全面认识TCR-T细胞治疗：(4)TCR-T流程及影响因素

上一期 //全面认识TCR-T细胞治疗// 中介绍了TCR-T细胞治疗靶抗原的选择。本期，我们将进一步学习TCR-T细胞治疗的流程及影响因素，改善对肿瘤的免疫治疗效果。

TCR-T细胞治疗流程及影响因素

在细胞输注治疗的三种主要方式中，肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）治疗是最早被研究并开展临床试验的，但TIL成分复杂且来源受患者个体情况的影响较大，极大地限制了TIL治疗的应用。为了获得靶点明确、作用专一且来源容易的肿瘤杀伤T细胞，研究人员利用病毒载体或非病毒载体途径开发出TCR-T细胞和CAR-T细胞，通过向外周血来源的T细胞转入特异基因就能获得肿瘤特异性杀伤细胞。而与CAR-T细胞相比，TCR-T细胞在实体肿瘤治疗方面展现出更好的效果。通过转导特异性TCR的α链和β链，可使T细胞的靶点特异性重定向，进而生产出大量肿瘤特异性T细胞，为实体肿瘤的治疗提供了切实可行的策略。在2006年，两个研究团队先后展示了TCR-T细胞治疗人体实体肿瘤的潜力，证明了该类治疗的可行性。之后又有多项临床研究证明了TCR-T细胞治疗实体瘤的安全性与有效性。

一、TCR-T细胞治疗流程

TCR通过识别pMHC介导T细胞对肿瘤的识别和杀伤。将对肿瘤抗原有应答作用的TCRα链和β链序列分离后，以病毒或非病毒介导的方式转导入T细胞内，就能快速地产生大量抗原特异性T细胞。特异抗原反应性TCR序列经分离后，可以质粒形式保存扩增，需要时可以立即使用，这使得TCR-T细胞临床应用的门槛大大降低，TCR基因可作为一种现成的试剂用于表达特定抗原和MHC限制性分子的肿瘤患者的治疗。因而，TCR-T细胞临床治疗肿瘤患者的一般流程如图3所示：①抽取患者外周血并分离T细胞；②通过加入CD3/CD28磁珠和IL-2活化T细胞；③通过病毒或其他途径将TCR基因转导入活化的T细胞中；④转导了特异TCR的T细胞（TCR-T细胞）继续培养扩增至合适数量；⑤在输注TCR-T细胞前，对患者进行适度化疗或放疗清除体内的淋巴细胞（lymphodepletion），以增强TCR-T细胞的治疗效果；⑥将足够数量的TCR-T细胞经静脉回输给患者。回输后还要给予患者严密观察，以防出现严重的不良反应。

图3  TCR-T细胞治疗流程

二、TCR-T细胞治疗的影响因素

研究证明，表达外源基因的TCR-T细胞在遇到抗原阳性肿瘤细胞后能够大量产生炎性因子，如IFN-γ、IL-2及TNF-α等，表现出抗原特异性细胞毒作用（cytotoxicity），发生抗原刺激反应性增殖。早期临床研究显示，经MART-1和gp100反应性TCR-T细胞治疗的患者肿瘤消退，说明TCR-T细胞具有极强的肿瘤清除潜能。随着分子生物学的发展，基因修饰和转导技术的改进，TCR-T细胞构建系统取得了很大进步，这为TCR-T细胞治疗效果的进一步提高奠定了基础。与其他过继性细胞治疗技术一样，TCR-T细胞治疗具有以下优点：①可在短期内产生大量肿瘤抗原特异性的T细胞用于治疗；②在体外处理并扩增T细胞，可绕过肿瘤患者体内免疫障碍的影响，达到大量扩增免疫效应细胞的目的；③T细胞的体外激活、扩增可避免生物制剂在患者体内大量应用而带来的严重毒副作用；④T细胞的体外培养，可通过加入不同的细胞因子或试剂使T细胞定向分化，便于获得功能更加强大、杀伤效果更加持久的TCR-T细胞。但是，TCR-T细胞的治疗效果也同其他过继性细胞治疗方式一样，受到了多种因素的影响。

1、输注细胞数量

TCR-T细胞与肿瘤细胞的比例与T细胞治疗效果直接相关。研究表明，效应细胞至少应占到总CD8+ T细胞的1%-10%，也就是说，输入人体的效应细胞应达到（2-20）×10^9个才能有效控制肿瘤。但一次输入过多的效应细胞可导致严重的脱靶效应，甚至导致患者死亡。因而，可以通过每次少量细胞、多次输注的方式对患者进行反复回输，使患者体内的特异性T细胞数量占到总CD8+ T细胞的5%。动物实验显示，细胞反复输入可以保持对肿瘤细胞的持续攻击，起到逐步缩小肿瘤的作用。

2、免疫抑制因素的影响

当效应细胞回输入机体后，不可避免地受到体内存在的免疫抑制状态的影响。早期研究中，为了增强输注细胞活性，主要采取同时给予IL-2、IFN-γ等细胞因子的办法，但IL-2在增强输注细胞活性的同时，也促进了CD4+ CD25+ Treg细胞扩增，后者是一类重要的免疫抑制细胞。此外，近年来发现免疫检查点也是影响免疫细胞治疗的重要因素之一。其中，最著名的当属细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）与程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）。根据CAR-T细胞治疗的经验，如果在回输TCR-T细胞后的合适时机，给予患者CTLA-4和/或PD-1阻断抗体将极大地提高临床疗效。除了这些传统意义上的免疫抑制细胞和分子外，某些代谢调节分子也会抑制效应T细胞的功能，例如CD73和吲哚胺-2,3-双加氧酶1（IDO1）等。这些肿瘤微环境中的免疫抑制因素均是未来治疗中需要考虑的问题。

3、肿瘤异质性的影响

肿瘤异质性（heterogeneity）是指同一肿瘤组织内不同恶性细胞间的基因与生物学差异。广义而言，不同肿瘤之间的基因与表型差异也属于肿瘤异质性，在TCR-T细胞治疗中，异质性的影响主要体现在抗原表达与递呈差异。如前文介绍，肿瘤抗原的表达水平和免疫原性是TCR-T细胞治疗的基础和关键。如果肿瘤细胞不表达或不递呈靶抗原，则TCR-T细胞不能够攻击这部分细胞。在TCR-T细胞治疗中，人们总是希望靶抗原即使不被所有的肿瘤细胞表达，也要高表达于大部分肿瘤细胞，但现实却是单一靶抗原仅表达在少数恶性细胞上。这就需要使用针对2个甚至多个靶点的TCR-T细胞进行治疗。此外，还需考虑同时针对MHC-I类和II类分子限制性抗原进行治疗。多靶点联合治疗可能会产生更积极的结果。另外一个现实问题是，肿瘤特异抗原的表达在T细胞浸润后往往下调甚至终止。抗原表达的改变与特异肿瘤细胞被清除有关，同时也与肿瘤细胞关键基因的改变有关，比如抗原基因、MHC基因和与抗原处理及递呈有关的基因的表达与修饰改变等。值得庆幸的是，某些TCR-T细胞靶点抗原受到表观遗传调控，可以利用去甲基化（demethylation）药物或组蛋白脱乙酰基酶类（histone deacetylase，HDAC）药物来加强此类抗原的表达，提高T细胞的治疗效果。

4、效应细胞的影响

输注TCR-T细胞的分化程度、存活时间、向肿瘤部位运动的能力以及TCR表达水平等均影响了细胞治疗的效果。下面将分别介绍这些因素是如何影响治疗的。

（1）输注T细胞的选择  

在TCR-T细胞治疗中，输注T细胞的类型和分化水平直接影响效应细胞的功能与作用时间，在很大程度上决定了TCR-T细胞治疗的效果。首先，T细胞活化后最终分化为效应细胞（effector T cell，Teff）与记忆型细胞（memory T cell，Tm）。尽管体外研究显示，Teff细胞的短时杀伤效果更强，然而临床研究却证明免疫效应细胞在体内的存活时间在很大程度上决定了治疗效果。这也就意味着治疗时选择Tm细胞将取得更好的效果。这一影响因素在CD8+ T细胞选择中体现得更加明显。幼稚T细胞（naive T cell，Tn）在初始抗原和共刺激信号达到一定质和量的前提下可以分化为干细胞样记忆型T细胞（stem cell-like memory T cell，Tscm）、中心记忆型T细胞（central memory T cell，Tcm）、效应记忆型T细胞（effector memory T cell，Tem）及Teff细胞。临床前研究结果显示，CD8+ T细胞的分化和增殖间存在对立关系，即分化程度越高则增殖能力越低。由此可以推测输注CD8+ T细胞的分化程度和体内持久性及治疗效果间的相反关系。目前，有两种策略可用于改进T细胞治疗：一种是通过加入合适的细胞因子，例如IL-7+IL-15或IL-15+IL-21培养出低分化的CD8+ T细胞；另外一种方法，则是根据CD62L的表达，富集低分化T细胞，随后作为基因转入的受体细胞。CAR-T细胞实验证明具有长期生存能力的Tm细胞能够更加有效地控制肿瘤进展。通过调整细胞培养方案和合适的基因修饰将提高TCR-T细胞中Tm细胞的比例，延长T细胞的生存时间，增强该类治疗的效果。

另外，需要注意的是，输入何种类型的T细胞亚群也影响治疗效果。幼稚T细胞向功能T细胞分化过程中受到周围环境中多种细胞因子的影响，反过来，分化后的T细胞又影响了T细胞的功能。这种可变性在辅助T细胞（helper T lymphocyte，Th）分化中尤为常见。CD4+ T细胞可分化为多种亚型的细胞，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、滤泡辅助型T细胞（follicular helper T lymphocyte，Tfh）和Treg等。从抗肿瘤效应来说，Th1和Th17是功能最强的细胞亚型。CD4+ T细胞的加入，特别是Th1细胞，可以防止CD8+ T细胞耗竭，增强CD8+ T细胞的肿瘤浸润，从而引起有效的肿瘤杀伤与清除。另外，Th17细胞在动物实验中增强了TCR-T细胞清除肿瘤的效果，而Th17细胞的这种效果与其向Th1细胞转化有关。这些结果表明，CD8+ T细胞和Th1/Th17细胞的联合应用能够提高T细胞的治疗效果。在目前研究中，通过向CD4+ T细胞转入MHC-I类分子限制性TCR和/或CD8分子，能够有效激活Th细胞的活性。通过控制输注T细胞的亚群有可能增强细胞治疗效果。

（2）输注T细胞的亲和力  

T细胞亲和力（avidity）是指T细胞对特定浓度抗原产生反应的能力。在TCR-T细胞中，导入的TCR往往具备高亲和力（high affinity）。因而，TCR-T细胞亲和力主要与TCR表达水平有关。通过优化TCR基因转入方法，包括基因转入方法的选择、最佳载体成分的使用和转基因盒子的使用等途径，增强TCR转基因的表面表达。参考CAR-T细胞研究的经验，采取慢病毒载体和EF-1启动子，有可能显著提高TCR表达水平和比例。另外，可以通过限制或消除TCR错配来增强TCR转基因的表面表达。TCR错配（miss pairing）指外源性TCR链与内源性TCR链结合，形成了错配异二聚体，代表了TCR-T细胞构建的一种固有现象。更重要的是，TCR错配降低了TCR转基因表达，而且有未知的特异性，有可能产生与自身抗原反应的T细胞。尽管未有报道观察到TCR错配引起的毒性反应，但临床前试验明确显示，TCR错配会导致自身抗原的错误识别，引起免疫反应。促进转基因TCRα链和β链的正确配对（防止和减少TCR错配）的策略主要分为两类：第一类以TCR的鼠源化修饰为代表，即将C区替换为小鼠来源的序列，从而防止人源转基因TCR与自身TCR错配；第二种策略则是通过下调或敲除内源性TCR实现的，此类策略以CRISPR/Cas9介导的内源性TCR敲除为代表。除了增强TCR表面表达，还可以通过TCR序列改变和优化等策略增强TCR亲和力来提高治疗效果。研究发现，高亲和力MART-1特异性TCR介导的肿瘤缓解率要明显优于低亲和力TCR。而且，亲和力增强的NY-ESO-1特异性TCR介导的治疗效果更好。可以通过不同方法来提高TCR亲和力。其中的典型代表是通过改变TCR的CDR区序列实现亲和力提高。通过改变CDR区某些氨基酸的种类就能够提高TCR亲和力。尽管提高TCR亲和力能够显著改善T细胞功能，但要特别注意脱靶效应的产生。在临床试验中发现，靶向CEA/HLA-A2、MAGE-A3/HLA-A2和MAGE-A3/HLA-A1的TCR亲和力增强与患者的毒性反应有关。

（3）输注T细胞趋化因子受体及免疫调节受体的表达  

目前，TCR-T细胞治疗方式是通过静脉回输的方式实现的。回输T细胞首先要从血管到达肿瘤部位，然后才能发挥肿瘤杀伤功能。影响T细胞定向运动的关键是趋化因子（chemokine）引起的、趋化因子受体（chemokine receptor，ChR）介导的趋化运动。因而，如果能够让TCR-T细胞表达合适的ChR，就能够提高T细胞向肿瘤的浸润，改善TCR-T细胞的治疗效果。然而，目前尚不十分清楚ChR表达的调控机制，难以通过细胞因子或制剂加入的方法诱导特异ChR表达。但是可以通过基因工程的手段引入特异ChR。多项研究已经证实，ChR基因工程修饰提高了T细胞定向运动能力，改善了免疫治疗效果。相信TCR-T细胞治疗也将受益于此类改进。

除了ChR受体外，T细胞还表达多种起到免疫调节功能的协同信号受体。这类受体与相应配体结合后可分别提供共刺激信号（co-stimulatory signal）和共抑制信号（co-inhibitory signal）。在没有共刺激信号存在时，T细胞在持续抗原刺激下会导致耗竭（exhaustion），主要表现为增殖能力下降、效应功能下降（比如IFN-γ的产生减少），同时上调共抑制分子表达。共刺激分子的代表是CD28、诱导共刺激分子（inducible T-cell co-stimulator，ICOS）和4-1BB等。理论上，通过活化共刺激分子应该能够增强T细胞的功能，但是利用共刺激分子激活抗体治疗肿瘤的临床研究结果却显示此类治疗策略的效果有限，可能不是提高T细胞治疗肿瘤效果的最佳选择。反之，针对共抑制分子的治疗方案却取得了较好的效果。共抑制分子的代表是CTLA-4与PD-1。临床研究显示，阻断PD-1或同时阻断CTLA-4/PD-1对多种实体瘤的免疫治疗起到了增效作用。因而，在TCR-T细胞治疗中，也应该考虑T细胞与共抑制分子阻断联合的策略。