科研丨山大: 粪便代谢组和肠道微生物组之间的关键相互作用揭示了缺血性脑卒中的功能特征(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   宏基因组学和代谢组学的综合分析方法已被广泛应用于了解疾病和肠道微生物群之间的关系。然而，关联分析中不同代谢样本的不同分析模式使得哪种类型的样本与肠道微生物和疾病的关联最为密切成为一个值得关注的问题。为了解决这一知识的缺乏，我们调查了缺血性脑卒中(CIS)患者和健康受试者的粪便、尿液和血浆样本的肠道微生物组和代谢组谱之间的关系。本研究对CIS患者和健康受试者的粪便进行宏基因组测序和非靶向代谢组学分析(粪便、血浆和尿液)。通过差异分析寻找缺血性脑卒中的关键差异菌群和代谢产物。同时，利用Spearman秩相关和线性回归分析研究了不同代谢混合物中微生物群与代谢物的关系。结果表明，非靶向代谢组学分析显示，粪便的特征和鉴定的代谢物最丰富，其次是尿液和血浆。在缺血性脑卒中患者与健康组之间，粪便中差异代谢物的数量最高。基于粪便、尿液和血浆的宏基因组学与代谢组学的关联分析，粪便代谢组与肠道微生物组的关联最强。粪便、尿液和血浆代谢组的相关分析中，有1073、191和81对具有统计学意义(P<0.05)。粪便代谢物解释了高达31.1%的肠道微生物组α多样性的变化，而尿液和血浆代谢物仅解释了13.5%和10.6%的α多样性变化。同时，与脑卒中标志细菌相关的差异代谢物在粪便中比在尿液和血浆中更显著。综上，肠道微生物组与代谢组学的系统关联分析表明，粪便代谢物与肠道微生物组的相关性最强，其次是尿液和血浆。本研究结果将促进肠道微生物组与粪便代谢组之间的关联研究，以探索与疾病相关的关键因素。还提供了一个用户友好的web服务器和R包，以便于研究人员进行肠道微生物组和代谢组学的关联分析。    

论文ID

原名：Pivotal interplays between fecal metabolome and gut microbiome reveal functional signatures in cerebral ischemic stroke

译名：粪便代谢组和肠道微生物组之间的关键相互作用揭示了缺血性脑卒中的功能特征

期刊：Journal of Translational Medicine

IF：8.44

发表时间：2022.10

通讯作者：张涛，张磊，衡雪源

通讯作者单位：山东大学齐鲁医学院；山东大学临沂市人民医院

DOI号：10.1186/s12967-022-03669-0

实验设计

结果

1 粪便代谢组具有最丰富的代谢特征

在GC-MS平台上对三种类型的代谢混合物进行代谢谱分析。在确定代谢物后，粪便特征和鉴定代谢物最丰富，其次是尿液和血浆。此外，不同的混合物表现出不同和共同的特征。图1A显示了三种类型代谢混合物中鉴定出的代谢物数量的维恩图。粪便、尿液和血浆中分别鉴定出247、204和162种代谢物。我们通过统计检验计算了不同类型混合物中CIS和对照组之间代谢物的数量变化(图1B)。粪便、尿液和血浆中差异表达的代谢物数量(倍数变化>2或<0.5，P<0.05)分别为30、7和3。因此，在CIS相关代谢组的研究中，粪便代谢物比尿液和血浆代谢物更具代表性。例如，在所有被破坏的代谢物中，苯乙酸在粪便中被发现，并且在CIS组中表达上调，这是生成苯乙酰谷氨酰胺的前体代谢物，与心血管疾病(CVD)和重大心血管不良事件(心肌梗死、中风或死亡)的发生有关。

图1 粪便、尿液和血浆中代谢混合物的代谢谱分析。

A 粪便、尿液和血浆中鉴定出的代谢物数量的维恩图。B CIS与对照组相比，粪便、尿液和血浆中代谢物变化的火山图。每个点代表样本中鉴定出的一种代谢物。蓝色点代表在CIS中被下调的代谢物。红点代表在CIS中上调的代谢物。   2 粪便代谢组与肠道菌群的相关性最强 使用Spearman秩相关分析和线性回归模型评估肠道微生物组和代谢组之间的相关性。计算每对细菌物种的相对丰度和代谢物的Spearman秩相关系数。共有725种统计上不同的细菌物种被纳入关联分析。粪便、尿液和血浆代谢组的相关分析分别考虑了247、204和162种代谢物。在肠道微生物组和粪便代谢组之间发现1073对具有统计学意义的配对(P<0.05)和202对高度相关的配对(|r|>0.7，P<0.05)。在肠道微生物组和尿液代谢组之间发现191对具有统计学意义的配对(P<0.05)和130对高度相关的配对(|r|>0.7，P<0.05)。在肠道微生物组和血浆代谢组之间发现81对具有统计学意义的配对(P<0.05)和16对高度相关的配对(|r|>0.7，P<0.05)。使用图2和图3中的热图对相关性分析结果进行聚类和可视化。通过比较显著对的数量和相关性强度，粪便代谢组与肠道微生物组的相关性最强。

为了探索代谢物与肠道微生物群α多样性之间的关系，对代谢物和通过Chao1和Shannon指数量化的α多样性进行了线性回归分析。我们估计了每种代谢物解释的Chao1和Shannon指数的方差比例。结果如图4、附图S11和S13所示。我们发现85种(粪便)、7种(尿液)和5种(血浆)代谢物与微生物多样性存在显著相关性，其中58、0和0种代谢物在FDR校正后仍存在显著相关性。此外，85种粪便代谢物中有58种(FDR<5%)解释了微生物多样性中观察到的变异的很大比例(>10%)，平均16.7%(SD:5.5%)，范围从牛磺酸的10.0%到十五酸的31.1%。然而，只有3种(尿液)和1种(血浆)代谢物解释了微生物多样性中观察到的平均变异的13.5%(对甲酚)和10.6%(吲哚-3-乙酸)。Shannon指数获得了一致的结果，其在补充信息中提供。因此，粪便代谢组与微生物组的相关性最高，其次是尿液和血浆代谢组。

图2 物种和粪便代谢物的Spearman秩相关性热图。

绘制了与72种细菌和98种粪便代谢物的7056对相关性。红色方格表示这些微生物种类与临床指标呈正相关。蓝色方格表示负相关。方框内显示统计显著性(*P<0.05，**P<0.01)。  

图3 物种和尿液或血浆代谢物的Spearman秩相关性热图。红色方格表示这些微生物种类与临床指标呈正相关。蓝色方格表示负相关。方框内显示统计显著性(*P<0.05，**P<0.01)。A 绘制了与71种细菌和32种尿液代谢物的2272对相关性。B 绘制了与57种细菌和21种血浆代谢物的1197对相关性。           ‍

图4 每种粪便代谢物解释的Chao1多样性的变异比例。红色条表示代谢物与Chao1多样性正相关，蓝色条表示负相关。   

3 CIS中受损肠道菌群和粪便代谢物的关键相互作用

结果发现，CIS组的所有微生物丰富度(Observe、Chao1和Ace)和多样性(Shannon)均高于对照组，但只有微生物丰富度指数有统计学差异(图5A)。基于β多样性分析的主坐标分析(PCoA)显示，CIS与对照组之间的微生物组成无统计学差异(图5B)。LEfSe分析显示，在CIS组和对照组之间有33个不同的种和属(26个物种，7属)具有统计学差异(图6)。我们发现，与对照组相比，CIS组中Oscillibacter、梭菌属(Clostridium)和SCFA产生菌(如Odoribacter、阿克曼氏菌属Akkermansia和瘤胃球菌属Ruminococcus)均有富集(图6)。3级KEGG通路富集分析显示，CIS组和对照组之间有14条代谢途径存在统计学差异(P<0.05)(图5C)。进行生态相互作用分析，以了解CIS和对照组肠道微生物群中细菌之间的潜在关系。如图5D所示的生态网络，与对照组相比，CIS的相关性更强。在CIS组中，来自厚壁菌门的细菌Oscillibacter sp. CAG:241与物种的相互作用最强，梭菌属(Clostridium)在细菌间相互作用中起关键和支柱作用。按节点度排序的前30个细菌物种中，有几个物种在CIS中表现出比对照组更强的相关性，包括Oscillibacter sp. CAG:241、Clostridium sp. MSTE9、Clostridium viride、Clostrudium sp. CAG:226和Clostridum sp. CAG:1024，它们与心血管疾病(CVD)和重大心血管不良事件(心肌梗死、中风或死亡)的发生有关。此外，这些富集在CIS中的梭菌物种彼此密切相互作用，并在CIS中形成一个连接的群。肠道微生物组生态网络的这种变化表明，在CIS受试者中，种间通讯或相互作用发生了显著改变。

图5 CIS与对照组肠道微生物群分类及功能比较。

A 表示α多样性指数。B 描述了β多样性的主坐标分析(PCoA)。每个点代表CIS和对照组中的单个样本。两个主要成分(PC1和PC2)解释了24%和17%。C 显示了肠道微生物群中功能注释的KEGG通路的相对丰度。95%置信区间的条形图表明，CIS和对照之间的KEGG途径存在显著差异。D CIS与对照组的肠道细菌-细菌生态网络比较。通过Spearman秩相关分析计算分类群之间的相关性。对所有成对比较确定统计显著性。仅绘制了|r|>0.5的统计学显著相关性(P<0.05)。与单个微生物物种相对应的节点大小与物种间显著相关性的数量成正比。节点的颜色表示相应微生物物种所属的门。连接线的颜色强度与相关系数成正比，其中蓝色线表示负相关，红色线表示正相关。

图6 LDA评分(log10)>2.0且P<0.05的显著差异丰富类群的柱状图。

本研究检查了CIS组和对照组中差异表达代谢物和细菌物种之间的关系。计算每对差异细菌物种的相对丰度和代谢物的Spearman秩相关系数。本研究只考虑了最显著的差异代谢物，包括粪便、尿液和血浆中的30、7和3种代谢物。图7显示了差异表达代谢物与细菌物种之间的Spearman相关性比较。通过比较显著对的数量和相关性强度，粪便代谢组与肠道微生物组的相关性最强，其次是尿液和血浆代谢组。

特别是，发现与CVD相关的苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)的前体物质(粪便代谢物苯乙酸)与与CIS相关的一些细菌物种密切相关，包括Oscillibacter sp. CAG:241(r=0.51，P<0.001)、Clostridium viride(r=0.58，P<0.01)、Clostridium sp. CAG: 1024(r=0.50，P<0.001)、Clostridium sp. CAG: 226(r=0.48，P<0.001)和Clostridium sp. CAG: 715(r=0.40，P<0.01)。还对单个细菌物种和所有破坏的代谢物进行了线性回归分析(图8和附加文件1：图S15)。粪便代谢物与细菌物种的相关性最强。例如，粪便代谢组解释了Oscillibacter 36.7%的变异，而尿液和血浆代谢组在关联分析中没有显著性。因此，对CIS和对照组的研究表明，粪便代谢组不仅与肠道微生物组的相关性最强，而且对了解肠道微生物组和代谢紊乱的作用最大。 

图7 显著差异物种和代谢物的Spearman秩相关性热图。方框内显示统计学显著性(*P<0.05，**P<0.01)。    

图8 细菌数据与代谢组学数据第一主坐标(PCo1)之间的关联

将缺血性脑卒中和对照组样本合并计算R2及其显著性。黑线和灰色区域显示了一个线性模型，其95%置信区间描述了总体趋势。A Oscillibacter与粪便、尿液和血浆代谢组学数据第一主坐标(PCo1)之间的相关性。B Oscillibacter sp. ER4与粪便、尿液和血浆代谢组学数据第一主坐标(PCo1)之间的相关性。

讨论

为了调查和评估肠道微生物组与三种类型代谢混合物(包括粪便、尿液和血浆)之间的关系，我们对缺血性脑卒中和对照受试者的宏基因组学和代谢组学数据之间的关联进行了系统分析。宏基因组学和代谢组学的综合分析表明，粪便代谢组具有最丰富的特征，在细菌多样性和丰度方面与肠道微生物组的关联性最强。 线性回归分析表明，58种粪便代谢物解释了观察到的微生物多样性变异的很大一部分(>10%，高达31.1%)。与血浆和尿液代谢组相比，粪便代谢组在CIS和对照组之间具有最显著的差异表达代谢物数量。此外，一些被破坏的粪便代谢物与显著差异细菌物种有很强的相关性。这些结果强调了粪便代谢物在宏基因组关联分析中的重要性，这可能为生物医学研究中代谢混合物的选择提供参考。 肠道微生物组和代谢组的综合分析被应用于缺血性脑卒中生物标志物发现的现实场景。与尿液和血浆相比，粪便代谢组在CIS组和对照组之间显示出更显著的代谢紊乱。苯乙酸是粪便代谢组中的一种差异显著代谢物，值得特别关注，因为它是生成苯乙酰谷氨酰胺的前体代谢物。微生物基因porA促进膳食苯丙氨酸转化为苯乙酸，随后宿主产生PAGln和苯乙酰甘氨酸(PAGly)。据报道，PAGln与心血管疾病(CVD)和重大心血管不良事件(心肌梗死、中风或死亡)的发生有关。PAGln显著影响血小板功能，加速血小板凝块形成，增强体内血栓形成的可能性。此外，被破坏的粪便代谢物与一些被破坏的细菌物种有关，据报道，这些被破坏的微生物物种与心血管疾病有关，包括属水平的Oscillibacter和Oscillibacter sp. CAG:241、Clostridium sp. CAG:715、Clostridium sp. CAG:226和Clostridium sp. CAG:1024。 需要注意的是，由于本研究样本量有限，可能存在一些意想不到的偏差，如缺血性脑卒中的代谢物鉴定和生物标志物的置信度。因此，进一步的改进，如增加样本量和设计不同疾病的研究，将有助于肠道微生物组和代谢组学之间更具信息性的关联图。综上，我们的研究促进了粪便代谢物和肠道微生物群之间密切相关的知识，综合分析在理解疾病机制和生物标志物发现方面发挥了重要作用。

结论

肠道微生物组和代谢组的交替为阐明肠道微生物群和代谢物在理解疾病机制中的作用提供了综合信息。不同的代谢样品具有不同的代谢谱，与肠道微生物组的关联程度也不同。本研究对肠道微生物组和粪便、尿液和血浆代谢组学的综合分析表明，粪便代谢物提供了最丰富的代谢信息，与肠道微生物组的相关性最强，这促进了肠道微生物组与代谢物相互作用的研究，以了解疾病。本研究强调了粪便代谢物在宏基因组关联分析中的重要性，并为生物医学研究中选择合适的代谢样本提供了参考。此外，微生物-代谢组的综合关联研究及其在缺血性脑卒中中的应用表明，粪便代谢组提供了全面和信息丰富的代谢状态，促进某些疾病的生物标志物的发现。了解粪便代谢物和肠道微生物组之间的相互作用将有助于生物医学和转化研究中的多组学方法，例如开发促进健康的个性化多模式干预措施。