科研丨Nature子刊(IF:30.9): 微生物群落形成丰富的细胞外代谢组, 促进代谢相互作用并提高药物耐受性

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

微生物群落由具有不同代谢能力的细胞组成，通常包括缺乏必要代谢途径的营养缺陷型。通过分析来自地球微生物组计划(EMP)的一部分而获得的12000多个天然微生物群落的微生物组数据中氨基酸生物合成途径的营养缺陷型，以及自我建立的代谢合作酵母群落(SeMeCos)中营养缺陷型-原养型相互作用的研究，研究者揭示了一种代谢印迹机制，这一机制将营养缺陷型的存在与代谢相互作用的增加和抗菌药物耐受性的提高联系起来。由于摄取特定代谢物所必需的代谢适应，营养缺陷型的代谢通量分布改变降低了细胞内药物浓度，使细胞能在药物浓度高于最低抑制浓度的情况下生长。例如，我们发现在从代谢丰富的环境中摄取代谢物的酵母细胞中，唑类药物的抗真菌作用大大减弱。因此，本研究的结果提供了一种可解释为什么细胞在代谢相互作用时对药物暴露抵抗力更强的机制。

论文ID

原名：Microbial communities form rich extracellular metabolomes that foster metabolic interactions and promote drug tolerance

译名：微生物群落形成丰富的细胞外代谢组，促进代谢相互作用并提高药物耐受性

期刊：Nature Microbiology

IF：30.964

发表时间：2022.3

通讯作者：Markus Ralser，Mohammad Tauqeer Alam

通讯作者单位：英国弗朗西斯·克里克研究所；阿联酋大学

DOI号：10.1038/s41564-022-01072-5      

实验设计

结果

1.氨基酸营养缺陷型在自然群落中普遍存在    

利用来自EMP的物种组成数据，我们分析了独立生存和宿主相关的自然群落中营养缺陷型的频率。我们使用Machado等人描述的方法确定了营养缺陷的发生。对EMP 数据集中＞12000个群落的研究表明，独立生存和宿主相关的群落都包含高频率的氨基酸生物合成途径的营养缺陷型物种。事实上，数据显示（氨基酸）营养缺陷型的存在几乎是微生物群落的普遍特征。该数据集中的12538个群落中仅有6个不含氨基酸营养缺陷型，而一个群落中不包含单个例子。此外，许多群落中都包含高频率营养缺陷型，特别是在宿主相关的群落中，我们观察到相对于原养型微生物，营养缺陷型物种的丰度特别高（45.55% vs 25.88%在独立生存的群落中；图1a）。我们推测宿主相关的物种暴露于丰富的营养环境中，这可能解释了为什么营养缺陷型更占优势。

图1 营养缺陷型在宿主相关微生物群落中普遍存在，且更具抗药性。

a，在EMP中测序的<12000个微生物群落中氨基酸营养缺陷型物种的频率。虚线表示给定微生物群落中1:1的营养缺陷型/原养型微生物(A:P)比率。b，在暴露于1197种生物活性药物的40种肠道微生物中检测到的氨基酸营养缺陷型的数量为15。c，以AUC代表药物暴露微生物组物种中原养型和营养缺陷型间的生长。微生物-药物对根据40种药物暴露微生物物种生长的强(AUC > 0.2)、弱 (0.9 > AUC > 0.2) 和无影响 (AUC > 0.9) 进行分类。d, SeMeCos，一种用于研究营养缺陷型亚群的基于酵母的等基因模型。e，上，左下：SeMeCo菌落暴露于900种FDA批准的药物。z值的PCA，评估其对群落组成的影响。分层聚类确定了影响A:P比率的两个药物簇（黄色和灰色）。箭头表示由营养缺陷型亚群驱动的方差。右下：PCA鉴定的强唑类药物的肠道微生物组AUC值的子集。f，基于最高z值的药物治疗SeMeCos内的A:P比率。这些药物的分类基于已知的靶点/活性。g，用不存在于e中的唑类/他汀类药物治疗的SeMeCos的成分分析。A:P比率的变化以红色和蓝色突出显示。数据为一个独立实验中n=3 次技术重复的中位数。h，药物治疗后原养型和营养缺陷型亚群的比例。使用双边t检验确定显著性，* P< 0.05, ** P< 0.005，**** P< 0.00005。    

2.氨基酸营养缺陷型不易受药物影响    

同样，与宿主相关的群落更频繁地暴露于生物活性药物，包括那些针对人类、真菌或细菌细胞的药物，这些药物可影响宿主微生物组的组成。为了测试营养缺陷型是否会对这些药物反应产生任何影响，我们利用了暴露于1197种生物活性药物的40个肠道微生物组成员的生长数据。为确定这40个肠道微生物组物种中营养缺陷型物种的存在，我们使用了相同的预测器，发现40个物种中有15个（37.5%）在12种氨基酸生物合成途径中的确存在营养缺陷型（图1b）。单个物种最多同时拥有7种氨基酸营养缺陷型，在不同组合中大多数具有1到4种。为说明药物对微生物物种生长的影响，我们将其分为三类：(1) 应用药物对生长的强烈影响（n=3100药物-微生物对，单侧Wilcoxon秩和检验，错误发现率(FDR)校正P=5.4×10–9；(2) 药物对生长的弱影响（n=5461药物-微生物对，单侧Wilcoxon秩和检验，FDR校正P =2.0 × 10–15）；(3) 药物对生长没有影响(n =39264药物-微生物对）。我们使用从生长曲线中获得的平均曲线下面积(AUC)值的差异，其中对于Maier等人描述的“无生长效应”类别，AUC值被归一化为1 (图1c)。与原养型微生物相比，营养缺陷型通常在所选药物存在的情况下生长得更好（表现为更高的AUC值）。在8561种药物-微生物组合中检测到营养缺陷型的生长较原养型强（图1c）。虽然其他药物对营养缺陷型没有影响（图1c，底部），但我们并未发现一种药物类别会使营养缺陷型较原养型处于劣势。营养缺陷型的作用在对生长有抑制作用的药物组中最为普遍，但在对生长没有普遍影响的药物组中则不明显，这表明氨基酸营养缺陷型可以缓冲生长抑制药物治疗的影响（图1c）。特别是，氨基酸营养缺陷型对靶向细菌、真菌和原生动物的药物更具抗性（Wilcoxon秩和检验；图1c）。    

3.代谢合作的营养缺陷型更具耐药性    

对于广谱的药物类型和靶标，观察到药物暴露后与原养型相比营养缺陷型的生长改善。这一发现暗示了一种将氨基酸营养缺陷与微生物药物反应联系起来的普遍的、与靶标无关的机制。为了阐明这种机制，我们寻求一种易于处理的等基因模型，在该模型中药物耐受性的差异很容易直接归因于营养缺陷型突变。SeMeCos代表了一种可追踪营养缺陷型亚群并详细剖析营养缺陷型-原养型相互作用的酵母模型。在SeMeCos中，单个原养型生成细胞的随机质粒丢失会产生一个营养缺陷型和原养型微生物组成的群落，其中营养缺陷型的生存和生长需要氨基酸（组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸）和核碱基（尿嘧啶）的交换（图1d）。新兴的营养缺陷亚群可以被追踪，因为SeMeCos菌落呈指数增长，通过在适宜培养基上生长来检测营养缺陷，或者将分离的代谢标记物与荧光蛋白偶联并通过显微镜和荧光激活细胞分选(FACS)识别营养缺陷。在本研究中，SeMeCos具有与肠道微生物物种相似数量的营养缺陷型，并且受影响的途径相似：15种营养缺陷型肠道物种中的13种以及SeMeCos在不同组合中具有1到4种氨基酸营养缺陷。    

为了研究SeMeCos中的营养缺陷型是否复制了在细菌营养缺陷型中观察到的对药物暴露增加的稳健性，我们首先生成了一个SeMeCos菌株，该菌株与经密码子优化以在酵母中表达的荧光蛋白共表达原养型标记酶His3p、Leu2p、Met15p和Ura3p。然后，我们通过连续定位从原始菌株中建立SeMeCos群落，并将它们暴露于包含900种不同的FDA批准药物的化合物库中，这些药物在许多药理学筛选中的典型浓度为10 μM。在这些药物中有240种也在肠道微生物群中进行测试，其中179种具有生长抑制作用。在基本综合培养基中培养细胞 24小时后，我们使用高通量荧光成像来确定培养物的营养缺陷型组成。对于每种药物条件下的每个营养缺陷亚群，指定了一个z值来反映与赋形剂对照(DMSO)群体中位数的偏差程度。原始值的主成分分析（PCA）和前两个成分的层次聚类显示出三个集群（图1e）。集群1包含对SeMeCos组成没有影响的赋形剂对照（DMSO）和药物治疗，与集群2和3相反，这主要反映了与营养缺陷的数量或类型无关的营养缺陷增加（图1e，箭头）。有助于集群2和集群3的大多数药物都是抗微生物/抗真菌化合物，并且在集群2药物的一个子集中，营养缺陷型在肠道微生物组药物筛选中也表现出生长改善（图1e、f）。值得注意的是，营养缺陷型对唑类药物治疗的稳健性（SeMeCos药物筛选中的10/42药物），这是一类临床用于治疗真菌感染的化合物，靶向麦角甾醇生物合成途径（图1e；Wilcoxon秩和检验, P=5.3×10–4）。为在独立实验中测试这一发现的普遍性，我们将SeMeCos暴露于属于唑类和他汀类的其他化合物（另一组影响酵母中麦角甾醇生物合成途径的化合物）。随后我们通过流式细胞术测定了SeMeCos营养缺陷型组成的变化。在两个独立实验中，与赋形剂对照（DMSO）相比，暴露于这两种药物类别的SeMeCos营养缺陷型亚群的数量显著增加（图1g，h）。为排除由于质粒分离或稳定性改变导致药物反应变化的可能性，这也会影响SeMeCos中营养缺陷型亚群的比例，我们用另一种可供选择的着丝粒质粒(MitoLoc)转化野生型(WT)细胞，使得选择不是通过营养缺陷型而是通过抗生素诺尔丝菌素。此外，我们还测试了四种标记基因基因组整合的酵母菌株的耐药性。对比WT（无质粒）、SeMeCos（四种质粒）以及基因组整合菌株，我们观察到对烯效唑或咪康唑的生长反应没有显著差异，这表明观察到的影响不能用药物对质粒分离或稳定性的影响来解释。综上所述，这些结果表明，营养缺陷在细菌以及同基因酵母菌株中都增加了对广泛的生物活性化合物的耐药性，特别是唑类抗真菌药和他汀类药物。    

4.丰富的代谢环境促进药物耐药性    

利用通量平衡分析(FBA)构建酵母基因组规模的代谢模型，以绘制由营养缺陷型引入的群落代谢变化。为解释细胞间氨基酸和尿嘧啶的交换，我们扩展了传统的FBA方法，包括来自共享外代谢组的输出和输入反应，因此该模型反映了不同代谢型（代谢背景）之间的代谢相互作用，特别是在共同生长的营养缺陷型和原养型生物之间（图2a，左）。群落模型的主要目标函数是营养缺陷型和原养型的累积生物量。分析表明，从自身合成到摄取组氨酸(H)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和/或尿嘧啶(U)的变化不仅影响四种受干扰的生物合成途径，而且还影响与之耦合的其他广泛代谢通量。有趣的是，在共同环境下营养缺陷型与原养型相互作用的网络重建的比较表明，总体而言，随通量增加（通量变化>10％）营养缺陷型具有更多的反应。同样，原养型生物中通量的减少更广泛（t检验，P=7×10–4）（图2a）。此外，与原养型生物相比，营养缺陷型释放的代谢物谱增加（图2a）。然后我们应用扩展的FBA方法，评估交换所有四种代谢物（H、L、U、M）SeMeCos的细胞间通量变化，并在原养型微生物和15种营养缺陷型组合之间进行成对分析。我们发现营养缺陷型的数量与通量改变的代谢途径百分比呈正相关（通量变化>10％）。同时，我们利用FBA和最小化代谢调节(MOMA)方法在基本培养基中模拟了单个营养缺陷型菌株，并补充了所需的代谢物。FBA预测营养缺陷型的生长速度更快，而MOMA则与群落扩展的FBA类似，预测代谢物分泌增加。    

为了通过实验检验这些预测，我们测试了增长率和外代谢组的变化。为了解决前者，我们设计了一个在单个质粒(pHLUM)上携带四个标记基因的SeMeCos原始菌株。由于该菌株不能区分分离标记，其后代要么保持原养型，要么同时变成四种代谢物的营养缺陷型。然后，我们通过监测随时间推移的SeMeCos组成，在基本培养基上进行了竞争性生长实验。原养型（pHLUM）菌株缓慢但始终为优势种群，每2天将其连续移植到固体基本培养基上，约3周（约250代）后在SeMeCos中占主导地位。原养型菌株承担了整个群落的H、L、U和M的合成，所以在共同代谢环境中的原养型菌的生长速度较营养缺陷型有小幅度但可观的提高。 

随后我们采用基于高灵敏度的靶向液相色谱选择反应监测(LC-SRM)的代谢组学方法来测量细胞团块以及原养型WT和SeMeCos周围的外代谢组中氨基酸和尿嘧啶的浓度（图2b)。我们发现，尽管群落仅能交换四种代谢物（H、L、U和M），但其在细胞内和细胞外代谢组中都表现出广泛的代谢物浓度变化。SeMeCos中三分之二的细胞是H、L、U或M营养缺陷型（图2c），20种细胞外代谢物浓度（氨基酸和尿嘧啶）中有14种显著增加（图2c）。总之，这些结果表明，营养缺陷型的存在广泛地改变了这些群落的代谢并导致更高的细胞外代谢物水平（图2c）。    

我们之前的结果表明，细胞至少会以比生长所需高得多的浓度输入细胞外氨基酸。这种代谢物的获得可以促进耐受能力。这种情况表明，观察到的外代谢组变化可能与药物稳健性增加有关。为了验证这一假设，我们在药物治疗下将WT细胞暴露于H、L、U和M，以支持生长的浓度提供这四种代谢物，导致营养缺陷型和原养型生物摄取速率相似，从而使它们的通量分布相似。然后在固体培养基中通过圆盘扩散试验(DDA)和在液体培养物中通过微量肉汤稀释试验评估MIC，以测量对唑类抗真菌剂的药物反应。在唑类药物存在的情况下，营养的补充显著增加了WT细胞的生长，在一定程度上唑类药物的生长抑制作用被消除了（图2d，e）。这种表型与补充剂的生长促进作用无关，因为在未处理对照组中AUC值没有显著变化。此外，WT细胞对唑类的耐受性和抗性以与生长速率无关的方式随补充代谢物浓度的增加而增加，证实了这一结果。综上，这些结果表明，营养缺陷型的存在导致外代谢组代谢物浓度的增加，进而增加了细胞对药物的耐受能力。

图2 营养缺陷型促进丰富的代谢环境，增加原养型的药物耐受性。

a，左：SeMeCos中由营养缺陷型和原养型亚群组成的基因组规模代谢模型（n=4，H/L/U/M群落模型）。与原养型相比，营养缺陷型代谢通量（左起第二个，P =7×10–4）、代谢物交换（右起第二个，P =0.02）和氨基酸交换（右，P  = 0.002）数量显著增加（变化 >10% ），显示为箱线图。b，由HIS3、LEU2、URA3和MET15（WT)的基因组修复产生的原养型群落与含有营养缺陷型的SeMeCos不同，这是因为含有四个营养缺陷型标记质粒的随机分离。c，左，中：与SM培养基中的WT培养物相比，在指数增长的SeMeCos中通过质谱对细胞内和细胞外代谢物进行定量。代谢物浓度被归一化为生物量，通过OD 600处的光密度评估。使用单侧Kruskal-Wallis秩和检验确定分组代谢物比较（箱线图）显著性。 使用未配对双侧Wilcoxon秩和检验确定单个代谢物比较（条形图）显著性：*P < 0.05，** P < 0.005，*** P < 0.0005，**** P < 0.00005。右图：通过在选择性培养基上定位菌落计算得出上述分析的SeMeCos中营养缺陷型和原养型的比例。 d，在分别用烯效唑或咪康唑处理的基本(SM)或SM + HLUM补充培养基中WT菌落中DDA测量的耐药性（抑制晕圈直径）和耐受性（晕圈内生长）。从SM或SM + HLUM和/或唑类的WT培养物中产生的DDAs。e，在烯效唑/咪康唑浓度增加和HLUM补充增加后通过OD 600评估WT酵母培养物的生长，并绘制AUC。    

5.原养型微生物代谢反应的相互作用    

一般来说微生物（尤其是酵母细胞）具有感知和摄取细胞外代谢物的能力。这种生物学环境特点表明代谢物浓度的改变（如在外代谢组中所测量的）（图2b）可能引发营养缺陷型乃至群落中所有细胞的代谢反应。我们生成的SeMeCos仅包含一个编码独立表达的增强蓝色荧光蛋白(eCFP)的分离质粒(pH、pL、pU或pM) (图3a)。然后我们通过FACS分离营养缺陷型和原养型并测量其蛋白质组。同时，我们测量了在其自身间生长的经同等处理原养菌的蛋白质组（即从原养WT酵母菌落中分离的类似处理的细胞）（图3a）。获得的蛋白质组数据证实，基于标记酶Leu2p、Met15p和Ura3p的表达，基于CFP的SeMeCos分选成功分离了营养缺陷型和原养型种群（在所有样品中His3p均低于检测限）。使用这种蛋白质组学方法，我们量化了典型酵母细胞表达的4000–5000种蛋白质中的约1500种，覆盖几乎全部蛋白质组中富含代谢酶的高丰度部分，包括Leu2p、Ura3p和Met15p。这些标记酶被鉴定为两个群体间表达差异最大的蛋白质（图3b）。差异表达蛋白质的基因集合富集分析和基因本体论(GO)分析表明，代谢关系或过程（特别是氨基酸生物合成）在差异表达的蛋白质中富集。与营养缺陷型相比，原养型中与FBA通量变化相关的多种酶（图2a）的表达水平较低（图3c）。此外，与FBA分析一致的是（图2a)，与原养型生物相比，营养缺陷型中具有更高预测通量的代谢途径（例如，V、L和I生物合成），包含许多在营养缺陷型中表达更高的酶。类似地，许多在原养型生物中预测通量较低的代谢途径也具有较高比例的表达下调的酶。总体而言，当将FBA分析的通量预测与蛋白质组学数据进行比较时，我们检测到根据条件44-64%的编码通量变化>10%的反应的酶也有差异表达。

总体而言，这些酵母代谢变化中约有一半可以通过酶丰度变化来解释，该结果表明通量的预测变化与蛋白质组的测量变化之间的一致性。随后我们直接比较了营养缺陷型存在情况下（即在SeMeCos环境中）与从全基因组原养型菌落（即WT群落）中分离出来的原养型的蛋白质组（图3d）。我们发现，与生长在原养型细胞之间的原养型细胞相比，在营养缺陷型存在条件下生长的原养型细胞中的酶表达（特别是涉及氨基酸生物合成途径的酶）显著不同（图3d）。值得注意的是，虽然在公共原养型细胞中更多的途径上调，但其他途径被下调，这表明原养型细胞贡献并消耗了SeMeCos中的代谢物。我们还观察到核糖体和其他生长调节蛋白的较高表达。这也与上述观察结果一致，即在没有抗真菌药物存在的情况下，原养型生物尽管承担了H、L、U和M的合成，但与SeMeCos相比保持较快的生长速度。

图3 原养型蛋白质组对营养缺陷型存在的反应。

a，营养缺陷型SeMeCos菌株中原养型基因组恢复及用CFP标记所示质粒的示意图。根据CFP表达对原养型和营养缺陷型种群进行分类。b，SeMeCos中分选的营养缺陷型与原营养型细胞的蛋白质组学分析；差异表达蛋白(DEP)如火山图所示。c，左上：SeMeCos中营养缺陷型相对于共生原养型的蛋白质组学分析。右上：参与氨基酸生物合成的差异表达蛋白质和代谢酶的总结。仅在b中显著差异表达的蛋白质之间进行比较，其中P < 0.05。底部：SeMeCos中相对于原养型营养缺陷型代谢酶的差异表达（log2FC），使用iPATH3映射到酵母代谢网络；n=4。d，左上：相对于自身生长的原养型细胞，从SeMeCos分离的原养型细胞的蛋白质组学分析。右上：氨基酸生物合成中差异表达蛋白质和代谢酶的总结。仅对在b中显著差异表达的蛋白质进行比较，其中P < 0.05。底部：与营养缺陷型细胞共生长(在SeMeCos中)的原养型细胞中酶的差异蛋白表达(log2FC)和原养型细胞（相对于在WT群落中自身生长的原养型细胞）的差异代谢酶表达，利用iPATH3映射到酵母代谢网络中；n=4。当P < 0.05时，蛋白质被认为是DEP。log FC<0或>0，分别为下调或上调。Abs，绝对值。    

6.高代谢物外排使营养缺陷型具有唑类耐受性    

细胞外代谢物的浓度取决于跨膜转运。在酵母菌中，氨基酸的输出在很大程度上是由具有广谱底物的代谢物转运蛋白驱动的，这些转运蛋白还负责药物和外源性物质的输出，包括唑类抗真菌药。事实上，引起抗真菌物质耐受性和抗性的机制是增加药物外排。如果更高的外排活性影响药物浓度，我们推测从营养缺陷型向群落空间氨基酸输出的增加（图2c)可能解释了对抗真菌物质的更高耐受性。我们首先探索了一个先前用于量化营养缺陷型对基因表达异位显性影响的转录组数据集。我们发现，与原养型相比，具有相关抗真菌活性（PDR5和SNQ2）的三个质膜ATP结合盒（ABC）转运蛋白中的两个在许多营养缺陷型中的表达水平更高。为了量化输出活性，我们随后将DiOC5(3)（一种用于监测一般输出活性的阳离子羰花青染料）应用于SeMeCos。DiOC5(3)被动扩散到细胞中，其输出依赖于ABC/MFS转运蛋白活性。因此，输出活性较高细胞DiOC5(3)的染色减少。我们使用与三种编码相同远红外TagRFP657蛋白的质粒互补的具有三种营养缺陷型（his3Δ、leu2Δ和met15Δ）的SeMeCos菌株，并通过流式细胞术评估了DiOC5(3)的荧光强度。在这种情况下，平均而言，营养缺陷与荧光强度成反比，荧光强度与每个细胞携带的质粒数量有关（图4a）。该实验使我们能够定量评估具有多个营养缺陷型的复杂SeMeCos系统中营养缺陷和染料摄取之间的关系。    

荧光标记和DiOC5(3)荧光水平呈正相关，表明原养型亚群较营养缺陷型亚群输出染料的速度更慢（Spearman秩系数=2.2×10–16，R=0.53）（图4a)。为证明确实是营养缺陷型输出染料更快，我们使用了单一的营养缺陷型、表达eCFP的SeMeCos菌株，用DiOC5(3)进行染色并通过荧光显微镜分析染料强度。这些分析还揭示了与原养型相比，营养缺陷型种群的平均相对荧光强度更低（图4b）。因此营养缺陷型维持较低的DiOC5(3)浓度，这表明与原养型相比其具有更大的输出活性。与此同时，我们试图确定药物对细胞大小的影响，在考虑改变药物抗性和/或转运的潜在机制时需要考虑到这一点。对SeMeCos药物筛选数据的重新分析表明，尽管某些药物会影响细胞大小，但大多数经测试的唑类药物并非如此。    

接下来，我们建立了一种LC-MS方法来量化唑类处理的SeMeCos分选的CFP–营养缺陷型和CFP+原养型中的烯效唑细胞内浓度。从四个群落中分类的营养缺陷型亚群的烯效唑细胞内浓度相对于原养型显著降低（图4c）。在每种情况下，营养缺陷型的唑类水平都低于相应的原养型。我们进一步注意到URA3和MET15营养缺陷型中唑类的绝对值较低，其次是HIS3和LEU2，分别对应于它们在药物耐受性方面的差异（图4c）。采用未经药物处理的培养基，我们将亚群分选并接种到只有原养型可以生长的基本(SM)培养基或支持两者生长的相应补充培养基(+H/L/U/M)上，并使用DDAs评估了对咪康唑或烯效唑的药物耐受性（图4d）。事实上，当从SeMeCos中分选出来时，含有较低浓度烯效唑的ura3Δ和met15Δ细胞在唑类存在条件下确实生长地更好，当从同一群落中分离时保持更高唑类浓度的his3Δ、leu2Δ细胞也是如此（图4e)。在咪康唑处理的细胞中也观察到类似的结果：实际上，his3Δ和leu2Δ营养缺陷型的恢复力要强得多，突出了不同唑类效力对药物耐受性的影响。

图4 营养缺陷型细胞中代谢物输出活性的增加促进了药物耐受性。

a，SeMeCos培养物与DiOC5(3)孵育，并用流式细胞术评估所述荧光种群。通过TagRFP657荧光对SeMeCos中的原养型、单营养缺陷型和双营养缺陷型（红色梯度）和三营养缺陷型（黄色）种群进行门控。通过mclust进行高斯曲线拟合和聚类分配，确定了具有不同营养缺陷水平的亚群。H、L和M分别表示组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸营养缺陷型；PRO，原养型亚群。b，SeMeCos培养物与DiOC5(3)孵育，固定并通过荧光显微镜进行分析。通过荧光鉴定原养型和营养缺陷型，其中两个种群对应于鉴定的低和高染料保留。C，通过LC-MS/MS测量从单一营养缺陷型SeMeCos中分选的营养缺陷型和原养型亚群中烯效唑的细胞内浓度。使用双侧t检验确定统计显著性，**** P < 0.00005。d，将来自分选的单一营养缺陷型SeMeCos的营养缺陷型和原养型亚群接种到具有互补氨基酸 (+H/L/U/M)的SM或补充有SM的培养基上，使滴定A:P比率成为可能。e，对暴露于烯效唑的四种分选SeMeCos菌株(SM或SM+H/L/U/M上)进行DDA检测。    

讨论

微生物细胞通常会产生、释放、摄取和感知范围广泛的代谢物，当微生物共同生长时，这些内在的代谢特性会导致高等级的代谢物交换。事实上，对于许多代谢物而言，原养型微生物优先从外代谢组中摄取，而不是其自身的生物合成生长能力。越来越多的证据表明，群落细胞内的代谢物交换程度是广泛的，定量代谢组学数据显示高水平的代谢物输出丰富了单物种和多物种群落的外代谢组。微生物群落内高度的代谢物可利用性反映在营养缺陷型细胞的高流行率上，这些细胞只有在群落环境中含有其生长必需的生长支持浓度的代谢物时才能生长。    

对于如此高频的营养缺陷型如何在群落内生存而不处于劣势这一问题仍存在激烈争论。“黑皇后假说”是关于营养缺陷型成功的一种普遍解释，该假设认为细胞要么通过减少代谢物合成负担从而在营养缺陷中获益，或者从细胞一旦输出就无法将其资源私有化的情况中获利。然而，围绕着营养缺陷型成功的一个难题是“骗子困境”，因为营养缺陷型可以利用提供代谢物而不获得任何好处的原养型。如果这种获益允许营养缺陷型比原养型生长得更快，它最终将会破坏群落的稳定。对在群落中观察到的相对稳定共存的另一种可能的解释是原养型生物可能只是简单地输出或漏出“无成本”的代谢物。在这种情况下，即使是骗子的营养缺陷型细胞也可能给群落带来最小成本，因为营养缺陷型生长所必需的代谢物被视为原养型产生的废物。    

本研究的结果为理解营养缺陷型在微生物群落中的成功增加了新的理解。我们的研究结果表明，当从群落中获得特定代谢物时，营养缺陷型广泛地重新配置其代谢，溢出代谢物而不是吸收代谢物。因此，营养缺陷型的存在会增加群落环境中的代谢物浓度。我们进一步表明，细胞外环境的这种变化会对群落产生深远影响，因为微生物细胞（无论是原养型还是营养缺陷型）都能感知细胞外代谢组的变化并相应地调整其代谢。我们发现了相互反应的证据，在这一反应中，原养型在营养缺陷型存在的情况下下调几种代谢酶，表明它们利用了营养缺陷型释放的代谢物。因此，包含营养缺陷型细胞的群落具有广泛改变的代谢特性。    

营养缺陷型具有与原养型相同的基本代谢网络结构，并且这种代谢网络的相互联系解释了当细胞从自身合成氨基酸转变为摄取氨基酸时，大量不相关代谢物溢出的增加。事实上，我们发现在细胞外代谢物存在时，WT细胞会像营养缺陷型那样吸收代谢物，而且在实验中我们发现其代谢相应地发生改变。从这种情况中，我们得出结论：摄取代谢物以有效利用外代谢组的能力是微生物细胞的特性，因此不需要二次适应就可生效。事实上，作为自然群落成员的细胞会溢出大量代谢物，例如乳酸菌和酵母菌群落。在遗传营养缺陷型中发现药物耐受性增加，并在诱导代谢摄取的遗传原养型细胞中得到复制，这证实了上述观点。我们想强调的是，因为这些代谢特性，耐受性的增加可以解释为单个细胞的代谢优化且不需要营养缺陷型和原养型的共同进化是有益的。事实上，代谢物交换相互作用的基础依赖于微生物的基本代谢特性，特别是其反馈抑制内在生物合成途径以有效摄取和利用细胞外代谢物的能力，而代谢网络中的重新配置导致溢出代谢的改变。后一种变化可以通过代谢网络的结构来解释，这在很大程度上依赖于互换代谢物的热力学和反应特性。由于高度的相互连接，当细胞从自身合成转换为摄取代谢物时，代谢物流动会发生广泛变化。    

最终，我们的研究结果揭示了一种将代谢相互作用与抗微生物药物治疗的稳健性联系起来的生化机制。通过分析作为EMP的一部分采集的数据以及大量的肠道微生物组数据，并经起源于SeMeCo模型的证实，我们发现氨基酸营养缺陷型非常普遍，并且比原养型更能适应广泛的药物暴露。我们提供的证据表明潜在机制在于细胞从特定必需代谢物的自我合成转变为摄取时其代谢重组导致代谢物输出活性增加。这提出了有吸引力的药物疗效先验预测前景，尽管仍需进一步表征药物外排泵的结构和活性特征。数据表明，增加的药物耐受性是一种新兴特性，是代谢物交换相互作用的结果，其中代谢物交换的程度较简单地通过营养缺陷型的数量来确定更为复杂。我们的代谢组数据、FBA模型和蛋白质组数据表明，用于模拟营养缺陷型-原养型相互作用的每种不同代谢物（H、L、U和M）对广泛的代谢物和蛋白质组具有不同的影响，并且每种代谢物含量对药物水平和耐药性有不同的定量效应。因此，增加对药物的稳健性是细胞间代谢物交换活动的功能，该功能由营养缺陷型的存在刺激（根据它们与其他细胞相互作用的程度）。    

虽然我们在研究中没有关注耐药性进化这一方面，但在将代谢相互作用归因于耐药性出现的多个报道背景下，我们的发现也值得讨论。代谢相互作用可以驱动对耐药基因传播至关重要的群落结构。此外，抗菌素耐药性的演变可能源于其他抑制性药物浓度下生长缓慢的耐受细胞亚群，耐药基因可以通过水平基因转移在复杂群落中迅速传播。我们的数据表明，在营养缺陷型存在并刺激高度代谢相互作用的群落中，药物治疗后能够持续存在的细胞的有效种群规模增加，可能加速了适应性进化。这一推测与最近的报道一致，该报道表明代谢进化分析后代谢突变数量增加导致细菌耐药性增加。