重磅科研丨CELL: 粘膜真菌通过17型免疫促进肠道屏障功能和社会行为

编译：微科盟Moon，编辑：微科盟居居、江舜尧。

导读  

真菌群落(真菌区系)是肠道微生物群的组成部分，其完整性的破坏会导致局部和远端的肠道病症。然而，肠道真菌促进机体平衡的机制仍不清楚。本研究对胃肠道的真菌群落生物地理特征进行了表征，并确定了与小鼠和人类肠粘膜相关的真菌亚群。粘膜相关真菌(MAF)增强了肠道上皮功能，保护小鼠免受肠道损伤和细菌感染。值得注意的是，用MAF菌群进行肠道定殖促进了小鼠的社会行为。肠道局部对屏障功能的影响依赖于CD4+T细胞产生的IL-22，而对社会行为的影响则通过神经元中的IL-17R依赖性信号传导来介导。因此，肠道真菌群落的空间分布与宿主保护性免疫和上皮屏障功能相关，可能是通过互补的17型免疫机制对小鼠行为进行神经免疫调节的驱动因素。

图文摘要  

论文ID

原名：Mucosal fungi promote gut barrier function and social behavior via Type 17 immunity

译名：粘膜真菌通过17型免疫促进肠道屏障功能和社会行为

期刊：Cell

IF：66.85

发表时间：2022.2

通讯作者：Iliyan D. Iliev

通讯作者单位：美国康奈尔大学威尔康奈尔医学院

DOI号：10.1016/j.cell.2022.01.017

实验设计

结果

不同GI部位有特定的细菌群落，并沿着消化道的长度有很强的组成差异。通过粪便成分并不能完全掌握肠道微生物群的复杂性，因为粪便微生物只代表了整个消化道内一部分微生物群。为了探索胃肠道真菌微生物群的生物地理分布特征，我们从C57BL/6小鼠的胃、空肠、回肠、盲肠和结肠等多个GI区域收集LUM和黏膜样本，并进行真菌核糖体DNA(rDNA)ITS测序(图1A)。真菌群落的非度量多维尺度分析显示，基于LUM与粘膜取样部位的聚集性较强，而非纵向位置(图1B)。进一步分析显示，无论纵向采样位置如何，LUM真菌菌群的多样性都很高，而粘膜相关真菌群落的多样性明显较低(图1C)。由于大肠承载着最高的真菌负荷，我们将进一步的分析集中在这个部位。对大肠粘膜样本与LUM的差异丰度分析表明，有几个真菌属似乎优先与任一位置相关(图1D)。管腔相关真菌群(LUM)包括可能属于瞬时环境生物的真菌属，如Cladosporium和曲霉属(Aspergillus)，而在粘膜富集的操作分类单元(OTU)属于几个“免疫活性”真菌属，如念珠菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)和复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)(图1D)。在人类受试者中也观察到类似的真菌菌群组成，其中念珠菌属和酵母菌属是与手术肠粘膜标本有关的优势属(图1E和1F；表S1)。不同群落的存在，加上在粘膜真菌菌群中观察到的α多样性降低，表明只有一部分专门的真菌可以在肠粘膜的独特环境中生存。

图1 一种与小鼠肠道粘膜相关的独特真菌群落。(A)从5只雌性C57Bl/6J小鼠的胃、空肠、回肠、盲肠和结肠采集管腔和粘膜样本，进行DNA提取和ITS测序。小鼠肠道中丰度最高的14个真菌属的相对丰度。(B)采样部位真菌群落结构的非度量多维尺度分析图。(C) Shannon多样性指数代表采样位置真菌群落在OTU水平上的α多样性；填充圆：腔内菌群(L)；空心圆：粘膜相关菌群(M)。平均值±SEM，圆点代表单个样本。(D)管腔内菌群和粘膜相关菌群之间差异丰度OTUs。点代表FDR<0.01且丰度>1%的单个OTU。(E、F)人类粘膜相关真菌菌群的特征。平均值±SEM，点代表单个受试者。(E) 主要真菌门的相对丰度。(F) 单个样本(左)和7个个体(右)的肠粘膜中主要真菌属的相对丰度。(G)在DSS治疗前10天，每隔一天给小鼠定殖管腔真菌(LUM)或粘膜真菌(MUC)。对照组在相同的时间点灌胃PBS。每天评估小鼠体重和有无隐血。将无菌3% DSS与抗生素鸡尾酒一起给小鼠注射5天，然后注射ABX恢复7天。在第12天，给小鼠注射DSS+ABX，直到实验终点。(H) PBS组和LUM定殖组服用DSS第一天后的存活率(左)。PBS组和MUC组服用DSS第一天后的存活率(右)。(I)在SPF小鼠灌胃LUM或MUC菌群后，通过定量FITC-葡聚糖血清水平来测定肠道通透性。平均值±SEM，点代表单个小鼠，Mann-Whitney检验* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

细菌菌株与肠道上皮的密切关系与它们诱导特定免疫反应的能力有关。为了评估LUM和MAF是否具有免疫保护潜力，我们使用了一种抗生素诱导的生态扰动模型，加上葡聚糖硫酸钠(DSS)介导的长期损伤，以研究特定的微生物群成员如何影响屏障功能。基于我们对小鼠和人类的LUM和MAF的分析，我们构建了两个模拟菌群，每个生态位由三个代表性真菌物种组成：粘膜相关真菌(MUC)由白色念珠菌(Candida albicans)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和Saccharomycopsis fibuligera组成；LUM由Aspergillus amstellodamii、Cladosporium cladosporioides和Wallemia sebi组成(图1D)。为了评估我们的模拟菌群是否对疾病的发展有明显的影响，我们在DSS给药前用LUM或MUC定殖抗生素处理小鼠3周(图1G)。这些实验表明，粘膜真菌菌群定殖可以保护小鼠免受肠道损伤，并降低死亡率。相比之下，在这个模型中，LUM真菌菌群的定殖并没有保护效果(图1G和1H)。

肠道上皮细胞构成了肠道内微生物群和粘膜免疫系统之间的第一道细胞屏障。因此，我们分析了MAF菌群对肠道上皮细胞(IECs)的影响。为了最大限度地减少偏倚和预先存在的肠道菌群的混杂影响，我们用粘膜真菌菌群对无真菌的ASF小鼠进行定殖，并对结肠上皮细胞(IEC；图2A、2B和S1A)进行了转录组分析。用MUC菌群进行肠道定殖，在IECs中诱发了独特的转录谱，参与免疫反应和细胞增殖的基因发生了上调(图2B)。具体而言，参与氧化磷酸化、IFN反应、JAK/STAT信号传导和DNA修复的基因上调，而参与TGFβ信号传导、蛋白质分泌和G2M细胞周期检查点的基因下调(图2B)。基于这些数据，我们进一步评估了MUC和LUM菌群定殖后的肠道屏障功能。两种菌群定殖的SPF小鼠的屏障通透性显示，与LUM定殖相比，MUC定殖后的肠道通透性显著降低(图1I)，这与后者在我们的肠道损伤模型中不提供保护的发现一致(图1H)。

图2 确定的粘膜真菌菌群保障屏障完整性并诱导CD4+ T细胞产生IL-22。(A和B)ASF小鼠每隔4天定殖粘膜真菌(MUC)，持续10天。对结肠上皮细胞进行单读长RNA-seq分析(每组4只小鼠；见图S1A；表S2)。(A)定殖MUC的ASF小鼠和未经处理的ASF对照组上皮细胞的RNA-seq火山图。红点代表FDR<0.1的基因。(B)MUC和ASF RNA-seq结果的基因集富集分析(GSEA)。(C-I)雄性和雌性SPF C57Bl/6J小鼠用抗生素处理后，分别用管腔真菌(LUM)或粘膜真菌(MUC)定殖10天。(C)骨髓细胞群和结肠固有层(cLP)的量化。(D-I) cLP中淋巴细胞群的代表性图片和特征。(D) cLP中3型固有淋巴细胞(ILC3)的频率。(E) cLP中CD45+造血区中辅助性T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)和γδT细胞(γδT)的量化。(F) cLP中Th细胞亚群的量化和代表性流式细胞图。(G) cLP中辅助性T细胞产生的IL-17A和IL-17F的量化和流式细胞代表性图。(H) cLP中辅助性T细胞产生的IL-22的量化和代表性流式细胞图。(I) cLP中辅助性T细胞产生的IFNγ的量化和代表性流式细胞图。C-I的实验至少重复三次，每组n>4。Mann-Whitney检验* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

肠道上皮细胞与下层肠道粘膜免疫细胞持续相互作用。肠道吞噬细胞、先天淋巴细胞(ILCs)和T细胞的不同亚群在保护和维持肠道屏障方面发挥着重要作用。由于真菌可以诱发强烈的免疫反应，我们假设MUC菌群的保护功能可能是通过免疫系统介导的。用两种真菌菌群定殖的小鼠的免疫分型显示，髓系、ILCs、FoxP3+调节性T细胞(Tregs)、T-bet+辅助性T(Th1)细胞和细胞毒性T细胞的组成没有差异(图2C-2F)。相比之下，我们观察到MUC小鼠结肠固有层(cLP)和肠系膜淋巴结(mLNs)中的RORγt+ 17型辅助性T细胞(Th17)的数目明显增加(图2F，2G，3B和S2A)。MUC定殖小鼠的Th细胞产生高水平的效应细胞因子IL-22、IL-17A和IL-17F(图2G、2H、3A-3D、S2B-S2D和S3)。MUC定殖的ASF小鼠重现了在抗生素处理小鼠中观察到的表型，表明MUC诱导的17型反应不依赖于抗生素诱导的生态失调(图S4A-S4C)。当单独评估时，MUC菌群中的两个成员(白色念珠菌和酿酒酵母)诱导结肠Th17细胞的数目增加。然而，MUC菌群的复合效应似乎更强(图S3A和S3B)。

鉴于这些数据以及IL-22和IL-17在维持肠道屏障功能中的已知作用，我们接下来评估IL-17A和/或IL-22是否介导了MUC菌群的保护作用。我们在有或没有MUC定殖的情况下，在IL-17A(Il17a-/-)和IL-22(Il22-/-)缺陷小鼠中诱发肠道损伤。正如预期所示，Il17a-/-小鼠更容易受到肠道损伤的影响。在这些小鼠中，MUC定殖导致存活率略有提高(图S4D和S4E)。相比之下，IL-22的缺失导致MUC菌群对生存和屏障功能的保护作用消失(图3F和3G)。3型先天淋巴细胞(ILC3)是结肠中IL-22的主要来源，但它们的数量和IL-17和IL-22的产生不受MUC定殖的影响(图2E、3E和S3D-S3F)。在确定CD4+ T细胞是MUC诱导的IL-22的主要来源后，我们接下来分析产生IL-22的CD4+ T细胞是否足以发挥MUC菌群的保护作用。为了具体探讨Th细胞产生IL-22的作用，在诱导肠道损伤之前，用来自Il22+/-(能产生IL-22)或Il22-/-小鼠的CD4+ T细胞过继转移T和B细胞缺陷型Rag1-/-小鼠(图3H)。值得注意的是，与采用IL-22缺陷的CD4+ T细胞转移的小鼠相比，Il22+/- CD4+ T细胞的转移明显延长了MUC定殖的Rag1-/-小鼠的生存期(图3H-3J)，表明T细胞作为IL-22来源在MAF定殖反应中的关键作用。

图3 粘膜相关真菌菌群的保护作用由CD4+ T细胞产生的IL-22介导。(A) CD45+细胞中CD3+ CD4+T细胞的频率。(B) 代表性流式细胞图和表达RORγ+的Th17细胞的定量。(C) 结肠固有层(cLP)的CD3+ CD4+ T细胞中IL-17A+和IL-22+的表达。(D) 表达IL-22和IL-17的CD4+T细胞的代表性流式细胞图，以及表达IL-17和IL-22的CD45+细胞中T细胞的频率。(E)表达IL-17和IL-22的CD45+细胞中ILC3s的频率。(F-J)Il22-/-小鼠在DSS治疗前每3天用粘膜真菌(MUC)定殖10天。对照组在相同的时间点灌胃PBS。用无菌3% DSS与抗生素鸡尾酒一起给小鼠注射5天，随后用ABX恢复7天。在第12天，小鼠被施以DSS+ABX，直到实验终点。(F) PBS组和MUC定殖组在DSS给药第一天后的存活率。(G) 灌胃后通过量化FITC-葡聚糖血清水平测定肠道通透性。(H)Rag1-/-小鼠定殖粘膜真菌(MUC)，每3天灌服一次PBS，持续10天，然后在DSS+ABX给药前一天转移来自Il22-/-或Il22+/-小鼠的4×106个CD4+ T细胞。(I) 存活率百分比。(J) Rag-/-小鼠体重变化的百分比。点代表单个小鼠，平均值±SEM。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

接下来，我们分析了MUC菌群是否会在肠道附着和清除(A/E)病原体感染期间提供保护作用。A/E细菌柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)附着在结肠IEC上引起粘膜增生和消耗性疾病。与其对肠道上皮的保护作用相一致，MUC菌群定殖降低了抗生素处理小鼠肠道内柠檬酸杆菌感染的严重程度和病原体负荷(图4A-4G)。为了确定这种保护作用是否由IL-22介导，我们接下来在有或没有MUC的情况下感染IL-22缺陷小鼠。因为IL22-/-小鼠对柠檬酸杆菌高度敏感，所以在没有抗生素处理的情况下进行定殖(图4H)。MUC菌群没有给IL22-/-小鼠带来任何好处，反而加重了疾病的严重性(图4I和4J)，并导致柠檬酸杆菌定殖增加(图4K)。这些数据表明，传染性结肠炎中MUC菌群的保护作用与IL-22相关，而不是由于与柠檬酸杆菌直接竞争。

图4 粘膜相关真菌菌群对柠檬酸杆菌诱导的结肠炎具有保护作用。(A) C57BL/6J小鼠每3天定殖真菌菌群(MUC)或给药PBS，持续2周。在接种109柠檬酸杆菌之前，给小鼠注射抗生素鸡尾酒或不处理(NT)3天。小鼠在柠檬酸杆菌感染后第8天处死。(B) 感染柠檬酸杆菌后的体重变化。#：2只PBS小鼠达到人道终点，不得不在第6天处死。(C) 第8天结肠的代表性组织学H&E切片。(D) 结肠固有层(cLP)中CD11b+ Gr-1+中性粒细胞浸润的代表性流式细胞图和量化(以CD45+淋巴细胞的百分比表示)。(E) cLP中CD4+ T细胞浸润的量化。(F) 肠系膜淋巴结(mLNs)中IFNγ+ CD4+ T细胞的代表性流式细胞图和量化(以CD45+淋巴细胞的百分比表示)。(G) 感染后第7天，粪便中的柠檬酸杆菌菌落形成单位(cfu/g)。Il22-/-或对照组(WT)在接种109柠檬酸杆菌之前，每3天用真菌群(MUC)定殖一次，或用PBS给药2周。(H)WT和Il22-/-小鼠在接种109鼠柠檬酸杆菌之前，每3天定殖MUC或给药PBS，持续2周。(I)体重下降。(J)存活率。(K)定殖真菌菌群(MUC)或用PBS喂养的对照小鼠的柠檬酸杆菌定殖率。点代表单个小鼠，平均值±SEM。实验重复两次，每组n = 6-10。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

最近有研究表明，在与人类行为变化相关的神经精神疾病患者中，肠道真菌群落的组成会发生改变。细菌的行为调节作用已在小鼠身上得到证实。特别是，抗生素治疗对肠道细菌群落的破坏可导致啮齿动物的行为变化。因此，我们使用了一个抗生素诱导的细菌失调模型，研究了用MUC菌群定殖的小鼠以及年龄和性别匹配的未治疗对照小鼠的社会和重复行为。MUC定殖并不影响重复、焦虑和强迫相关行为(图S5)。当进行三室社交试验时，MUC菌群定殖小鼠表现出更多的社交偏好，在有社会刺激的区室中花费的时间明显增多，而在空室中花费的时间较少(图5A-5E)。此外，如直接互动指数所示，MUC定殖小鼠与社会刺激的互动时间更长(图5F)。这些结果表明，MAF可以促进社会行为，但不会促进焦虑相关行为或重复行为。接下来，我们想知道这些变化是否可能是由抗生素介导的细菌群落消耗后的肠道真菌的补偿效应驱动。重要的是，在存在稳定的细菌群落(ASF细菌菌群)的情况下，MUC定殖促进了社会行为，这表明在没有抗生素诱导的细菌失调的情况下，可以观察到这种效应(图5G-5J)。

图5 粘膜真菌菌群促进小鼠在三室社交试验中的社会行为。(A)3周龄雄性C57Bl/6J小鼠注射抗生素鸡尾酒，每4天定殖真菌菌群(MUC)或灌服PBS，直到8周龄。使用三室社交试验设置对小鼠进行测试。允许小鼠在空的三室场中探索10分钟(习惯阶段)。然后，允许小鼠接近关在场地一侧的笼子(S)或场地另一侧的空笼子(NS)中的年龄和性别匹配的个体(社交阶段)。(B)PBS和MUC组的单个代表小鼠在习惯阶段(左)和社交阶段(右)的位置热图。(C) 习惯阶段在非社交室(NS)、中心室(C)和社交室(S)中花费的累计时间。(D) 社交阶段在非社交室(NS)、中心室(C)和社交室(S)中花费的累计时间。(E)社交阶段的社交偏好指数根据在社交室(S)和非社交室(NS)花费的时间计算，即(S-NS)/(S+NS)。(F) 社交阶段的直接互动指数。所示数据为平均值，点代表单个小鼠，每组10只小鼠。(G-J) ASF定殖的小鼠(雄性和雌性)再定殖真菌菌群(ASF-MUC)或给予PBS(ASF-PBS)，并接受上述的三室社交试验。结果来自两个独立的实验，每组n>10。(G) ASF-PBS和ASF-MUC组的单个代表小鼠在社交阶段的位置热图。(H) 习惯阶段在非社交室(NS)、中心室(C)和社交室(S)中花费的累计时间。(I)在非社交室(NS)、中心室(C)中花费的累计时间。(J)社交阶段的社交偏好指数如上所述计算。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

越来越多的证据表明，神经系统和免疫系统之间的相互作用在社会行为的发展中起着关键作用。由于各种细胞因子在中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)中具有直接的神经调节作用，我们推断，在抗生素治疗和ASF小鼠中观察到的MUC诱导的IL-22和/或IL-17的产生可能是观察到的行为变化的一个重要驱动因素。尽管MUC在肠道中诱导的17型细胞因子增加，但只有IL-17A在MUC定殖小鼠的血清和脾脏中系统地增加(图6A和S6A)。通过分析以前发表的单细胞转录组数据，我们证实了肠道和CNS神经细胞都表达高水平的IL-17受体基因Il17ra，而非IL-22受体基因Il22ra1和Il22ra2(图6B；表S3)。正如预期的那样，Il22缺失并不影响MUC菌群增加社会行为的能力(图6C-6E)。

IL-17A已被证明具有直接的神经调节特性并影响小鼠的社会行为。为了研究神经元对IL-17A的直接感应是否影响观察到的行为表型，我们将泛神经元BAF53b-Cre小鼠与Il17rafl/fl小鼠杂交，特异性中断了神经元中的IL-17信号传导(Baf53bΔIl17ra)。在抗生素诱导菌群失调后，MUC定殖的Baf53bΔIl17ra小鼠与未处理的Baf53bΔIl17ra对照小鼠相比，行走距离、移动性和焦虑相关行为方面没有明显差异(图S6C和S6D)。正如预期所示，MUC定殖促进了具有IL-17受体的cre-/-同窝小鼠的社会行为(Litt，图6F-6H)。相比之下，Baf53bΔIl17ra的社会行为并没有在MUC定殖后增强，且与MUC定殖的cre-同窝小鼠相比明显减少(图6F-6H)。此外，MUC定殖并没有增加Baf53bΔIl17ra小鼠与年龄和性别匹配的测试小鼠的直接互动(图S6E和S6F)。综上，我们的结果表明，肠粘膜的真菌定殖通过IL-17A对神经元的直接作用促进了小鼠的社会行为。

图6 神经元上的IL-17Ra信号传导介导MUC诱导的社交行为增加。(A)抗生素鸡尾酒处理小鼠或无菌小鼠(GF)进行MUC菌群定殖(MUC)或不处理(NT)。测量血清中细胞因子的循环水平。所示数据为平均值+/-SEM；圆点代表单个小鼠。(B) IL-22受体基因Il22ra1和Il22ra2以及IL-17A受体基因Il17ra在先前发表的小鼠成年CNS和PNS的单细胞转录组测序数据集中的表达模式。(C-E)用抗生素处理雄性和雌性Il22-/-小鼠，用粘膜真菌菌群定殖(MUC)或给药PBS(NT)，并接受三室社交任务。(C) 每组小鼠在社交阶段的代表性位置热图。(D) NT或MUC在非社交室(NS)、中心室(C)和社交室(S)中花费的累计时间。(E)社会阶段的社交偏好指数。(F-H) BAF53bCre/+小鼠与Il17rafl/fl小鼠杂交，选择性中断IL-17Ra在神经元上的信号传递(Baf53bΔIl17ra)，并将同窝小鼠作为对照(Litt)。实验中使用了雄性和雌性小鼠。小鼠用抗生素处理，定殖或不定殖(NT)真菌菌群(MUC)。(F)每组小鼠在社交阶段的代表性位置热图。(G) 在社交阶段，在各区室中花费的总时间。(H)在开放区域试验室的中心或边界花费的时间百分比。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。

讨论

肠道微生物群与其宿主之间的密切相互作用对于维持哺乳动物的健康至关重要。越来越多人认为肠道真菌是肠道微生物群的一个关键组成部分，可以影响宿主的免疫反应。然而，尽管有数据表明，真菌是宿主免疫复合物多样化的重要参与者，也是平衡肠道生态系统的关键组成部分，但人们对肠道原生真菌群落在平衡中的作用关注甚少。与细菌相似，真菌定殖与选择真菌的结果可能不仅取决于定殖物种的特征，还取决于它们与宿主发生作用的特定位置。利用真菌rDNA ITS区的下一代测序，我们分析了肠道菌群的生物地理分布特征，并揭示了特定位点的肠道真菌群落。我们确定了一个与肠道粘膜密切相关的真菌属集合。在人类和小鼠中，这些MAF包括念珠菌和酵母菌等属，先前已有研究证明这些真菌属能调节宿主免疫。相比之下，我们确定的许多管腔相关菌属可能不代表真正的肠道定殖者，而可能是瞬时环境真菌，缺乏粘附粘膜或与肠道上皮相互作用的能力。

通过构建一个可以在肠道粘膜上定殖的确定真菌菌群，并将其免疫调节特性与LUM真菌菌群进行比较，我们证明这些MAF促进了肠道屏障功能，并在抗生素治疗和细菌感染时保护小鼠免受肠道损伤。特别是，我们发现MAF促进了一种独特的免疫反应，降低了肠道通透性，增加了小鼠的社会行为。

已有研究证明Th细胞在真菌感染和定殖过程中发挥着不同的作用。我们发现，CD4+ T细胞受刺激产生大量IL-22和IL-17A，并介导了肠道粘膜真菌对哺乳动物宿主的影响。

复杂的基因-环境相互作用是自闭症谱系障碍(ASD)的病因之一。虽然肠道细菌与神经系统疾病的发展有关，并且已知会影响小鼠的行为，但关于真菌生物群参与的关键问题才刚刚开始研究。我们表明，在细菌群落存在和不存在的情况下，MAF都能促进小鼠的社会行为，这表明真菌在肠-脑轴上有直接作用。尽管之前多位研究者的工作和我们的研究表明，肠道微生物可以调节小鼠的行为，但肠道微生物群在ASD和其他神经系统表现中的功能作用仍存在争议。更深入地了解微生物介导的行为调节机制可能有助于阐明它们在这种和其他疾病发展中的作用。细胞因子异常在ASD中很常见，可能在调节神经功能方面发挥作用。细胞因子已被证明通过在神经细胞和免疫细胞中表达的受体来调节神经-免疫相互作用。在这项研究中，我们发现，MAF诱导独特的局部和全身细胞因子特征。特别是，粘膜真菌增加了IL-17A在肠道和系统循环中的水平。IL-17A拥有直接的神经调节特性。在小鼠中，IL-17A已被证明可作用于体感皮层的神经元并促进社会行为。通过特异性去除神经元上的IL-17RA，我们已经证明IL-17信号是真菌沿肠-脑轴作用的一个重要媒介。本研究表明，真菌诱导的IL-17A的直接神经调节作用介导了小鼠社会行为的增加。

综上所述，本研究结果表明，肠道生态位内的真菌生物群的空间组织是驱动保护性粘膜免疫的关键因素。这种相互作用对肠道上皮细胞、神经元、屏障功能、肠道疾病和宿主行为产生重要的局部和系统影响。

本研究的局限性

尽管本研究表明，MAF可以调节宿主对肠道疾病的易感性及其行为，但仍有一些悬而未决的问题。

1. 最近的研究强调了肠道真菌免疫调节特性的明显菌株特异性差异。本研究中描述的实验是用有限的真菌菌株进行的，因此不能外推到每个物种的每个成员。需要进一步的研究来阐明单个菌株的功能效应。

2. 神经回路受可塑性增强的敏感时间窗口的影响。在本研究的行为实验中，小鼠在断奶后(3周龄)立即被真菌定殖。本研究并没有确定真菌对小鼠行为影响的关键时间窗口。

3. 本研究表明，神经元上的IL-17RA是介导真菌沿肠-脑轴作用的必要因素。然而，我们没有完全描绘出哪些神经元参与其中。

4. 本研究表明，MAF可以促进小鼠的社会行为。这种现象是否可以转化为人类的复杂共生微生物群落的存在，还有待确定。