盘点ADC有效载荷背后的故事

在过去几十年中，癌症治疗领域取得了重大进展，新的抗癌药物也不断涌现出来。在众多的药物作用机制中，对于微管的抑制仍然是目前这一代细胞毒性药物的重要机理之一。

微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白形成的异二聚体，是一种很长的丝状蛋白聚合物。微管参与许多对细胞功能至关重要的细胞过程，包括细胞器和小泡的运输、细胞迁移和有丝分裂等等。微管抑制剂的作用就是破坏微管，借此来抑制细胞分裂过程中染色体的分离。

图 1 细胞有丝分裂中的显微图像，其中绿色的微管蛋白帮助红色的染色体进行分离。

图 2 微管蛋白聚合和解聚的动力学

图 3在G2/M期阻滞细胞周期的微管蛋白稳定剂和不稳定剂。

尽管微管蛋白稳定剂（如紫杉醇）和去稳定剂（例如长春花碱）作为独立的抗癌药物已在临床上取得成功，但它们会让许多患者产生全身毒性。为了尽可能减弱这种全身毒性，科学家把微管蛋白抑制剂和抗体结合，从而实现靶向肿瘤的功能，这个概念最终演变成了被称为“魔法子弹”的抗体偶联药物。

微管的结构和功能

微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白组成的中空纤维丝。与肌动蛋白多聚体和中间纤维一样，微管是细胞骨架的组成成分之一，对多种细胞功能至关重要，包括细胞形状的维持、细胞的运动以及囊泡、线粒体和其他成分的细胞内运输。在细胞增殖的背景下，微管在细胞分裂中的作用尤为重要。在细胞分裂过程中，整个微管网络重新排列形成有丝分裂纺锤体，从而为姐妹染色单体的物理分离提供了结构框架。由于微管具有动态的特性，这对于有丝分裂纺锤体的最佳排列，以及随后姐妹染色单体的移动过程都是至关重要的。因此，干扰微管动力学的药物会对纺锤体的形成和最终的细胞分裂过程产生显著的影响。目前，用作ADC有效载荷的最重要的微管蛋白抑制剂，是源自海洋物种的奥瑞他汀（Auristatin）、艾日布林（Eribulin）和源自植物的美登素（美坦新，Maytansinoids）。

奥瑞他汀（Auristatin）

奥瑞他汀的母体结构，是从印度洋海兔（Dolabella auricularia）中分离提取出的海兔毒素10（Dolastatin 10）。人工合成的海兔毒素10类似物单甲基奥瑞他汀E（MMAE）和单甲基奥瑞他汀F（MMAF）被广泛用于ADC的载荷成分。例如Brentuximab vedotin（Adcetris®）就是将MMAE通过马来酰亚胺-缬氨酸-瓜氨酸的连接子，偶联在了链间二硫键被部分还原的CD30靶向抗体上。其中CD30是一种由系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）和经典霍奇金淋巴瘤（HL）患者的肿瘤细胞表达的细胞膜抗原。Adcetris®最初于2011年被FDA批准，是自1977年以来第一种治疗霍奇金淋巴瘤的新疗法，也是第一种专门针对sALCL的治疗方法

图 4 Brentuximab vedotin（Adcetris®）的结构

美登素（Maytansinoids）

美登素是一类苯并大环内酯类化合物，最早从美登木（Maytenus boaria）中提取得到。它可以在根瘤菌素（Rhizoxin）结合位点与微管蛋白结合，起到抑制微管生成的作用。美坦新的衍生物，如DM1，DM3，DM4等被广泛用于临床阶段的ADC结构中，这些衍生物的区别仅仅在于巯基连接位点临近处的甲基数量不同。在目前已经上市的ADC中，Trastuzumab emtansine（Kadcyla®）就是将抗人表皮生长因子受体-2（HER2）的单抗Trastuzumab（曲妥珠单抗，Herceptin®）和DM1通过琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐（SMCC）连接子连接得到。Kadcyla也是首款被批准用于实体瘤的ADC。 单独的曲妥珠单抗通过结合细胞表面的HER2/neu受体，起到抑制乳腺癌肿瘤细胞的作用。Kadcyla也结合同样的受体，但随后进入细胞并释放出DM1毒素，后者与微管蛋白结合，抑制肿瘤的有丝分裂过程。Kadcyla用于既往接受过曲妥珠单抗和紫杉醇（紫杉醇或多西紫杉醇）治疗，或肿瘤在辅助治疗6个月内复发患者的转移性乳腺癌。

图 5 Trastuzumab emtansine（Kadcyla®）的结构

基于其它微管蛋白抑制剂的药物

目前最广泛使用的微管蛋白抑制剂是上述奥瑞他汀和美坦新，但人们一直在ADC中尝试使用其它种类的微管蛋白抑制剂，包括紫杉醇（Taxol）、长春新碱（Vincristine）和秋水仙碱（Colchicine）的衍生物。最近，艾日布林（Eribulin）也在ADC药物MORAb-202中被用作毒素分子，并已进入临床阶段。下面将对这些新兴的微管蛋白抑制剂药物进行详细的综述。

紫杉烷类

紫杉醇是在19世纪60年代后期被分离和纯化得到的，并由Wani等进行了深入的表征。紫杉醇是一种具有较强细胞毒性的有丝分裂抑制剂，通过在细胞分裂的G2/M阶段中断正常的纺锤体组装和染色体分离，结合和稳定微管，从而促进细胞凋亡。紫杉醇还被证明可以刺激免疫系统，在治疗神经退化性疾病以及抑制肉毒神经毒素方面具有潜在作用。 紫杉醇临床开发过程中，遇到的一个潜在障碍是其水溶较差。因此，由于第一代紫杉烷类药物的疏水性，以及肠胃外给药时遇到的相关困难，紫杉烷类药物开发暂停了数年。为了克服这些困难，同时为了提高疗效，科学家合成了各种紫杉醇衍生物和前药。比如多西紫杉醇（Docetaxel, Taxotere）和卡巴他赛（Carbazitaxel, Jevtana）可有效治疗乳腺癌和前列腺癌。 与此同时，人们也尝试将紫杉醇与抗体结合，形成新型抗体偶联药物，其中一些ADC展现出了令人振奋的临床前成果。目前有两个课题组报道了基于紫杉醇的抗体偶联药，可以作为潜在的靶向肿瘤药物。在其中一个工作中，紫杉醇与抗体形成的偶联物（PTXMAbs）可以将足够剂量的紫杉醇递送到肿瘤细胞中，来克服其溶解度对于治疗过程的限制。另一个工作中，作者使用含有聚乙二醇的连接子，构筑了基于紫杉醇的抗体偶联药，其具有较高载药量和良好的水溶性。科学家们也研究并合成了新型紫杉醇类似物，如采用了双重标记方法，同时将紫杉醇和近红外荧光团结合在靶向癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体上，实现诊疗一体化。然而，尽管人们在这一领域进行了大量研究，但基于紫杉烷类药物的ADC距离临床实验还有不小的距离。

图 6 紫衫醇（Paclitaxel, Taxol）及其类似物多西紫杉醇（Docetaxel, Taxotere）和卡巴他赛（Carbazitaxel， Jevtana®）的结构

长春花碱类

1958年，研究者从马达加斯加长春花（Catharanthus roseus, Vinca rosea）中分离出第一种长春花碱，随后人们又发现了长春新碱。由于长春花生物碱具有微管抑制的特性，能阻止微管蛋白聚合成微管，从而抑制有丝分裂进程并导致细胞凋亡，因此人们对其作为药物的应用前景产生了极大的兴趣。 Starling等作为长春花碱类ADC药物开发的先行者，通过将鼠抗KS 1/4单抗与4-脱乙酰长春花碱-3-甲酰肼结合，并在不同给药方案下，对免疫受损小鼠的结肠癌和皮肤癌进行治疗。研究表明，在所有的肿瘤模型中，ADC的治疗均实现了显著抑制肿瘤生长的效果。 在另一项研究中，学者利用新型的基于聚1-羟甲基乙烯羟甲基甲醛的聚缩醛平台技术（Fleximer），构筑了长春花碱类ADC药物。由于Fleximer技术平台的材料具有亲水性和多价性，可以用于生产具有高载药量但不影响物化性质和药代动力学特性的ADC药物。为此，研究者还开发了一种策略，将4-去乙酰长春花碱-3-碳酰肼（DAVLB）直接偶联到多种针对实体瘤的鼠源单克隆抗体上。这些偶联药物在许多实体肿瘤的异种移植模型中都表现出了强大的体内抗肿瘤活性。与未偶联的DAVLB酰肼相比，偶联药的疗效和安全性都有所提高。然而，尽管人们已经进行了大量的研究，迄今为止还没有基于长春花碱的ADC达到临床应用阶段。

图 7长春花碱（Velbe®）、长春新碱（oncovin®）以及一些相关类似物的结构

艾日布林类

艾日布林（Eribulin）是从亚洲海洋海绵（Halichondria okadai）中分离的大环软海绵素b（Halichondrin b）的合成类似物。艾日布林选择性地与β-微管蛋白(+)端结合，抑制微管的伸长，但对微管的解聚几乎没有影响，并且与紫杉烷类药物几乎不存在交叉抗性。艾日布林（甲磺酸盐）于2010年被美国视频药品监督管理局批准作为治疗转移性乳腺癌的独立药物，其中患者此前需要至少接受过两种化疗方案，包括蒽环类药物和紫杉烷类药物。 近期，人们对艾日布林作为ADC有效载荷的可行性进行了研究。在这项研究中，研究者在艾日布林35号碳原子处进行了修饰，使用组织蛋白酶可裂解的马来酰亚胺-缬氨酸-瓜氨酸作为连接子，进一步通过链间二硫键部分还原产生的半胱氨酸残基，与人源化抗人叶酸受体α抗体法妥珠单抗进行偶联，得到对应的抗体偶联药物（MORAb-202）。这种偶联药已在多种叶酸受体α表达的肿瘤细胞系中证明了有效性和特异的细胞毒性。而在体内研究中，MORAb-202在单次静脉给药后，同样在多种异种移植物模型中显示出了强大和持久的疗效。因此，MORAb-202目前正在日本进行的两部分开放标签临床试验（MORAb-202-J081-101）中进行研究。第1部分包括剂量递增实验，以评估剂量限制毒性（DLT）并确定实体肿瘤患者的最大耐受剂量（MTD），第2部分将包括队列扩展实验，以进一步表征MORAb-202的安全性，并评估其在叶酸受体α（FRA）阳性三阴性乳腺癌（TNBC）和2型子宫内膜癌患者中的初步疗效。

图 8 艾日布林（Eribulin）的结构

秋水仙碱（Colchicine）

秋水仙碱是最早发现的微管蛋白抑制剂之一，由一种开花鳞茎类植物秋水仙（Colchicum Autumnale）产生。自16世纪以来，人们已经广泛地利用秋水仙碱治疗疾病，包括痛风和急性痛风性关节炎。秋水仙碱是一种细胞毒性剂，其作用机制与紫杉烷相似，通过干扰微管组装来抑制微管蛋白聚合，并在有丝分裂中期抑制细胞的生长。 研究表明，微管蛋白上至少有两个秋水仙碱的结合位点：一个是三甲氧基苯的部分，另一个是肌钙蛋白的部分。尽管研究者针对秋水仙碱的作用机制已经产生了大量的成果，但它尚未被用作ACD的有效载荷。

其它与微管蛋白相互作用的药物

目前，人们已经发现了许多其他具有不同结构的，可以起到抑制微管蛋白功能的分子，这些分子具有作为ADC有效载荷的潜质。 Dictyostatin是一种于1994年从马尔代夫的海绵属海绵中分离出来。研究表明，Dictyostatin可以抑制某些肿瘤细胞的生长。人们设计并合成了几种Dictyostatin的类似物，它们在几种紫杉烷类药物抗性的肿瘤细胞系中，具有显著的细胞毒性。目前，我们还无法确证Dictyostatin是否与紫杉醇在微管蛋白上有类似的结合位点。 Indibulin是一种具有微管抑制特性的新型合成分子，这种微管抑制的特性是通过基于细胞的筛选试验进行确证的，它可以与微管结合并使微管不稳定。Indibulin广泛的抗肿瘤活性的同时，在临床前研究中发现，它对于中枢和外周神经系统毒性很弱。特别是在临床前模型中，也没有观测到Indibulin与其他微管蛋白抑制剂相关的神经毒性。同时，Indibulin可以口服，这也激发了人们对于Indibulin的广泛兴趣。 Cevipabulin是一种新的合成分子，与长春花碱共享微管结合位点，但它也表现出紫杉烷位点结合配体的一些特性，比如可以增加微管蛋白聚合。在体外实验中，Cevipabulin对多种肿瘤的类型都具有活性，并且很稳定，也具有一定的水溶性，可以口服或静脉给药。此外，Cevipabulin对于合成和工艺放大很友好。基于这些特性，Cevipabulin目前正在作为一种独立的药物进行临床开发，同时也可能有作为ADC有效载荷的潜质。 Cryptophycins是一类人工合成的大环缩肽类分子衍生物。这类物质可以抑制微管蛋白聚合，从而阻止有丝分裂纺锤体的正确形成。与其他微管抑制剂相比，Cryptophycins更容易诱导磷酸化。其中一些Cryptophycins类药物已经作为ADC有效载荷在开发中。 根霉毒素（Rizoxin）是从致病真菌中国根霉中提取的微管蛋白抑制剂，它通过抑制微管组装起作用。根霉毒素是一种大环内酯类抗生素，具有很强的抗真菌活性，也对许多人类肿瘤细胞系具有细胞毒性，包括黑色素瘤、白血病和肉瘤。并在动物实验中，人们已经证明根霉毒素对黑色素瘤，肺癌和乳腺癌具有抑制的效果，因此具有作为ADC载荷的潜力。 最后，微管溶素（Tubulysins）代表了一类由黏菌产生四肽类毒素。它们与微管蛋白的长春花碱位点结合，并对多种肿瘤类型（包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌）具有强大的体外细胞毒性。由于其细胞毒性很强，但缺乏肿瘤细胞和正常细胞的选择性，因此它们作为独立治疗药物并不有效，但作为ADC载荷的使用越来越受到关注。目前，研究者已经开发出一种基于微管溶素的ADC，该ADC表现出良好的体外活性，但在体内研究过程中出现了乙酸酯基团快速代谢的问题。

图 9 Dictyostatin、Indibulin、Cevipabulin、Cryptophycin- 52、Rhizoxin和Tubulysin a的结构

总结

目前，尽管ADC的有效载荷仍然由具有微管蛋白靶向作用机制的奥瑞他汀（Auristatin）和美登素（Maytansine）类化合物主导，但研究者已经评估了其他微管蛋白抑制剂类型作为ADC负载药物的可能性，如长春花生物碱和紫杉烷类药物。到目前为止，这些药物都没有进行到临床阶段。另一方面，EISAI公司最近利用艾瑞布林（Eribulin）作为MORAb-202的有效载荷，这种ADC目前正在临床阶段进行评估。MORAb-202的良好临床结果可能使得未来进一步开发此类药物的ADC成为可能。