副溶血弧菌毒力相关因子及致病机制的研究进展

作者：陈晓,陈瑜

作者单位：浙江大学医学院附属第一医院检验科，浙江 杭州 310003

通讯作者：陈瑜

摘要        

副溶血弧菌已成为全球沿海国家食源性疾病和感染性腹泻的最主要病原菌，主要引起散发或聚集性暴发的急性胃肠炎，在免疫力低下人群可进展为败血症和坏死性筋膜炎，严重者甚至死亡。副溶血弧菌的致病性是多种毒力因子共同作用的结果，本文对副溶血弧菌相关毒力因子的研究现状进行综述。

副溶血弧菌感染包括粘附、侵袭、增殖和释放毒素等过程。这些过程与副溶血弧菌产生的多种毒力相关因子密切相关，包括溶血毒素、分泌系统、粘附因子、摄铁系统、脂多糖和蛋白酶等。

溶血毒素（Helmolysin）  

溶血素是一种能引起红细胞破裂并释放出血红蛋白的外毒素。副溶血弧菌可以产生三种不同的溶血素，分别是耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素(thermostable direct hemolysin-related hemolysin，TRH)和不耐热溶血素(Thermolabile hemolisin，TLH)，分别由tdh、trh和tlh编码。分子流行病学研究显示，大部分临床分离株携带tdh和/或trh，而环境分离株较少携带。TDH和TRH被认为是副溶血弧菌的主要致病因子。

TDH具有溶血、细胞毒性和肠毒性等生物学活性。TDH与红细胞膜上GT1神经节苷脂受体相结合，在磷脂双分子层中形成跨膜孔，细胞膜外的水和离子自由进入红细胞，导致红细胞的膨胀和破裂。高浓度TDH使肠上皮细胞钙离子浓度升高，激活细胞膜上CaCC通道，导致肠细胞内氯离子分泌增加，引起水样泻。跨膜调节蛋白ToxR和ToxS、 转录调节蛋白VtrA和VtrB，可促进TDH的表达。此外，TDH表达受环境因素的影响，如甘露醇、高浓度氯化钠、胆汁酸和氨基酸可以促进TDH 的产生。

TRH 60℃加热10min即可灭活，是一种热不稳定毒素。TRH由trh1和trh2两个基因编码。TRH和TDH的氨基酸序列具有67%的相似度，两者具有相似的生物学活性。TLH 是一种非典型磷脂酶，它只能在卵磷脂存在的情况下发挥溶血作用。

Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system, T3SS）  

T3SS通常以毒力岛（pathogenicity island，PAI）的形式存在于细菌的质粒或染色体。T3SS是由结构蛋白、转运蛋白、效应蛋白和分子伴侣等三十多种蛋白质共同组成的类似于“注射器”的跨膜装置，主要由横跨细菌内和外膜的基体、聚合并延伸到细胞外的针状结构以及激活T3SS活性的顶端结构组成。T3SS能有效将细菌效应蛋白注射到宿主细胞中，操纵细胞的多种信号转导通路，从而破坏宿主细胞正常功能。

副溶血弧菌有2套T3SS，即T3SS1和T3SS2。T3SS1存在于所有副溶血弧菌；其主要功能是引起细胞毒性、影响生物膜的形成和运动性，有助于副溶血性弧菌在环境中的生存。T3SS1表达主要受相互作用的ExsA、ExsC、ExsD和ExsE蛋白组成的级联调节系统调控，其中ExsA是激活T3SS1基因转录的主要调控因子。跨膜调节蛋白ToxR和调节因子CalR协同负向调控 T3SS1部分基因的表达。改变外界环境，如合适的培养温度（30 °C）、提高Mg 2+浓度和降低Ca 2+浓度，可以促进T3SS1表达]。宿主产生的亚硝酸盐通过半胱氨酸86位点的 S-亚硝基化激活组氨酸激酶传感器 VbrK，抑制其正调节子exsC，导致T3SS1 操纵子的下调。

目前，T3SS1已鉴定四种效应蛋白，分别为VopQ、VopS、VPA0450和VopＲ。VopQ是T3SS1介导对真核细胞发挥毒性最重要的蛋白。研究表明，VopQ 能与溶酶体膜上的V-ATPase 结合，改变溶酶体中的质子浓度，促进溶酶体裂解和自噬囊泡形成，导致宿主细胞自噬和细胞毒性。VopS的活性主要依赖于C端的Fic结构域，可介导Rho GTP 酶（RhoA、Rac1和Cdc42）的腺苷酸化，导致其无法与下游底物结合，阻断肌动蛋白细胞骨架的信号级联，导致细胞骨架塌陷和细胞变圆。VPA0450是一种肌醇磷酸酶，能水解质膜上4,5-二磷酸磷脂酰肌醇的磷酸基团，破坏肌动蛋白细胞骨架和质膜之间的连接，导致质膜内气泡的形成、细胞的变圆和溶解。VopR通过N 端磷酸肌醇结构域与宿主细胞膜上的磷酸肌醇结合，可促进其它T3SS 效应蛋白进入宿主细胞后的正确折叠。

T3SS2进化为2个分枝，即T3SS2α和T3SS2β；其功能是参与细菌的定植及细胞炎症的负调控反应，有利于宿主体内病原菌的免疫逃避过程。T3SS2 的表达受VtrA-VtrB调节级联反应的调控。VtrA 通过与其上游区域结合正向调节vtrB 转录，而VtrB可激活T3SS2基因的转录表达。ToxR在 T3SS2 基因表达的调节中也发挥作用。

目前已发现T3SS2的8个效应蛋白，包括VopA、VopT、VopZ、VopC、VopL、VopO、VopV和 VPA1380。VopA、VopT和 VopZ 通过抑制 MAPKs 信号通路的不同成分来抑制免疫反应。VopC、VopL、VopV和VopO直接或间接的以肌动蛋白细胞骨架为作用靶点。VopA是一种乙酰基转移酶，通过乙酰化修饰MAPK 激酶催化环中的丝氨酸/苏氨酸或赖氨酸残基，阻断磷酸化位点或影响 ATP 与磷酸化位点结合，切断激酶的磷酸化，从而抑制 MAPKs 信号传导。新近研究发现VopA蛋白可以抑制肠上皮细胞的正常迁移和凋亡，增强副溶血性弧菌对肠上皮细胞的粘附。VopT能够 ADP 核糖基化修饰低分子量 G 蛋白Ras，从而调控 MAPKs信号途径。VopZ是副溶血弧菌肠道致病所必需的效应蛋白，它抑制TGF-β活化激酶 1 (TAK1) 的激活，进而抑制下游MAPKs 和 NF-κB 信号通路。VopC 含有具有脱酰胺酶/转谷氨酰胺酶活性的催化结构域。通过脱酰胺作用，激活 Rac1和Cdc42，导致肌动蛋白细胞骨架的变化，从而促进副溶血弧菌入侵到非吞噬的宿主细胞。VopL是肌动蛋白成核剂，通过N-端3个 Wiskott-Aldrich 同源区 2 结构域和独特的C-端结构域使肌动蛋白丝成核。VopL 还可以中和宿主细胞中由烟酰胺二核苷酸磷酸 (NADPH) 氧化酶复合物产生的活性氧 (ROS)，以促进细菌在宿主细胞中的存活。VopO与ras 同源基因家族成员A (RhoA) 的鸟嘌呤核苷酸交换因子 H1 (GEF-H1) 结合，GEF-H1从微管中解离，激活下游 RhoA- Rho 相关激酶 (ROCK) 通路，导致肌动蛋白应力纤维的形成，从而破坏肠上皮屏障。VopV是一个关键的效应蛋白，通过其C-端结构域和长重复序列，与F-肌动蛋白和和细丝蛋白结合，导致F肌动蛋白的堆积，从而引起肠毒性。VPA1380在酵母中表达时需要肌醇磷酸己糖 (IP6) 作为激活剂来介导细胞毒性。

Ⅵ型分泌系统（Type 6 secretion system, T6SS）  

T6SS在结构和功能上与T3SS相似，主要通过针尖样分泌装置将细菌效应蛋白注射入宿主细胞而发挥生物学效应。副溶血弧菌含有两套T6SS，即T6SS1和T6SS2。T6SS1主要存在于临床分离株，具有细胞粘附和抑菌活性，与环境适应性相关；T6SS2存在于所有副溶血弧菌中，具有细胞粘附活性，可能与细菌毒力相关。T6SS相关基因的转录受群体感应 (quorum sensing，QS) 系统的调节。OpaR 和 AphA 是 QS 的核心调节因子。低密度时，AphA激活，从而抑制T6SS1和 T6SS2相关基因的转录；高密度时，OpaR激活，抑制 T6SS1的转录，但能正调节 T6SS2相关基因的表达。

粘附因子（Adhesion factors）  

病原菌粘附是感染的首要条件。副溶血弧菌与粘附相关的主要因子有血凝素、烯醇化酶、MAM-7和T6SS2等。甘露糖敏感血凝素（Mannose-sensitive hemagglutinin，MSHA）对多糖（如唾液酸和GM1神经节苷脂）具有高亲和力，促进副溶血弧菌在肠上皮细胞的定植。烯醇化酶可以促进细菌对 Hep-2 细胞的粘附。粘附因子MAM-7可以与宿主细胞膜上的纤连蛋白和膜磷脂酸结合组装成三分子聚合物介导细菌的粘附，抑制 MAM-7 表达可以降低副溶血性弧菌的粘附性和毒力。CalR可以通过调节 T6SS2 的表达来调节副溶血性弧菌的粘附。

铁摄取系统（Iron uptake system）  

高钙和低铁生长条件刺激细菌群体行为和 T3SS 转录。弧菌铁蛋白是由副溶血弧菌产生的一种能够螯合铁离子形成铁-铁载体复合物的蛋白，该复合物能够与病原菌细胞外膜的铁载体受体PvuA1和PvuA2结合，再与内膜的ABC -PvuBCDE转运系统结合，将铁-弧菌素转运至胞内，进行铁同化。TonB系统在整个铁转运过程中提供能量。副溶血性弧菌可分泌一种铁还原蛋白，将铁离子还原为二价铁；还可以通过分泌蛋白酶来降解血红蛋白，从人体中获取铁。此外，一些外膜蛋白受体（如肠杆菌素受体VctA、IrgA，血红素受体HutA、HutR）对铁的获取很重要。

蛋白酶、脂多糖等其它毒力因子  

Lee等人从tdh- trh- 副溶血性弧菌临床分离株中获得了一种蛋白酶 A，该蛋白对细胞有明显的毒性作用，对红细胞有裂解活性，还可导致组织溶血。副溶血性弧菌脂多糖对鼠腹膜巨噬细胞有影响，增加脂多糖剂量，腹腔巨噬细胞的 RNA 含量和溶酶体活性显著增加。

小结与展望  

副溶血性弧菌的致病性是多种毒力因子共同作用的结果，需要综合考虑各种毒力因子的相互作用和调控网络。此外，临床工作中时常分离到不携带已知毒力因子的副溶血弧菌，提示有可能存在着新的毒力因子，值得进一步研究。

-End-

题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

原文以《副溶血弧菌毒力相关因子及致病机制的研究进展》为题发表在《临床实验室》杂志2022年10月刊专题“临床微生物检验”-「专家论坛」版块

版权归《临床实验室》杂志所有，未经允许，禁止随意转载！