，并不代表肺部全景和缺乏空间位置信息。此外，这些图谱并未涵盖人类TRBs结构的细胞组分。TRBs位于气道与肺泡之间的交界处，并构成一个过渡区，被认为在一些慢性呼吸病，例如特发性肺纤维和慢性阻塞性肺病，起到关键作用。与小鼠肺的连接区明显不同，人类的TRBs是一个极其微小的结构，长度小于2 mm和直径也不到1 mm。因此，对该区域的细胞展开研究依旧存在不少挑战。本研究的目的就是联合空间转录组测序、单细胞转录组测序和类器官模型，对TRBs的细胞组成和疾病相关的动态变化进行深入解析，力图绘制一幅较为全面的人类TRBs细胞图谱。

研究设计

（1）临床样本（发现）：人类肺组织样本空间转录组测序和单细胞转录组测序。健康人和IPF、COPD和急性肺损伤患者的肺组织近端（proximal）和远端（distal）10×Visium空间转录组测序。同时，对远端气道进行10×genomics单细胞转录组测序。

（2）体外实验：分离人类肺AT2细胞并不同的培养基条件下进行类器官培养，并进行scRNAseq；分离远端气道成纤维细胞，证明LGR5表达阳性成纤维细胞的独特生物学功能。建立气液界面培养（Air-Liquid Interface，ALI）的呼吸道研究模型。AT0细胞条件诱导培养实验。人类肺发育不同阶段（19周到20周胎儿和出生后7-12月的婴儿肺组织）远端气道AT0细胞的分化状态。

（3）体内实验：博来霉素诱导的肺损伤食蟹猕猴模型（0天、3周、6周和9周）。

（4）临床样本（验证）：急性肺损伤、肺纤维化和正常患者的肺部气道细胞鉴定。

（5）公共数据：人胎儿肺组织scRNAseq；人类肺组织scRNAseq（Travaglini et al）、人肺纤维化病scRNAseq（GSE135893）、健康人气道scRNAseq（Deprez et al，EGAD00001005714）。

研究结果

1.  人类远端肺组织空间和细胞转录组图谱

研究者首先利用Visium技术对人类新鲜肺组织的小叶支气管（lobar bronchus）和远端气道（包含肺泡）两个区域分别进行空间转录组测序。小叶支气管组织的点阵（spot）无监督聚类后共分为9个类群（cluster），分别为上皮（epithelial）、间充质（mesenchymal）、平滑肌（smooth muscle）、软骨（cartilage）、内皮和神经元细胞谱系（图1a）。对上皮类群作进一步注释，发现上皮cluster3、cluster5和cluster7可分别注释为气道粘膜下腺体、管腔上皮和基底上皮。类似地，远端气道组织聚类后分为7个类群，参考标记基因将各类群分别注释为气道和肺泡上皮、间充质、平滑肌和内皮细胞谱系。

接着，对来自三位患者的远端气道（直径小于1 mm和与肺泡相连区域）进行单细胞转录组测序，最终获得21700细胞，聚类分群后共分为内皮、免疫、上皮和间充质细胞谱系。亚群再细分的结果显示，本次测序能鉴定到肺部大部分经典的内皮（动脉、静脉、淋巴结、支气管血管，aerocyte（肺部特有的用于气体交换和白细胞运输）和gCap（“普通”毛细管，专门用于调节血管舒缩张力））、免疫（经典单核细胞和非经典单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、浆细胞、嗜碱性细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和树突状细胞）和间充质细胞。

图1. 远端气道上皮细胞的空间转录组和单细胞转录组分析

2.  远端气道独特的上皮细胞

基于SFTPB基因表达强弱，将上皮细胞分为2个明显不同的类群，分别为SFTPB-和SFTPB+细胞群。SFTPB-细胞主要高表达的基因有MUC5AC、MSLN和MUC13。SFTPB+细胞主要高表达基因有SFTPB、SFTPA1、SFTPA2、SCGB3A2、RNASE1和NAPSA（图1b）。结合单细胞转录组测序、空间转录组测序和FISH实验证实了SFTPB-细胞群的maker基因在近端气道细胞群集中表达、而SFTPB+细胞群的maker基因普遍表达在远端气道细胞群。使用免疫荧光检测肺组织的SCGB3A2、SCGB1A1、MUC5AC、MUC5B和SFTPB的表达，进一步确认SFTPB+细胞亚群marker在远端肺泡特异表达。SFTPB-和SFTPB+两个细胞亚群的marker可以将气道分为四个明显组织学区域（Zone1-Zone4），SFTPB+细胞亚群中有一些位于TRBs，但以往研究未发现的细胞类型。

研究者发现在肺气道中存在四种独特的上皮细胞，它们均表达基因SFTPB，但基因SCGB1A1、FOXJ1、SCGB3A2和SFTPC却不尽相同（图2c）。第一类上皮细胞名为TRB-SC（TRB-secretory），它们表达SFTPB和SCGB3A2，但不表达TRB特异的基因SCGB1A1、FOXJ1和SFTPC。第二类上皮细胞名为SFTPB+SCGB3A2+SCGB1A1+细胞（又称为pre-TB-SCs），它们位于靠近末端细支气管的远端气道，不表达基因MUC5AC和MUC5B。第三类上皮细胞名为AT0s细胞，以 SFTPB、SCGB3A2和SFTPC基因作为markers，主要位于肺泡间隔与气道细支气管相邻区域，但在肺泡囊很少发现。这一细胞类群同时表达肺泡特征基因（SFTPC和AGER）和气道上皮细胞（SCGB3A2和SOX2）。进一步转录因子分析，发现该细胞群激活的转录因子与AT2细胞特征转录因子存在交集（ZNF385B、TFCP2L1和ETV1）。第四类上皮细胞为分泌-纤毛杂交型细胞类群（名为SCGB3A2-CCs），它们高表达SCGB3A2、SFTPB和FOXJ1。这类杂交型细胞与分化纤毛细胞或次胞质体（ciliated or deuterosomal cell）有明显的区别，不表达CDC208和NEK2基因。对特征基因进行免疫荧光染色发现它们主要位于zone3和zone4。

进一步发现了四种基底细胞类群（图2d），第一种为SFTPB-KRT5+基底细胞（basal cells，BC）高表达TP63、KRT5、KRT17和IL33基因，与先前已知的气道基底细胞相似。第二种细胞类群TP63表达相对较低，但分泌细胞相关marker基因，例如LTF、SCGB1A1和SOX21表达较高，是一种正在分化的基底细胞。其他两种基底细胞均表达SFTPB和TP63，但其中一种是distal-BC-1，它的KRT5、AQP5、KRT15和IL33基因表达较低，而另一种是distal-BC-2，它的SLC34A2、BST2、RNASE1、NKX2-1和MUC1基因表达较高（图2e-f）。

体外类器官和气液界面培养实验表明远端和近端气道上皮细胞（基底细胞）具有明显不同的表型。远端气道的基底细胞表达SFTPB和RNASE1，但低表达KRT5。近端和远端基底细胞均可在原位转化为管腔分化细胞，但近端基底细胞形成的纤毛显著长于远端细胞。

图2. 上皮细胞亚群细分和组织定位

3.  LGR5基因表达可以区分间充质壁龛（生态位）

成纤维细胞是肺间充质含量最多的组成细胞，它们可以通过分泌各种信号作用于邻近细胞。研究者利用先前已发表的人肺组织参考单细胞数据对成纤维细胞进行注释，共发现7种先前已鉴定的细胞类型和1种新型细胞（图3a）。7种细胞类型分别是肺泡成纤维细胞（alveolar fibroblasts），外膜成纤维细胞（adventitial fibroblasts）、肌成纤维细胞（myofibroblasts）、纤维肌细胞（fibromyocytes）、周细胞（pericytes）、血管和气道平滑肌细胞。新发现的成纤维细胞名为LGR5+细胞，这类细胞高表达LGR5、F13A1、PDGFRA、WNT5A、RSP01、DLL1、TGFBI和DIO2。空间转录组数据显示LG5+成纤维细胞位于气道周围，而不是肺泡区域，并且高表达FGF14基因。进一步使用RNA-FISH实验表明LGR5+成纤维细胞位于气道亚上皮间充质区域（例如TRBs）。通路分析显示这类细胞特异富集的通路包括WNT、PDGF和BDNF和TGFβ。细胞互作分析发现LGR5+成纤维细胞表面表达的配体分子能与distal-BC-1、distal-BC-2和TRB-SCs细胞表面表达的受体分子结合。这些配体受对主要介导FGF、BMP和WNT等信号通路。另一方面，distal-BC-1、distal-BC-2和TRB-SCs表达PDGF配体，相应的受体在LGR5+成纤维细胞表达。这些结果表明LGR5+成纤维细胞在distal-BC-1、distal-BC-2和TRB-SCs之间处于中心通讯生态位。转录因子分析表明这类细胞表达独特的转录调控因子。

接着，为了确定LGR5+成纤维细胞是否驻留在远端气道，起到支持周围基底细胞的作用。研究者基于远端气道的成纤维细胞构建了LGR5-mRFP稳转过表达细胞株。当该细胞株与远端基质细胞单独共培养时，LGR5-mRFP细胞能促进基质细胞的生长和维持分子特性（图3e-g），并且增加AT2s细胞marker的表达（图3h）。上述实验说明LGR5+成纤维细胞聚集形成生态位（niche），为远端气道上皮细胞提供生长所需的微环境。

图3.  LGR5+细胞作为间充质壁龛

4.  不同发育阶段的肺部远端气道细胞

与出生后的肺不同的是，胎儿的肺并不与外界进行气体交互，胚胎和出生后的肺具有两种截然不同的形态，必然存在不同的细胞组成。研究结果发现，19-20周胎儿的肺，同时表达SCGB3A2和SFTPB的类TRB-SCs细胞，而其他的细胞类型，如SCGB3A2-CCs、distal-BC-1、distal-BC-2和SFTPC+SCGB3A2+细胞，均未发现。免疫荧光染色确认了在19-20周的胎儿肺的气道中存在SFTPC+SCGB3A2细胞，并且发现SCGB3A2+分泌细胞一般存在于肺内软骨气道（图4b-e）。

出生后7-12个月的婴儿肺已经存在TRB-SCs（SFTPB+ SCGB3A2+）、distal-BC-1（KRT5+ SFTPB+ TP63+）、distal-BC-2（KRT5- SFTPB+ TP63+）、SCGB3A2-CCs（SFTPB+ SCGB3A2+ FOXJ1+）和ATOs（SFTPC+ SCGB3A2+），与成年人的肺细胞组成相似（图4f-m）。

图4. 不同发育阶段的肺部远端气道细胞

5.  类器官培养反映人AT0细胞动态转化

研究者使用scVelo、Monocle3、PAGA、 scEpath和Slingshot五种拟时序分析软件探究immature AT1、TRB-SC、AT1、AT0和AT2之间的分化关系。同时，利用MuTrans软件构建这些细胞的状态转化动力学特征，并计算熵值用于区分稳定细胞和过渡细胞。分析的结果表明AT2细胞群主要向AT0s细胞分化。AT0s细胞的熵值较高，稳定性差，可分化成TRB-SCs或成熟AT1s细胞（图5a-b）。

利用人AT2细胞来源的肺泡类器官，结合不同诱导条件下成功建立了AT2向AT0转化、以及AT0向AT1或TRB-SC体外培养模型。减少培养液中的EGF或CHIR99201（一种糖原合酶激酶-3活性抑制剂），可诱导AT2转化为AT0，维持该条件持续培养14天后，AT0细胞数量达到峰值。若继续培养到21和28天，TRB-SC的数量将明显增加。这些结果说明AT2向AT0转化后，可进一步分化成TRB-SC（图5e-f）。AT2向AT1分化诱导实验显示AT0s其实一种HTI-56低表达的细胞类群（HTI-56是AT1s表面的标志蛋白）。基于HTI-56分选后的AT0细胞在添加血清后可以分化成AT1s，去掉FGF可向TRB-SCs分化（图5g-k）。

图5. AT0细胞的动态变化

6.  灵长类动物的远端肺组织细胞图谱

与小鼠或大鼠这类哺乳动物不同的是，人类、猴子、雪貂和猪具有更多的呼吸细支气管。为了证实上述远端上皮细胞的存在，研究者对已有的食蟹猕猴（Cynomolgus macaque）单细胞转录组测序数据进行分析（图6a-d）。结果表明，在食蟹猕猴的肺组织能够找到一些与人对应的细胞类型，它们包括TRB-SCs、AT0s、pre-TB-SCs、AT2、AT1、纤毛细胞和分泌细胞。然而，食蟹猕猴肺中并不存在表达SFTRB的AT1s细胞。进一步利用免疫荧光染色确定这些细胞的组织定位，发现食蟹猕猴肺组织中的AT0s的组织定位与人类似，主要位于TRB区域，但少见于远端肺泡囊。为了探究AT0s与肺部损伤的关系，研究利用博来霉素建立了肺损伤恒河猴（Phesus macaque）模型。免疫荧光实验显示较未损伤区域，损伤区域的远端肺泡小囊中存在大量AT0s（图6e-g）。

图6. 猴远端气道肺单细胞转录组测序和恒河猴肺损伤模型

7.  在人肺相关疾病中AT0细胞动态变化

进一步探究AT2s向AT0细胞转化是否发生在肺损伤过程，研究者对来自急性肺损伤和特发性肺纤维化患者的肺组织进行SCGB3A2、SFTPB和SFTPC蛋白的免疫荧光染色（图7h-l）。结果显示，与正常对照相比，损伤的肺泡组织存在大量共表达SFTPC、SCGB3A2和SFTPB基因的细胞。此外，在IPF患者肺组织中检测到类似TRB-SCs的细胞（SCGB3A2+SFTPB+SFTPC-），多见于纤维化程度高区域，但它们并不存在于急性肺损伤患者、正常患者和慢性阻塞性患者的肺组织中。AT0细胞多位于轻度纤维化和正常组织（含有AT2）的过度区域，再者，在肺损伤组织显示AT0增殖增强（ki67蛋白表达高）。总的来说，AT0具有双向分化潜能，并在一定的病理条件向AT1或TRB-SCs转化（图7m）。

图7. AT0细胞与肺损伤疾病

结语

本研究联合空间转录组测序和单细胞转录组测序绘制了一幅较为全面的肺组织远端气道细胞图谱。较先前的图谱相比，本研究有以下几个发现：

（1）远端气道空间转录组测序结果显示存在7个具有不同特征细胞类群（免疫、内皮、AT1和成纤维、平滑肌、巨噬、AT2和气道上皮细胞）。对远端气道组织解离进行单细胞转录组测序，共发现五个细胞类群，包括内皮、间充质、免疫、淋巴和内皮细胞。

（2）支气管气道根据MUC5AC、MUC5B、SCGB1A1、SFTPB、RNASE1和SCGB3A2的蛋白表达可分为4个不同的区域，分别代表近端和远端细胞的分子特征。位于TRB的细胞在气道内离子转运和粘液平衡起到关键作用，结合近端和远端的细胞组成，说明在正常人肺气道中，远端气道细胞可能抑制近端粘液层细胞发育和离子转运。

（3）LGR5+成纤维细胞是间充质细胞间通讯的枢纽细胞，提供远端气道上皮细胞生长所需的微环境。

（4）人正常肺组织中存在一种区别于AT2s和AT1s细胞的中间型细胞，名为AT0s细胞。AT0s细胞通常位于TRBs邻近的肺泡囊。与小鼠气管支肺泡干细胞不同的是，AT0s细胞并不表达经典的细胞marker基因SCGB1A1，但和TRB-SCs、AT2s和AT1s共享一套转录特征。AT0s是AT2s向AT1s转化过程的细胞中间态。在一定条件下，AT2可以分化成AT0s，进一步地AT0s也可以接着分化成TRB-SCs或AT1s。AT0s的形成与肺远端气道的疾病相关，在肺发生损伤时，支气管的AT0s细胞增多。

局限

本研究未深入研究AT2、AT1、TRB-SCs和AT0之间转化的内在分子机制，对于AT0s这类处在中间状态的细胞，未来还需要探究它与邻近其他细胞互作关系，并借助CRISPR-Cas9技术在体水平研究它与疾病的关系。 END 

参考文献： [1] Kadur Lakshminarasimha et al. Human distal lung maps and lineage hierarchies reveal a bipotent progenitor. Nature. 2022 Apr;604（7904）:111-119. doi: 10.1038/s41586-022-04541-3 .  撰写丨Xiaosine 编辑、排版丨SX