苏建荣教授：宏基因组测序和靶向测序技术在病原微生物检测中的临床价值与局限性

临床实验室            

本文刊载于《临床实验室》杂志2022年10月刊专题“临床微生物检验”-「专家论坛」版块

作者：谷德健   陈蓉蓉  贾婿  高瑞  苏建荣

感染性疾病的发病率和死亡率均位居全球前十位，严重威胁着人类的生命和健康。从临床样本中鉴定出病原体是指导感染疾病治疗和管理策略的关键。目前多种传统诊断技术应用于病原学诊断，高通量测序技术也称下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）在临床病原体检测中的应用显示出巨大的潜力。

mNGS技术在病原微生物检测中的价值和局限    

1.mNGS技术在临床病原微生物检测中的价值：无需预设、可覆盖广泛的病原微生物助力新发、罕见、难检病原的鉴定。

（1）传统检测方法只能检测已知病原，检测通量有限，对于临床医生的经验依赖性大。mNGS通过对样本中所有核酸进行测序，从而实现广泛无偏的病原微生物检测。这为临床上不明原因的感染、罕见致病菌病原鉴定提供了可能。

（2）mNGS检测经抗菌药物治疗患者，混合感染患者具有优势：经验性抗菌药物在急性重症感染患者的治疗中仍比较普遍，但是带来的问题是可能会影响传统方法鉴定病原体的敏感性。由于mNGS技术并不依赖于活菌，而是基于微生物核酸的检测，因此受先前抗菌药物治疗暴露的影响相对较小。苗等人通过对561名急性或慢性感染患者的队列研究发现，在接受过抗菌药物治疗的患者中mNGS的检出敏感性显著高于培养（52.7% vs 34.4%）。

2.mNGS广泛应用于病原检测的局限：

（1）mNGS检测某些苛养/难检/低载量微生物能力还需要提升：mNGS通过对样本中所有核酸进行测序，从而实现广泛无偏的病原微生物检测。微生物序列数（reads）是支撑病原微生物被正确鉴定的关键，序列数是指检测到的短DNA序列的数目。由于人类基因组远大于微生物基因组，样本中宿主细胞数通常也远高于微生物细胞，因此，宿主核酸占比是影响mNGS病原微生物正确鉴定的最重要因素。去除宿主核酸的方法都会在一定程度上损失部分病原体。此外，去宿主过程中使用额外的试剂，可能增加外源性背景污染的风险。不同样本的宿主细胞占比的复杂性也增加了去宿主核酸的难度。对于宿主核酸的去除方法，目前还没有比较有效可行的方法和标准。

此外，一些具有较厚细胞壁的病原体如真菌和胞内菌，可能会因为较低的核酸提取效率从而导致检测输入的微生物核酸载量降低，影响检测性能。王等人通过mNGS分析了21例真菌性肺炎患者，mNGS检出19例，但研究发现mNGS在检测隐球菌上并未表现出优势。另外一项mNGS用于脑膜炎患者的检测研究中，虽然mNGS和传统检测表现出较高的一致性，但仍存在漏检患者。为了不漏检一些致病性微生物，如结核分枝杆菌、军团菌，一般这些微生物都特殊设置了较低的报出阈值。但是，如此低的阈值下，也会使得临床判断和决策变得困难。

（2）宽谱的微生物覆盖导致mNGS结果解读是一项巨大的挑战：mNGS生信分析过程中不仅要构建包含所有病原微生物的数据库，还需要构建相关的数据库用于过滤。考虑到不同微生物的致病性和致病条件，mNGS需要设定个性化的报出阈值。如结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌及流行性出血热病毒等的高致病但低病原载量的病原体专家共识建议，在排除污染的前提下，即使检出1条序列也应视为阳性。即便如此，mNGS报出的微生物数量也在5-20个，这使得mNGS的临床解读具有巨大的挑战，需要大量的临床、病原微生物诊断和专业经验，需要考虑临床整体情况，这通常需要一个专业的多学科团队来完成。

tNGS技术在病原微生物检测中的优势和不足    

tNGS技术是基于NGS的靶向富集（Target enrichment）的测序技术。靶向富集是tNGS技术的关键环节，通过对目标基因组区域（regions of interest ，ROI）进行富集，确保ROI区域有足够的测序深度和覆盖度，进而成功地识别目标病原体。目前国内外策略主要分为两种：基于超多重PCR扩增的tNGS和基于杂交捕获的tNGS 。

1.tNGS靶向富集策略：tNGS的两种主要靶向富集方法中，杂交捕获靶向测序主要是利用探针杂交富集目标片段，适用于基因组目标区域的全面检测。目前应用的主要是液相杂交捕获测序，即基于碱基互补配对原理，设计合成核酸探针，对DNA文库进行基于液相环境的目标区域杂交富集，并进行测序。对于杂交捕获测序，会涉及到探针序列设计、目标病原体的选择、精细化数据库的构建等多个技术开发难点。

超多重PCR靶向测序即针对感兴趣的目标区域，设计多重PCR引物进行扩增富集并进行测序的技术。通常适用于检测几十到几千个位点，或几十kb以下的区域。其核心是引物设计，先通过PCR扩展富集目标片段，再进行文库构建，适用于研究的目标区域相对较小，对于拷贝数较低的模板DNA，可产生足够数量用于测序的扩增子，这种方法能明显提高效率，节约时间，降低经济成本，难点在于多对引物间存在互相干扰和非特异性扩增等问题。两种方法之间的主要差异见表1。

表1  杂交捕获靶向测序和超多重PCR靶向测序的富集方法主要差异比较

2.tNGS的技术优势：几项研究通过头对头比较mNGS和tNGS，也证实tNGS临床应用的可行性。

（1）富集增加目标微生物检测覆盖，提升检测可信度：tNGS技术通过靶向富集目标病原体核酸序列，可以特异性增加测序数据中目标病原体序列的数量和比例,提高对目标微生物检测的reads数和覆盖度。tNGS的靶向富集，即使在不去除宿主的条件下，也可以特异性增加微生物核酸的比例。tNGS在富集后，能提升苛养和低载量病原的载量和覆盖度，提升检测可信度。针对靶向范围内微生物，tNGS的靶向富集能提升微生物对应的序列数，有助于微生物可信检出。

（2）tNGS可稳定的进行耐药或毒力基因的检测：对于耐药基因检测方面，以mecA、KPC等基因为代表性的耐药，通常只需要鉴别病原感染样本中是否存在耐药型别，但难点在于如何将耐药基因与致病病原相结合，考虑到耐药基因的复杂性，结合致病菌解读耐药和毒力基因是有必要的；另一方面，以结核菌的耐药为代表性的基因改变，需要精确到突变位点。因此，mNGS技术对耐药和毒力基因检测存在局限性。

tNGS技术可以针对耐药/毒力基因进行目标区域富集，确保准确稳定的检出。需考虑同一基因的不同突变类型，产生的耐药效果不同，实现耐药/毒力基因的全覆盖。

（3）tNGS检测因目标病原体设定范围明确，可以显著简化解读流程：在mNGS和tNGS的对比研究中发现，基于mNGS检测样本单次报出的病原数量在4-24个，而tNGS报出集中在1-2个。在病原微生物数据库构建方面，相较于mNGS数据库的几万种微生物的“大而全”，tNGS数据库可更加聚焦几十至几百种目标病原体，更加深入细致地区分不同亚种和亚型。在tNGS和mNGS的对比研究中，在tNGS中检出的新型隐球菌被错误的识别为格特隐球菌。这表明tNGS生信数据库的精细化、专业化的设计在病原识别中是至关重要的。

3.tNGS临床应用的不足：tNGS的检测panel是依据已知病原设计的，因此tNGS不适用于新发病原的检测。近期tNGS和mNGS的比较研究中报道，mNGS中检出大量的人类疱疹病毒，但tNGS的病原检测范围并未包含该病毒故tNGS中并未报道；除此之外，mNGS还在tNGS的检测范围外检出了8种细菌，2种寄生虫，5种病毒和5种真菌。

mNGS与tNGS临床应用展望    

目前，mNGS主要应用于怀疑感染的急危重症、常规检测阴性但怀疑感染的等疑难杂症的患者。tNGS在临床检验领域也正受到越来越多的关注。在技术层面，自动化流程以及准确且更快速的测序仪可能是mNGS和tNGS技术转化的两大发力点；在应用层面，mNGS和tNGS都需要进一步明确临床使用场景，并根据临床应用场景明确检测样本类型，目标病原范围，阳性判断值，以及产品配套使用的数据库。未来基于传统检测、tNGS和mNGS的小、中、大覆盖范围的病原检测方法将更有效、更精准的服务于临床的精准诊疗。

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题图 | veer.com

排版 | 张宁

审校 | 方研

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