顶刊综述丨NAT REV MICROBIOL: 肠道微生物组中的碳水化合物活性酶(CAZymes)

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

存在于人类肠道中的1013-1014种微生物(统称为人类肠道微生物群)将其基因组的大部分用于碳水化合物的降解和摄取，这表明了这类分子的重要性。碳水化合物不仅可以作为这些细菌的碳源，还可以作为附着于宿主的手段和宿主感染的屏障。本综述重点讨论了碳水化合物活性酶(CAZymes)的多样性、肠道微生物如何利用它们降解碳水化合物、这些CAZymes的不同化学机制以及这些微生物及其CAZymes在人类健康和疾病中的作用。本文还强调了来自这个宝库的酶如何用于操纵微生物群以改善健康和治疗疾病、在生物制药上重塑聚糖以及潜在生产通用O型供血的示例。

论文ID

原名：Carbohydrate-active enzymes (CAZymes) in the gut microbiome

译名：肠道微生物组中的碳水化合物活性酶(CAZymes)

期刊：Nature Reviews Microbiology

IF：78.297

发表时间：2022.3

通讯作者：Stephen G. Withers

通讯作者单位：加拿大英属哥伦比亚大学

DOI号：10.1038/s41579-022-00712-1

综述框架

主要内容

人类与其微生物群有着密切的关系。我们肠道中的1013-1014细菌群落以其在人类健康和生理学中的许多作用而闻名，这些作用范围从免疫系统发育和营养获取到药物代谢和宿主行为调节。因此，人们对了解和操纵肠道微生物群的兴趣越来越大。2019年全球人类微生物群治疗、分析和诊断市场估计约为2.75-4亿美元，预计到2024年将增至7.5-15亿美元。 碳水化合物在塑造微生物群方面具有重要作用。肠道是微生物的竞争环境，降解碳水化合物(无论是在食物中发现还是来自宿主或人类肠道微生物群的其他成员)的能力为某些细菌提供了竞争优势。微生物碳水化合物降解活动也为宿主提供了实质性的好处。人类缺乏降解膳食碳水化合物所需的大部分酶。相反，我们将这些酶需求外包给常驻的肠道细菌。虽然细菌会降解这些碳水化合物来满足自身的需求，但作为反馈，宿主会以短链脂肪酸的形式获得能量，通常高达身体能量预算的10%。短链脂肪酸还具有抗炎活性，可以调节表观遗传重塑并影响宿主代谢。在大多数情况下，碳水化合物、微生物群和人类健康之间的这种相互作用平稳而安静地进行，但偶尔会变得明显。这方面的一个例子是结肠产气细菌对豆类、芸苔属和乳制品中存在的膳食寡糖进行过度厌氧发酵而引起的肠胃胀气。 作用于碳水化合物的酶，即碳水化合物活性酶(CAZymes)，作用于多种底物。CAZy数据库和相关的CAZypedia中包含几个不同的酶类别和相关模块，如图1所示。参与碳水化合物降解的CAZymes包括糖苷水解酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶。此外，辅助活性酶执行各种氧化还原转化，在许多情况下，这些转化本质上是降解的。酶的种类和所使用的化学机制高度依赖于待切割的碳水化合物底物的结构。肠道的厌氧环境和许多辅助活性酶对氧的依赖性所施加的进一步限制是，辅助活性酶似乎并未在人类肠道微生物组中广泛编码，尽管确实存在例外情况。同时，参与碳水化合物合成的主要酶被归类为糖基转移酶。通常，CAZyme附加有碳水化合物结合模块(CBM)，这些模块在增强附加的CAZyme的催化活性方面具有重要作用，但它们本身不包含催化活性。 由于特定CAZymes的进化和获得为某些细菌提供了竞争优势，因此人类肠道细菌将其大部分基因组用于CAZymes。糖苷水解酶是负责碳水化合物降解的最大和研究最好的CAZymes类别，并将成为本次综述的重点。尽管它们具有广泛的底物范围、多样的3D结构和进化起源，但大多数糖苷水解酶使用的两种化学机制之一是Koshland在大约70年前基于当代对酸催化糖苷水解的理解首次提出(方框1)。然而，这些机制有一些有趣的调整，以匹配底物结构的特性，其中许多将在后文描述。因此，肠道微生物组内CAZyme的丰富性和多样性使肠道成为CAZyme发现的一个有吸引力的起点，可用于一系列应用。宏基因组测序表明，在地球上所有环境中，人类肠道微生物群作为一个整体，每千碱基糖苷水解酶的密度最高。因此，肠道居民(如Bacteroides thetaiotaomicron和Bacteroides ovatus)将其基因组中相当大的比例用于糖苷水解酶和多糖裂解酶(约占所有编码基因的6%，而大多数生物体将1-3%的基因用于CAZymes)。特别是，参与膳食多糖和人类聚糖降解的CAZymes可能特别丰富。利用这一资源，已从肠道微生物组中鉴定出参与制备高价值生物药物甚至参与血型重塑的酶。

本综述将重点介绍CAZymes酶学的基本原理、细菌碳水化合物降解的常见主题(特别关注经过充分研究的拟杆菌门)以及这些酶在人体肠道微生物群分解碳水化合物中的生理作用。此外，通过讨论这些CAZymes的化学机制及其应用，我们旨在为该领域提供一个独特的视角。这项研究将强调将我们对人类肠道微生物群的基本糖生物学的理解与我们对CAZyme机制的知识联系起来以在医学和生物技术方面取得进一步进展的重要性。

图1 CAZyme类别和相关模块的概述。糖苷水解酶催化多种糖底物中糖苷键的水解，根据它们在糖底物中的裂解位置可分为外糖苷水解酶或内糖苷水解酶。糖基转移酶使用活化的供体形成糖苷键，将糖转移到特定受体上，例如蛋白质、脂质或其他聚糖。多糖裂解酶利用独特的机制分解含有糖醛酸的多糖。糖胺聚糖是人类肠道微生物群中最常见的多糖裂解酶底物之一。碳水化合物结合模块(CBM)是没有催化活性的结构域，通常附加在碳水化合物活性酶(CAZymes)上。CBM结合一系列不同大小和组成的碳水化合物基序，并有助于将相关的CAZyme引导至底物。碳水化合物酯酶催化各种碳水化合物底物的去酯化。辅助活性酶包括一大类对碳水化合物起作用的氧化还原活性酶。 BOX 1. 经典的Koshland机制。

在淀粉和纤维素中发现的糖苷键是自然界中发现的最稳定的键之一。幸运的是，大自然在进化糖苷水解酶以水解这种连接方面做得非常出色。在一篇现在具有开创性的论文中，Daniel Koshland Jr提出糖苷水解酶可以遵循两种机制，即端基异构中心的立体化学在水解时是否保留或反转。如图(a)所示，糖苷键的裂解可以通过两步双置换机制实现，并具有立体化学的净保留。第一步涉及两个催化残基(通常为Asp或Glu)协同作用。一个残基充当亲核试剂，攻击异头中心，而另一个残基则向离去基团提供质子。接下来，酸或碱残基在攻击糖基酶时使水去质子化，并释放糖产品。或者，糖苷水解酶可以通过立体化学反转的单一置换机制进行(见图b小图)。一个羧酸残基使糖苷氧质子化，而另一个残基有助于水亲核试剂的去质子化，从而直接置换异位取代基。所有步骤都通过类氧碳鎓离子过渡态进行。尽管糖苷水解酶在很大程度上遵循上述机制，但也有偏离报道，其中一些在文本中进行了描述。

1 食品、药物和微生物群

1.1 饮食和微生物群

在不同的文化和饮食习惯中，人类肠道内的微生物组成和相关的CAZymes专门针对膳食多糖。此外，饮食与微生物组组成和功能之间的关系也存在于动物物种中。正如Freter等人在1983年提出的那样，肠道内的微生物可获得大量但数量有限的生态位。微生物在肠道中立足的方法之一是通过进化出能够降解特定多糖的CAZymes。因此，不同类型的细菌具有不同的CAZyme含量。通常在人类中，富含植物性碳水化合物的饮食有利于普雷沃氏菌的生长，而拟杆菌则在较少的碳水化合物进入肠道的饮食中更加丰富。然而，物种水平和菌株水平的基因组含量差异以及其他膳食因素也会影响肠道中的微生物丰度。 引入不同的膳食碳水化合物会在不同的时间尺度上改变微生物组和相关的CAZyme组成。例如，在饮食调整的一天内，随着从新的食物来源引入具有代谢活性的细菌，观察到常驻微生物多样性和代谢的微小变化。哈扎狩猎采集者的饮食经历季节性变化，因为他们在旱季富含肉类的饮食和雨季富含蜂蜜和浆果的饮食之间交替进行。这些饮食变化会导致微生物组组成的变化(例如，普雷沃氏菌在雨季下降)和相关的CAZyme含量的变化。值得注意的是，相比之下，工业化国家的成年人通常拥有相对稳定的微生物群。有人提出这种稳定性是由普遍一致的(通常是缺乏纤维的)饮食驱动的，从而导致其他可变细菌种群的灭绝，伴随着细菌多样性的整体丧失。作为对长期饮食习惯的适应，共生体也可以发生基因组水平的变化，这种现象的一个有趣的例子是获得参与降解卟啉和琼脂糖(存在于东亚文化中常见的藻类多糖中)的CAZymes。这些CAZymes很可能是通过转座子介导的水平基因转移从可能与藻类一起消耗的海洋细菌中获得。

1.2 膳食纤维

肠道细菌已经进化出许多方法来降解饮食中的碳水化合物。这些碳水化合物(通常被称为膳食纤维)通常是植物来源的，可以避免宿主降解，并被人体肠道微生物群所作用。就其在肠道微生物群中的作用而言，淀粉是研究得最好的纤维之一，并且是唯一一种人自身产生降解酶的多糖。然而，根据食物的制备和淀粉的特性，其中2%到50%可以逃避宿主降解，并被传递给肠道微生物群。已经表征了各种肠道微生物中淀粉降解和摄取的许多不同途径，但最著名的途径之一是B. thetaiotaomicron中的淀粉利用系统(Sus)。1989年，Anderson和Salyers发起了对八基因多糖利用位点(PUL)的阐明，这是首次阐明的PUL(BOX 2)。 Sus的开创性工作为PULs提供了一个通用模型，该模型已经扩展到整个拟杆菌门的其他物种。这种降解方法在某些情况下被描述为“自私的”，因为它最大限度地减少了营养物质向邻近肠道微生物的分布。一般来说，多糖的降解是由多糖的细胞外裂解引发的，并由表面内切糖苷水解酶进行。这会产生大的寡糖，然后迅速运输到周质，在那里寡糖被分解成简单的单糖和二糖。这个过程有效地排除了其他细菌摄入任何释放的碳水化合物。在其他示例中，降解产物不会被迅速转运到周质中，而是可以与其他细菌共享，如下所述。 Cuskin等人首先注意到了自利模型，即B. thetaiotaomicron降解酵母α-甘露聚糖。几个世纪以来，含酵母的发酵食品一直是人类饮食的一部分。因此，像B. thetaiotaomicron这样的肠道细菌已经进化出消化酵母细胞壁的方法也就不足为奇了。α-甘露聚糖降解由BT3862启动，BT3862是一种表面内切-α-1,2-甘露糖苷酶(GH99)，负责释放Man-α-1,3-Man二糖(图2)。最近针对GH99家族提出了一种通过环氧化物中间体进行的新型底物辅助催化机制，并得到了一定的机理研究支持。简而言之，羧酸盐在活性位点使甘露糖2-羟基去质子化，同时乙醇对异头中心的亲核攻击，产生短寿命的1,2-脱水糖。然后，该中间体通过活性位点谷氨酸残基提供的一般碱催化作用于异头中心的水进行水解(图2)。两种表面内切-α-1,6-甘露聚糖酶(GH76)进行进一步降解以产生寡糖，然后将其转运到周质中进行进一步代谢。在周质中，对输入寡糖的降解是由一系列具有不同特异性的糖苷水解酶进行的。磷酸化分支的完全降解需要甘露糖-6-磷酸酶(BT2630或BT3783)来去除6-磷酸键，从而允许BT3774(GH38)进一步降解，它无法容纳–1亚位点中的带电6-磷酸键。 必须注意的是，并非人类肠道微生物群中的所有碳水化合物降解都是独立的。事实上，复杂的碳水化合物交叉喂养网络似乎在微生物群中很常见。在许多情况下，启动碳水化合物降解细菌的共培养可以使无法利用碳水化合物的菌株(次级降解菌)生长。在许多情况下，似乎二级降解菌只是缺乏负责初始裂解的表面内切糖苷水解酶，因为这些酶的外源添加或所需基因的整合使碳水化合物得以利用。在通过交叉喂养进行合作的一个显著例子中，B. ovatus虽然没有利用降解产物，但仍产生胞外菊粉降解酶。相反，这些酶的产生似乎有助于菊粉二级降解菌(如Bacteroides vulgatus)的生长。反过来，B. vulgatus通过一种尚不清楚的机制为B. ovatus提供了竞争优势。此后在许多不同的细菌之间发现了类似的关系。这种相互作用网络通过外膜囊泡介导的长距离碳水化合物降解进一步扩大。拟杆菌已被证明将某些CAZymes包装到外膜囊泡中，并将其释放到细胞外环境中，使人类肠道微生物群的其他成员能够获得公共的可利用碳水化合物。 更高复杂度的碳水化合物的降解需要包含更广泛酶类的更大的PUL。最复杂的例子之一是鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II(RG-II)的降解，这是果胶中的一种常见多糖。RG-II中共有21个不同的糖苷键，具有多种酯修饰、吡喃糖和呋喃糖，以及L-糖和D-糖。B. thetaiotaomicron使用包含在三个PUL中的大量CAZymes几乎完全降解这种碳水化合物(留下一个未切割的糖苷键)。也许令人惊讶的是，降解是通过对每个糖苷键都具有特异性的单一酶来完成的，突出了这些酶的精细区域选择性和立体选择性。一种RG-II PUL的同源物存在于几种细菌中，并可能赋予RG-II代谢。事实上，许多碳水化合物中同源PUL的存在似乎可以作为聚糖降解能力的相对可靠的指标。此外，不同细菌中同源PULs的存在可能为人体肠道微生物群提供一定程度的功能稳定性和恢复力，即使某种聚糖降解菌丢失，另一个也能发挥同样的作用。

PUL的存在还表明存在一种能够被降解的聚糖。最近，Lapébie等人扩展了这一概念，以估计自然界中存在的碳水化合物结构总数为几千个(与Laine最初计算的六糖的1012个理论结构不同)。Lapébie等人主要通过调查迄今为止测序的不同PULs的数量来实现这一点。然而，“one PUL, one glycan”范式还存在额外的复杂性。越来越复杂的碳水化合物通常需要在中央PUL外附加的共调节基因簇(称为CAZyme簇)才能被完全降解。在其他情况下，多糖的不同组分将被不同的PUL靶向。在这种情况下，某些生物可能仅包含其中一些PUL，并且很可能仅通过交叉喂养才能实现碳水化合物的进一步降解。

BOX 2. Susc和SusD：定义多糖利用位点。

多糖利用位点(PUL)是编码碳水化合物活性酶(CAZymes)、糖基结合蛋白、转运蛋白以及碳水化合物结合、裂解和输入所需的传感器和调控因子的基因组位点。在该基因位点内，SusC(一种外膜TonB依赖性转运蛋白)和SusD(一种表面聚糖结合蛋白)特别受关注。SusC和SusD对PUL功能都至关重要，删除任何一个都会导致PUL功能的大幅降低。因此，这两个基因的存在是革兰氏阴性PULs的典型标志。最近的结构表征表明，SusC和SusD在膜中结合。在所谓的“踏板箱”模型中(见图)，SusD在没有底物的情况下充当SusC上的灵活铰链盖，暴露了SusC中的结合位点。一旦底物在SusC内结合，SusD盖就会关闭，并且底物可以以TonB依赖性方式通过SusC进入周质。最近，PUL的定义已经扩展到包括缺乏SusC/D对的革兰氏阳性菌中的类似基因簇。

图2 B. thetaiotaomicron消化α-甘露聚糖的机制。由Cuskin等人首次描述的Bacteroides thetaiotaomicron降解的概述。简而言之，一些细胞表面定位的碳水化合物活性酶(CAZymes)在外膜启动α-甘露聚糖的降解。然后SusC/D样蛋白将寡糖导入周质。运输到周质后，各种酶进行完全降解。为清楚起见，酶被表示为Pac-Man形状，而那些附着在膜上的则是表面相关脂蛋白。插入：提出的糖苷水解酶GH99家族进行α-甘露聚糖降解第一步的化学机制。

1.3 宿主聚糖降解 粘蛋白O-聚糖。

在宿主和微生物之间的界面处，覆盖在肠腔内的是一层粘液。这种粘膜衬里的主要成分是一种称为粘蛋白的蛋白质家族，它们被O-聚糖和少量的N-聚糖密集糖基化。从人类的角度来看，厚粘液层作为抵御细菌感染的屏障。从细菌的角度来看，它作为一个附着点来维持它们在流动的胃肠道中的位置并作为营养源，尤其是在膳食碳水化合物有限的时候。事实上，对于以粘液层为中心的微生物群和宿主之间的相互作用知之甚少，因此，以一种有点矛盾的方式，Akkermansia muciniphila和B. thetaiotaomicron等共生菌对粘液的降解可诱导宿主合成粘液并增厚粘膜内膜。 粘膜碳水化合物结构的复杂性，具有许多不同的单糖成分、糖苷键和修饰，可能是细菌穿透粘膜的重要障碍。尽管如此，一些细菌确实实现了这一点，通常是通过分布在许多糖苷水解酶家族中的大量酶，以及硫酸酯酶等辅助酶(图3a，b)。相比之下，，膳食多糖(如淀粉)进化成易于降解的，其复杂性较低，协调降解所需的酶也较少。即使是专门的粘蛋白降解剂也常常针对相对较少的结构，也许是为了限制基因组维护和酶表达的能量消耗。有趣的是，粘蛋白的N-聚糖和O-聚糖共享某些结构基序，这些基序使它们自身能够被相同的酶分解，并诱导相同的PULs。Crouch等人在B. thetaiotaomicron中发现了GH16内切-β-半乳糖苷酶，该酶裂解聚-N-乙酰乳糖胺(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)结构，这是O-聚糖、N-聚糖和硫酸角质素的共同结构(图3a)。这些GH16家族成员可以适应这些不同聚糖结构上的许多修饰和装饰。似乎只有在这些延伸的装饰物最初裂解并穿过外膜运输之后，周质酶的联合体才能去除这些修饰。 最近，人们对称为O-糖蛋白酶的一类酶越来越感兴趣。顾名思义，这些蛋白酶对O-糖基化蛋白质具有严格的特异性，对底物聚糖结构和氨基酸序列都有要求。O-糖蛋白酶具有不同的特异性，其中一些对粘蛋白结构域(通常称为粘蛋白酶)具有更高的活性，而另一些对粘蛋白以及密度较低的糖基化蛋白具有活性。Pluvinage等人最近的结构表征已经展示了来自产气荚膜梭菌的O-糖蛋白酶ZmpB的多域结构如何专门用于粘蛋白降解。特别是，ZmpB的CBMs似乎是间隔的，使得它们几乎完全匹配粘蛋白高度糖基化结构域的周期性，同时将催化结构域放置在粘蛋白底物暴露更多的区域附近。在PUL中也发现了O-糖蛋白酶，并且可能在营养获取中发挥作用。在这种情况下，细胞表面粘蛋白的裂解是由O-糖蛋白酶而不是内切糖苷水解酶进行的，从粘蛋白中产生大的糖肽用于随后的摄取和代谢(图3b)。 

N-聚糖。N-连接聚糖的添加是在细胞外和细胞表面蛋白上发现的最常见的翻译后修饰之一。N-聚糖在宿主上皮表面的普遍存在可能为能够降解和代谢这些聚糖的微生物提供营养优势。Briliūtė等人的研究揭示了拟杆菌用于降解复杂N聚糖的广泛酶学机制。B. thetaiotaomicron作为对生长在作为唯一碳源的N糖蛋白上的反应，其上调了来自6个位点上不同家族的19个CAZyme。这种广泛的机制提供了许多结构多样的复杂N-聚糖。 如图3c所示，N-聚糖的初始胞外降解涉及一系列糖苷水解酶，包括内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ENGases)，以及来自新建立的GH163家族的细胞外唾液酸酶和内切糖苷水解酶。主要来自GH18和GH85家族的ENGase负责通过核心糖序列的壳二糖核心(GlcNAc-β1–4GlcNAc)内的裂解来初始释放聚糖。ENGases遵循底物辅助机制(图3c)，这与BOX 1中描述的典型Koshland机制不同。简而言之，2-乙酰胺作为催化亲核试剂形成关键的糖基恶唑啉中间体，然后水解与立体化学的整体净保留。ENGase通常非常具体。例如，来自B. thetaiotaomicron的BT3987在寡甘露糖型N-聚糖的壳聚糖核心内裂解，但对复杂的N-聚糖保持无活性。 核心四糖和其他N-聚糖衍生的寡糖在转运到周质和细胞质时发生降解。在周质中，一系列CAZymes、硫酸酯酶和酯酶进一步将寡糖降解为单糖和二糖，然后将其转运到细胞质中。最近的研究揭示了N-聚糖衍生双糖的细胞质降解。例如，在B. thetaiotaomicron中，GH130糖苷磷酸化酶(BT1033)裂解N-聚糖核心四糖降解后产生的Manβ-1,4-GlcNAc二糖，生成α-Man-1磷酸(α-Man1P)和GlcNAc。这种在拟杆菌中似乎很普遍的策略使α-Man1P能够进入糖酵解，同时通过己糖激酶避免ATP的消耗。放线菌在包括肠道在内的各种环境中采用的另一种策略是利用GH5(18亚家族)水解相同的连接。 

糖胺聚糖。上皮细胞衍生的糖胺聚糖代表了人类肠道微生物群复杂碳水化合物的可靠来源(图3d)。来自B. thetaiotaomicron的PULHep编码降解硫酸乙酰肝素以及结构相关肝素所需的几个基因。PULHep含有四种多糖裂解酶，一种磺胺酶和一种GH88Δ4,5-葡萄糖醛酸酶，以及一个共同调节的O-硫酸酯酶，用于解聚肝素和硫酸乙酰肝素。肝素和硫酸乙酰肝素降解为寡糖是由表面定位的多糖裂解酶PL12(BT4662)引发的，该酶在低硫酸化区域表现出优先裂解。与糖苷水解酶相比，多糖裂解酶具有不同的机制。糖醛酸的C-5位羧酸的存在促进了E1cb的逐步机制，包括C-5的去质子化和通过消除从C-4到相邻糖的键断裂，导致形成4,5-不饱和低聚糖产物(图3d)。 在将释放的寡糖转运到周质后，除了几种硫酸酯酶外，其他三种不同特异性的多糖裂解酶会产生4,5-不饱和二糖，它们本身就是来自GH88家族的葡萄糖醛酸水解酶(BT4658)的底物。BT4658裂解4,5-不饱和糖醛酸和GlcNAc(或GlcN)之间的连接，产生进一步代谢的单糖产物，从而导致共生细菌完全降解目标糖胺聚糖。GH88家族(以及GH105)的酶采用非Koshland机制，包括双键水合和生成的半缩酮自发分解，导致糖苷键断裂(图3e)。B. thetaiotaomicron对硫酸软骨素、硫酸皮肤素和透明质酸的代谢采用了类似的策略。

图3 拟杆菌降解宿主聚糖。a,b糖苷水解酶GH16家族内切半乳糖苷酶(a部分)或粘蛋白酶(b部分)可以通过产生大的寡糖或糖肽用于摄取和进一步解聚来启动粘蛋白消化。c来自Bacteroides thetaiotaomicron的一系列碳水化合物活性酶(CAZymes)催化复杂N-聚糖的分解(顶部)。GH18和GH20家族使用的底物辅助机制(下)。d 糖胺聚糖硫酸乙酰肝素的降解(顶部)。多糖裂解酶的作用机制(底部)。e GH88和GH105家族在处理由多糖裂解酶产生的4,5-不饱和寡糖时使用的简化机制。 

1.4 葡萄糖醛酸化：将CAZymes与药物代谢联系起来

越来越明显的是，肠道微生物群可以在药物代谢中发挥重要作用。为了灭活和增加某些外源物质和内源物质的溶解度，人类糖基转移酶1(GT1)UDP-葡萄糖醛酸转移酶通过单个SN2置换将β-葡萄糖醛酸部分共价连接到小分子上可用的OH、NH或SH(甚至活化的CH)功能上，如图4所示。然后这些葡萄糖苷酸被排泄到胃肠道中进行处理。然而，某些肠道细菌可以使用这些葡糖苷酸作为碳源，通过使用β-葡糖醛酸酶(GUS)(主要属于CAZy家族GH2)释放葡糖醛酸，从而重新激活该化合物。在许多情况下，这种重新激活已被证明会导致毒性作用，一个显著的例子是使用伊立替康治疗癌症引起的严重腹泻。 肠道微生物群中GUS酶的结构表征和活性分析揭示了不同的活性位点结构，它们对活性和底物范围有显著影响。特别是，GUS活性位点内两个特定环的存在与否可导致酶对非极性小分子或含葡萄糖醛酸的糖胺聚糖具有特异性。现在重点在于识别能重新激活麻烦的共轭药物的特定酶，以及开发特定抑制剂，这些抑制剂可以与这些药物共同给药以选择性地关闭它们的再激活，从而减轻副作用。这些GUS酶的不同活性位点结构为选择性抑制剂的设计提供了希望。

图4 小分子葡萄糖醛酸化和细菌gUS的再激活。a 在人体肝脏中UDP-葡萄糖醛酸转移酶通过葡萄糖醛酸化使小分子失活。在大肠中，微生物β-葡萄糖醛酸酶(GUSs)可以重新激活这些化合物。b 选择已知被葡萄糖醛酸化的分子。注意，SN-38是抗癌药物伊立替康的活性代谢物。 

2 疾病和微生物群

大多数病原体不能与常驻微生物群竞争碳水化合物食物来源，因此在正常条件下被有效地排除在肠道之外。因此，肠道生态系统的破坏似乎在病原菌的建立中具有重要作用。例如，抗生素治疗会破坏粘蛋白降解菌和非粘蛋白降解菌之间的交叉喂养网络，并允许诸如鼠伤寒沙门氏菌和艰难梭菌等病原菌的增殖。在这种情况下，缺乏宿主聚糖降解酶的病原体将清除宿主释放的游离单糖。新生态位的引入也可能导致生态失调。例如，海藻糖是一种二糖(Glcα1–1αGlc)，在过去20年中才大规模引入西方饮食。与它的引入并行的是艰难梭菌感染的发病率增加以及流行菌株增强海藻糖利用机制的演变。 尽管大多数共生细菌被归类到外黏膜层，但在感染期间，病原体必须经常穿过黏膜屏障。为此，细菌和病毒病原体表达糖苷水解酶，分解肠道和气道中的粘膜聚糖。微生物粘附素、凝集素和CBM通常协助这一过程，它们赋予细菌附着在粘膜上的能力，从而定位降解的CAZymes。微生物还可以利用具有凝集素活性的宿主表达蛋白质。在这方面，人类分泌三叶因子蛋白，它与粘蛋白上的GlcNAc-α1,4-Gal disaccha结合。这种结合有助于寡聚化粘蛋白，增加粘液的粘弹性。幽门螺杆菌已经进化出类似的Glc-α1,4-Gal二糖表位，它与三叶因子结合，进而可能有助于幽门螺杆菌与肠道粘蛋白的结合。许多细菌还表达裂解该表位的CAZymes，从而有效地消除三叶结合并可能削弱粘膜屏障。 许多CAZymes在感染期间参与逃避宿主免疫反应。最著名的例子可能是糖基转移酶，它合成宿主聚糖模拟结构以帮助病原体逃避检测为非自身。特别是，病原体上唾液酸的存在通常有助于欺骗免疫系统。参与免疫反应的分子的酶促分解是病原体使用的另一种策略。例如，铜绿假单胞菌、Acinetobacter nosocomialisM2和其他病原体中的O-糖蛋白酶通过降解参与免疫功能的糖蛋白来促进感染。同样，在感染过程中，来自 Streptococcus pyogenes 的GH18 ENGase从宿主IgG分子中切割N-聚糖，从而降低IgG对Fc受体的亲和力，促进S. pyogenes的存活。血清中用作能源的N-聚糖降解也被证明在感染期间为脆弱拟杆菌提供能量。 

3 CAZymes的应用

3.1 用于生物治疗生产的细菌糖基化系统 

来自人类肠道微生物群的糖基转移酶是糖生物学中有价值的工具。与真核生物相比，细菌糖基转移酶通常更容易在大肠杆菌中表达，并且对底物没有如此严格的要求。此外，由于许多细菌合成模拟人类糖基化的多糖(以逃避免疫)，细菌糖基转移酶可用于合成具有真核糖基化模式的糖蛋白。例如，细菌唾液酸转移酶能够产生具有延长半衰期的治疗性糖蛋白。 细菌寡糖基转移酶(OST)是一类有趣的生物医学应用的酶。在生理上，这些酶负责将脂质连接的寡糖整体转移到许多病原体的细胞外蛋白中。有趣的是，在空肠弯曲杆菌中产生N-连接聚糖的OST识别出与真核OST相似的基序并具有相似的折叠。然而，与它们更复杂的多亚基真核对应物相比，细菌OST非常混杂，可以通过对蛋白质受体的最低识别要求(通常只需要在C-2位置有一个乙酰胺基团)。在自然界中，合成脂质连接的寡糖供体所需的糖基转移酶通常以基因簇的形式出现，这些基因簇可以通过适当的OST转移到大肠杆菌中以实现合成糖蛋白携带通常在脂多糖中发现的寡糖。此类系统已被设计用于糖缀合物疫苗的开发和生产。通过引入非天然基因簇，这些相同的OST还可以转移选择的非细菌聚糖。有趣的是，这使得能够在大肠杆菌中产生类似人类的N连接和O连接聚糖。如果它们要成为在大肠杆菌中生产治疗性糖蛋白的可行方法，就需要进一步的研究来提高这些酶的产量和底物范围(在许多情况下，它们只作用于蛋白质的高度灵活的区域)。事实上，在糖基化途径中混合真核和原核糖基转移酶似乎可能为生产糖蛋白治疗剂提供最佳途径。 

3.2 用于微生物群操作的人乳寡糖的合成 

鉴于肠道微生物群在人类健康中的关键作用，人们对开发操纵它的方法产生了浓厚的兴趣也就不足为奇了。为此，已经开发了使用饮食干预、药物和益生元的方法。碳水化合物代谢和微生物组组成之间的紧密联系使得补充碳水化合物成为一个明显的选择。 双歧杆菌在婴儿肠道微生物群中自然富集。人乳含有多种聚糖结构，统称为人乳寡糖(HMO)。人类缺乏HMO降解所必需的酶。HMO富含能够降解它们的有益微生物，主要是双歧杆菌，因此，HMO被建议作为婴儿配方奶粉的添加剂，以丰富奶瓶喂养婴儿的微生物群。然而，与许多膳食多糖不同的是，HMOs不能轻易地以工业规模从天然来源获得。商业化生产HMO最成功的方法，例如2'-岩藻糖基乳糖(Fuc-α1,2-Gal-β1,4-Glc)，通过将来自肠道细菌(通常是幽门螺杆菌)的糖基转移酶加入到主力微生物，通过发酵进行大规模生产。以这种方式生产的2'-岩藻糖基乳糖现在已被纳入全球众多婴儿配方奶粉中。

发酵合成HMO的补充方法包括体外方法，该方法将来自肠道细菌的糖苷水解酶重新用于聚糖合成而不是降解。一个很好的例子是，在多酶反应中，使用来自双歧杆菌的糖苷磷酸化酶从蔗糖和游离GlcNAc中以千克为单位合成乳糖-N-二糖(LNB;Gal-β1,3-GlcNAc)。最近的研究突出了糖合酶技术用于工业规模合成HMOs的潜力。最初的糖合酶概念由Withers及其同事于1998年引入。基本原理依赖于糖苷水解酶催化残基的突变，使其不能降解其天然底物(图5a，b)。当这种失活的突变体呈现与其天然底物相反异头构型的活化糖基供体时，这些在糖基化反应中被接受为底物并且可以形成寡糖和其他糖缀合物。与糖基转移酶(用于聚糖合成的天然酶)相比，使用糖合酶的主要优势之一是它们不需要使用昂贵的核苷酸糖底物。多年来已经开发了许多糖合酶的变体，但基本原理保持不变。Nidetzky研究小组使用糖合酶设计了生产乳-N-丙糖(GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)和乳-N-四糖(Gal-β1,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的合成路线，具有良好的产率和选择性(图5c)。他们的方法主要依赖于B. bifidum GH20酶的突变体，其通常催化HMOs的分解。这些酶可以使用容易制备的GlcNAc和LNB的恶唑啉衍生物作为聚糖供体，而乳糖作为廉价的聚糖受体。

图5 来自肠道微生物组的酶的应用。a,b 糖合酶概念最初由Withers及其同事提出(a部分)，并根据底物辅助机制适应酶(b部分)。c 遵循糖合酶概念，使用双歧杆菌酶生产的人乳寡糖(HMOs)。d 使用内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(ENGase)进行N-聚糖重塑的一般方案。e 最近两种使用碳水化合物活性酶(CAZymes)从A型生成O型血的方法。插入：糖苷水解酶GH109家族用于从A抗原切割末端GalNAc的机制概述。 

3.3 用细菌酶重塑聚糖

在许多药物应用中，产生均质、明确的抗体和其他治疗性蛋白质的糖链异质体的能力是非常可取的，因为它能够评估特定聚糖结构对生物制药疗效、安全性和功能的影响。这些结果突出了聚糖重塑工作的重要性。一种生成明确糖链异质体的方法是使用野生型ENGase(GH18或GH85)及其各自的糖合酶突变体，通过激活底物对糖蛋白进行体外重塑，以选择性地安装N-聚糖结构。首先，使用野生型ENGase对糖蛋白进行去糖基化，在靶蛋白上留下一个GlcNAc柄。然后，ENGase糖合酶突变体可使用活化的恶唑啉供体将N-聚糖结构连接到该存根上，其很容易从游离寡糖中产生(图5b，d)。来自GH18和GH85家族的细菌内切糖苷酶在聚糖重塑中特别有效，并已用于生成众所周知的治疗性抗体的明确糖链异质体，包括重磅抗癌药物赫赛汀和利妥昔单抗。目前，这种方法主要局限于在一个位点或具有相同糖型的多个位点上修饰单个糖型。 然而，Wang及其同事最近的研究充分证明了Fc和Fab结构域的聚糖结构是如何通过利用ENGase和来自干酪乳杆菌的α-1,6-岩藻糖苷酶的高选择性性质而差异化引入的。通过这种方式，作者生成了西妥昔单抗的工程糖型，其功效是非工程糖型的八倍。类似的方法也被用于编辑细胞表面的聚糖。另一种提高选择性的方法是通过使用细菌糖基转移酶将N-连接GlcNAc和(假真核)Glc柄引入蛋白质。将这些引入的手柄与ENGase糖合酶技术一起使用，为N-聚糖的位点选择和结构选择安装打开了大门。显然，该技术还处于早期阶段，生物制药重塑需要一个扩展的ENGases和其他酶工具包，以实现更复杂的合成聚糖结构，并提供位点选择性。人类肠道微生物组是寻找针对宿主聚糖的内切糖苷水解酶以用于聚糖重塑的理想场所，因为它包含了细菌遗传多样性的巨大储存库。肠道细菌在降解前倾向于切割和导入整个寡糖，这使得发现新的内切糖苷水解酶极有可能。事实上，最近的研究强调了从人体肠道微生物组中发现对宿主聚糖(如粘蛋白)有活性的内切糖苷水解酶的潜力。特别值得注意的是发现了降解宿主聚糖中常见的重复LacNAc结构的酶，以及从蛋白质和细胞表面切割完整的唾液酸-T抗原(一种普遍存在的O-聚糖)的酶。 

3.4 通用血液生产

输血是医疗保健系统不可或缺的一部分，每年挽救数千人的生命，但必须非常仔细地关注供体和受体的ABO血型。ABO血型系统以一组相关的碳水化合物为基础，这些碳水化合物附着在红细胞表面的糖蛋白和脂质上。基本结构是H抗原(赋予O型血)的结构，B型和A型抗原分别通过用α-半乳糖或α-N-乙酰半乳糖胺修饰而衍生该结构。O型细胞对绝大多数人来说是非抗原性的，可以捐献给A型、B型或AB型以及O型血的人，因此被称为万能供体型。因此，O型血在紧急情况下尤为重要，并且经常供不应求。 Goldstein等人在1982年首次提出使用糖苷酶去除B型和A型血的α-半乳糖或α-N-乙酰半乳糖胺残基以生产通用供体O型血，并在最初的试验中被证明是B型血转换为O型血的有效策略。然而，这些研究使用了来自生咖啡豆的低效α-半乳糖苷酶，需要不利的条件和大量的酶才能成功地进行血型转换。2007年，Liu等人取得了重大进展，发现了分别作用于A和B抗原的GH109和GH110家族。这些酶在比咖啡豆α-半乳糖苷酶低得多的酶负荷和更有利的条件下发挥作用。奇怪的是，GH109被提议遵循一种非常规的反应机制，类似于首次证明的GH4家族酶。在这种机制中，酶使用紧密结合的NAD+辅因子进行一系列化学步骤(氧化、消除、添加和还原)以实现末端GalNAc的净水解，如图5e所示。 为了确定更适合的酶，我们最近筛选了人类肠道微生物组中能够降解血型的酶。人类肠道的粘液层包含聚糖结构，包括A、B和H抗原。因此，定殖在肠道中的细菌似乎很可能产生能够降解血液抗原的酶。这项工作产生了一对高活性的CAZymes，即一种碳水化合物酯酶和一种来自Flavonifractor plautii细菌的GH36半乳糖胺酶，它们协同作用以去除A抗原的末端N-乙酰半乳糖胺(图5e)。该酶胜过任何先前已知的A抗原切割酶，并可能提供一种更可行的生产通用供血的方法。这样的结果进一步强调了人类肠道微生物组中存在的大量有价值的酶活性，并预示着许多尚未被发现的酶活性。

结论

了解人类肠道微生物群中存在的CAZymes的多样性将促进我们对人类与微生物自身之间密切关系的理解，并为可用于各种目的的酶提供新的见解。然而，尽管迄今为止做出了很多努力，但我们才刚刚开始挖掘人类肠道微生物群中CAZyme多样性。对碳水化合物如何在肠道微生物群中分配的进一步研究将提供有关膳食碳水化合物如何影响我们整体健康的见解。尽管有大量关于肠道细菌的序列信息，但我们仍然不知道存在的大多数基因的功能。未来的研究可能会使用超高通量功能筛选方法对此类酶活性进行分类。此类酶及其工程糖合成突变体可用于定制生物药物的糖基化以提高疗效，甚至可以促进我们对聚糖的基本作用的理解。