科研丨中科院生物物理所(IF:46): 肠道菌群通过肠道5-羟色胺能神经元驱动肠道干细胞自我更新(国人佳作)

编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

Lgr5+肠干细胞(ISCs)位于隐窝基底的特殊生态位内，具有自我更新和分化能力。隐窝基底的ISCs由其周围的生态位维持，以精确调节自我更新和分化。然而，隐窝生态位中的肠细胞和肠腔中的微生物群如何协同调节ISCs干性仍不清楚。本研究表明ISCs受微生物群和肠道5-羟色胺能神经元的调节。肠道微生物群代谢物戊酸通过阻断NuRD复合物在Tph2启动子上的募集来促进肠道5-羟色胺能神经元中Tph2的表达。5-羟色胺(5-HT)反过来通过其受体HTR2A/3激活PGE2+巨噬细胞亚群中PGE2的产生；并且， PGE2通过与其受体EP1/EP4结合，促进ISCs中的Wnt/β-catenin信号传导来促进其自我更新。本研究结果表明，微生物群、肠神经细胞、肠道免疫细胞和ISCs之间存在复杂的相互作用，揭示了生态位细胞和微生物群对ISC调控的新层面。

论文ID

原名：Gut microbiota drives macrophage-dependent self-renewal of intestinal stem cells via niche enteric serotonergic neurons

译名：肠道菌群通过肠道5-羟色胺能神经元驱动肠道干细胞的巨噬细胞依赖性自我更新

期刊：Cell Research

IF：46.297

发表时间：2022.4

通讯作者：范祖森，田勇，朱平平

通讯作者单位：中国科学院生物物理研究所

DOI号：10.1038/s41422-022-00645-7

实验设计

结果

1 ISCs的维护和功能需要微生物群 

为了确定肠道微生物群在ISC调节中的作用，我们将Lgr5GFP报告基因小鼠置于SPF(无特定病原体)和GF条件下。我们观察到GF小鼠的隐窝深度和Ki67+ ISC数量减少(图1a)。粪菌移植(FMT)能够恢复GF小鼠的正常微生物群。我们注意到，进行FMT的GF小鼠恢复了隐窝深度和ISC数量(图1a)。然后，我们进行了类器官形成测定，发现小肠和结肠中的ISC功能都需要微生物群(图1b)。氨苄西林、新霉素和万古霉素(ABX)可以破坏小鼠的微生物群。我们观察到ABX处理的小鼠表现出ISC数量和类器官形成能力显著受损(补充信息，图S1a，b)。通过谱系追踪，我们观察到GF和ABX处理的小鼠表现出ISC数量显著减少，而对GF小鼠进行FMT处理能够改善ISCs的自我更新能力(图1c，d；补充信息，图S1c)。

鉴于ISCs在辐射损伤后肠道再生中的关键作用，我们接着进行辐射损伤，然后检测肠道再生。正如预期的那样，GF或ABX处理的小鼠肠道再生和修复能力显著受损(图1e；图S1d)。这些数据表明，微生物群在ISCs的维持和功能中起着关键作用。

图1 微生物群促进ISC自我更新。a 用SPF小鼠、GF小鼠和FMT处理的GF小鼠进行ISC检测。代表性图像显示在左边的图中，五只小鼠的隐窝(n=100)的统计结果在右侧图中。比例尺，50 μm。7天的FMT处理用于微生物群恢复，并通过对16S rRNA的RT-PCR检测证实了适当的常规化和耗尽。b 从SPF小鼠、GF小鼠和FMT处理的GF小鼠获得的隐窝的类器官形成。代表性图像显示在上图中，类器官形成比和类器官表面积显示在下图中。c 将SPF、GF和FMT处理的GF Lgr5GFP-CreERT2；用三苯氧胺(TAM)处理Rosa26lsl-lacZ(LRlacZ)小鼠进行谱系追踪分析。在指定的时间点处死小鼠(n=8)，并展示了出生后第65天(P65)的代表性切片。展示了在指定时间点追踪的隐窝-绒毛单位(蓝色图)的数量。d SPF或GF状态的LRlacZ小鼠，以及FMT处理的GF小鼠用TAM处理以进行谱系追踪分析。5天后，共聚焦显微镜检测GFP和lacZ信号。展示了5只小鼠的代表性图像。比例尺，20 μm。e 将SPF小鼠、GF小鼠和FMT处理的GF小鼠用10 Gy的辐射处理，并在指定的时间点处死。收集肠组织进行H&E染色(左图)，右图显示完整隐窝的数量(平均值±  SD)。比例尺，100 μm。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，通过非配对单尾t检验；数据显示为平均值 ± SD。 

2 神经递质5-HT驱动ISCs的自我更新 

接下来，我们想探索微生物群-神经元串扰在ISC自我更新中的调节作用。为了研究肠道神经细胞和神经递质是否参与微生物群介导的ISC自我更新，我们通过基于质谱的代谢组学分析检测了SPF和GF肠组织的神经递质浓度(图2a)。然后，我们在GF小鼠中选择了五种差异表达的神经递质，并进行体内阻断试验。我们用商业神经递质拮抗剂处理Lgr5GFP报告基因小鼠，并在3天后计算肠组织中的GFP+ ISC数量。我们发现色氨酸羟化酶抑制剂pCPA最显著地降低了小肠(SI)和结肠中ISCs的比例(图2b)。为了进一步检测ISC生态位中的5-HT水平，我们通过激光捕获显微解剖分离干细胞生态位切片(图S2a)。我们注意到，GF小鼠的ISC生态位部分的5-HT水平降低(图S2b)。此外，pCPA处理的小鼠小肠和结肠隐窝深度减少，绒毛缩短(图2c)。通过探测Lgr5原位杂交进一步证实了这些观察结果(图2d)。此外，pCPA处理减弱了辐射损伤后的肠道再生能力(图2e)。这些数据表明，5-HT在ISCs的维持中起着关键作用。为了区分中枢和外周5-HT合成，我们使用肠系膜动脉注射(MAI)抑制脑靶向性并增强肠道特异性靶向性。我们发现，MAI处理可特异性阻断肠道5-HT合成，但不影响中枢5-HT合成(图S2c)。通过MAI递送的pCPA对ISC维持有类似的抑制作用，证实了ISC自我更新维持需要肠道5-HT(图S2d)。

此外，我们发现5-HT注射在很大程度上恢复了GF小鼠SI和结肠组织中的5-HT水平和ISC数量(图S2e，f)。5-羟色胺转运体(SERT)可以回收5-HT以终止其作用，Sert缺陷小鼠的5-HT水平升高。我们生成了Sert敲除(KO)小鼠(图S2g，h)。Sert缺陷小鼠表现出ISC生态位中的5-HT水平升高，肌间神经元中的5-HT水平降低(图S2i，j)。我们发现Sert KO小鼠的绒毛和隐窝长度增加(图S2k)。此外，Sert KO还增加了小肠和结肠中的ISC数量(图2f)。为了进一步进行谱系追踪，将Sert KO小鼠与Lgr5GFP-CreERT2和Rosa26lsl-lacZ小鼠杂交建立LRlacZ；Sert-/-小鼠。我们观察到Sert缺失增加了ISC数量和肠道更新能力(图2g，h；图S2l)。总之，5-HT促进了ISCs的自我更新维持。

图2 5-HT驱动ISCs的自我更新。a 通过质谱检测SPF和GF结肠组织中指示神经递质的含量，并将其标准化为SPF小鼠的水平。SPF或GF小鼠(n=3)用于检测。GABA，γ-氨基丁酸；5-HT，5-羟色胺；DA，多巴胺；3-MT，3-甲氧基酪胺；5-HIAA，5-羟基吲哚乙酸；Ach，乙酰胆碱。b 用指定的神经递质或神经递质拮抗剂处理2月龄Lgr5GFP小鼠。三天后，收集SI(左)和结肠(右)的隐窝，并通过FACS检测Lgr5GFP+ ISCs。Lgr5GFP+ ISCs在总隐窝细胞中的比例如散点图所示。每组8只Lgr5GFP小鼠。c 2月龄小鼠用5-HT抑制剂pCPA处理36 h和72  h，并在左图显示了SI和结肠的代表性H&E图像。观察了五只小鼠的100个视野，并显示在右图中。腹腔内注射150 mg/kg pCPA。d 在pCPA处理的小鼠的SI和结肠组织中进行Lgr5原位杂交。代表性图像显示在左图中，来自五只小鼠的100个视野的统计结果显示在右图中。e pCPA处理的小鼠用10 Gy的辐射处理，并在指定的时间点处死。收集肠组织进行H&E染色(上图)。下图显示了完整的隐窝数量(平均值 ± SD)。使用5只2个月大的小鼠，每组取20个视野。腹腔注射15 0 mg/kg pCPA。f 收集Sert KO小鼠的SI和结肠隐窝，用FACS检测ISC。使用了Lgr5GFP;Sert+/+(Sert+/+)或Lgr5GFP;Sert-/-(Sert-/-)小鼠(n=8)，并显示Lgr5GFP+ ISCs的比率。g LRlacZ小鼠与Sert-/-小鼠杂交，然后给药TAM，通过肠道整体β-gal染色进行谱系追踪分析。在指定的时间点处死7只小鼠，并显示P65的代表性切片。h LRlacZ；Sert-/-小鼠进行谱系追踪分析，并对肠组织进行lacZ染色。n=7只小鼠/组。对于c-e，比例尺为100 μm。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；ns，不显著；统计采用非配对单尾t检验。每个实验至少进行三次独立重复，并显示了具有代表性的结果。

3 ISC自我更新需要由肠道5-羟色胺能神经元产生的5-HT 

5-HT代谢是一个复杂的过程，该过程涉及许多酶(图S3a)。我们检测了5-羟色胺代谢相关基因的表达水平，发现在GF小鼠中Tph1/2表达下调(图S3b)。在肠道内，5-HT由EC细胞和肌间神经丛的肠道5-羟色胺能神经元产生。EC细胞含有负责5-HT生物合成的色氨酸羟化酶-1(TPH1)，而肠道5-羟色胺能神经元表达TPH2以产生5-HT。为了确定产生5-HT的源细胞，我们建立了Tph1-KO小鼠，并获得了Tph2-KO小鼠(图S3c-e)。接下来，我们检测了Tph1-KO和Tph2-KO小鼠的总组织和ISC生态位部分的5-HT水平，并发现Tph2-KO小鼠的ISC生态位中的5-HT显著降低(图S3f)。我们发现，与同窝野生型(WT)小鼠相比，Tph2-KO小鼠的隐窝和绒毛更短，ISCs数量减少，而Tph1-KO小鼠的ISCs正常(图3a；图S3g)。通过对另一种ISC标记Olfm4和增殖标记Ki67抗原进行染色，进一步验证了这些观察结果(图3b，c)。此外，Tph2-KO小鼠在辐射损伤后也表现出肠道再生受损(图3d)。值得注意的是，通过5-HT注射试验，5-HT是Tph2-/-小鼠ISC功能的关键因素(图S3h)。此外，通过肠系膜动脉向TPH2-KO小鼠注射5-HT，需要外周TPH2+细胞来维持ISC(图S3i-k)。 为了进一步验证EC细胞和肠道5-羟色胺能神经元在ISC自我更新中的作用，我们通过CRISPR/Cas9方法生成了Tph1DTR和Tph2DTR小鼠，其中EC细胞和肠道5-羟色胺能神经元将在白喉毒素(DT)处理后耗尽(图S3l-n)。正如预期，在DT处理的Tph2DTR小鼠中可以观察到ISC数量减少和ISC功能受损，而与Lgr5GFP小鼠相比，DT处理的Tph1DTR小鼠的ISC数量和功能正常(图3e，f)。5-HT是DT处理的Tph2DTR小鼠ISC功能的一个重要因素(图S3o)。此外，Tph2+肠道5-羟色胺能神经元的耗竭导致ISC维持受损，ISC基因表达降低(图S3p-r)。这些观察证实，肠道5-羟色胺能神经元在ISC自我更新和肠道再生中起关键作用。 ISC自我更新和肠道再生需要肠道5-羟色胺能神经元。

图3 肠道5-羟色胺能神经元产生的5-HT有助于ISC自我更新。a 在Tph1-和Tph2-KO小鼠的SI和结肠组织中进行Lgr5原位杂交。左图显示了代表性图像，右图显示了五只小鼠的100个视野。比例尺，100 μm。b，c Lgr5GFP;Tph1-/-小鼠和Lgr5GFP；Tph2-/-小鼠在P60上处死，收集肠组织，用指示抗体进行免疫荧光染色。显示了小肠(b)和大肠(c)的代表性图像。对5只小鼠的100个视野进行了观察和计算。比例尺，50 μm。d Tph1和Tph2 KO小鼠用10 Gy的辐射处理，并在指定的时间点处死。收集肠组织进行H&E染色(上图)，下图显示完整隐窝的数量(平均值± SD)。比例尺，100 μm。f  2月龄Lgr5GFP、Lgr5GFP;Tph1DTR和Lgr5GFP；第一次白喉毒素(DT)处理6天后的Tph2DTR小鼠肠道组织的荧光染色。在第0天和第3天进行100  ng/小鼠DT处理。观察了5只小鼠的100个视野。比例尺，50 μm。f LRlacZ;Tph1DTR和LRlacZ;Tph2DTR小鼠用100  ng/小鼠DT处理，每3天一次，用于谱系追踪分析，肠组织染色用于lacZ观察。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns，不显著，非配单尾t检验。每个实验至少进行三次独立重复，并显示了具有代表性的结果。

4 微生物代谢物VA通过抑制NuRD复合物的募集启动Tph2表达

在许多情况下，微生物群分泌代谢物以参与生物过程的调节。然后，我们使用可吸收代谢物处理GF小鼠，并检测肠组织中Tph2的表达水平。在我们检测的36种代谢物中，VA可以显著促进GF小鼠中Thp2的表达，而我们使用的其他代谢物没有这种作用(图4a；表S1)。我们用其他短链脂肪酸(SCFAs)处理Lgr5GFP小鼠，发现只有VA促进Tph2和ISC标记基因的表达(图S4a)。免疫印迹进一步验证了VA增强Tph2表达的观察结果(图4b)。此外，VA可促进GF肠内ISC增殖相关基因的表达(图4b)。另外，VA处理能够增强GF肌间神经丛中的5-HT生成，与FMT处理类似(图4c；图S4b)。值得注意的是，FMT和VA处理可以增强ISC相关基因的表达并恢复ISC数量，但在Tph2缺失的小鼠中未能做到这一点，这表明FMT和VA以TPH2依赖性方式促进ISC自我更新(图4d，e)。最近的一份报告显示，Megasphaera massiliensis是产生VA的来源。然后，我们通过灌胃给药将Megasphaera massiliensis转移到SPF或GF小鼠，结果发现，给药Megasphaera massiliensis可增加GF和SPF小鼠肠道内的VA水平(图S4c，d)，从而促进ISC特征基因和增殖基因的表达(图S4e)。Tph2DTR小鼠的神经元耗竭证实了5-羟色胺能神经元在微生物群和VA介导的ISC维持中的重要作用(图4f，g)。类似地，ABX以TPH2依赖性方式抑制ISC维持(图S4f)。总之，微生物群分泌的VA促进Tph2表达和5-HT介导的ISC自我更新。

为了进一步探索微生物群介导Tph2表达的分子机制，我们从GF小鼠和SPF小鼠中分离出肌间神经丛细胞，并通过DNase保护试验检测Tph2启动子的染色质可及性。我们发现Tph2启动子的-3600~-3400区域对GF小鼠中的DNase消化具有抗性，表明在GF小鼠中Tph2启动子受到抑制(图S4g)。VA对Tph2启动子的激活通过荧光素酶分析进行验证(图S4h)。HDAC1、HDAC2和MBD3是抑制基因转录的NuRD复合物的主要成分，通过CAPTURE分析(生物素化dCas9捕获染色质相互作用)(图4h；图S4i)被确定为结合GF细胞中Tph2启动子的候选蛋白。Western blot证实Tph2启动子与这三种成分的相互作用增强。然而，FMT和VA处理阻断了NuRD复合物与Tph2启动子的相互作用(图4i)。染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光原位杂交(FISH)分析进一步证实了这些观察结果(图4j，k；图S4j)。这些数据表明，FMT和VA处理可以减少NuRD复合物在Tph2启动子上的富集。H3K5ac和H3K9ac是HDAC1/2去除的两种组蛋白H3修饰物。H3K4me3是基因转录激活的活性标记。我们发现FMT和VA处理将H3K5ac、H3K9ac和H3K4me3富集到Tph2启动子区域(图4l)。为了进一步研究VA在5-HT产生和释放中的直接或间接作用，我们建立了肌间神经丛神经元的体外培养系统。我们观察到VA处理增加了Tph2的表达(图S4k，l)并提高了5-HT水平(图S4m)。此外，阻断NuRD复合物活性会抑制VA介导的5-HT产生，进一步证实VA通过NuRD复合物直接调节Tph2的表达(图S4k–m)。总之，VA抑制了NuRD复合物富集到Tph2启动子上以启动其表达。

图4 VA减少NuRD复合物在Thp2启动子上的富集以启动其表达。a 用指定代谢物处理GF小鼠，并通过RT-PCR检测肠组织中的Thp2。SPF和Ex-GF小鼠作为阳性对照。每组每天用代谢物处理6只小鼠，持续5天。b 对处理小鼠的全肠组织进行裂解，以进行Western blot。β-actin用作对照。3只小鼠的检测结果相似。VA，戊酸。c 从接受处理的小鼠中分离出肌间神经丛，并通过共聚焦显微镜检测5-HT。显示了代表性图像和5-HT+比值。每组取5只小鼠的20个视野。蓝色，DAPI；红色，5-HT。比例尺，50 μm。d 使用经处理的Tph2 KO小鼠和对照小鼠的SI和结肠组织进行RT-PCR分析。检测ISC标记基因(Olfm4、Ascl2、Lgr5)并将其标准化至SPF小鼠水平。每组检测6只小鼠。e 从经处理的Tph2-KO小鼠和对照小鼠中获得SI和结肠隐窝，并通过FACS检测ISCs。每组6只小鼠。f,g 用DT对Tph2DTR小鼠进行5-羟色胺能神经元消耗，然后进行ISC标记物和ISC比率检测，如d、e。h 使用SPF-、GF-或VA处理的肌间神经丛细胞对CAPTURE试验的洗脱液进行银染色。GF细胞中增加的条带被鉴定为HDAC1、HDAC2和MBD3。i 通过CAPTURE试验和Western blot检测Tph2启动子与所示肌间神经丛中HDAC1、HDAC2和MBD3的相互作用。j 表明获得了肌间神经丛细胞，用于针对HDAC1、HDAC2和MBD3的ChIP分析。通过RT-PCR检测Thp2启动子(-3600~-3400区域)的富集。k 通过TPH2对肠道5-羟色胺能神经元进行分类，并通过5-HT染色进行确认，然后通过FISH检测Tph2启动子，免疫荧光染色检测HDAC1。显示了从指定处理小鼠分离的肠道5-羟色胺能神经元中共定位细胞的比例。每组3只小鼠，每只小鼠观察100个细胞。l 通过ChIP分析检测Thp2启动子的H4K5ac、H3K9ac和H3K4me3修饰。通过RT-PCR检测Thp2启动子的-3600~-3400区域。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns，不显著；统计采用非配对单尾t检验。每个实验至少进行三次独立重复，并显示了具有代表性的结果。

5 5-HT激活巨噬细胞中Ptges表达

接下来，我们探讨了5-HT在ISC自我更新中的分子机制。首先，我们用ISC、隐窝或ISC外加CD45+细胞建立类器官形成试验，发现5-HT主要通过CD45+细胞激活ISC自我更新(图5a，b；图S5a，b)。在Tph2缺陷型CD45+细胞中的前10个下调基因中，PGE2表达的关键基因Ptges是CD45+细胞依赖性ISC自我更新所必需的(图5c，d)。值得注意的是，Ptges-KO小鼠的小肠和结肠中的ISCs数量均减少(图5e；图S5c，d)。此外，pCPA处理会抑制WT小鼠的ISC功能，但不会抑制Ptges-KO小鼠的ISC功能，这表明Ptges在5-HT介导的ISC自我更新和功能中起着重要作用(图5e)。之前的一项研究表明，成纤维细胞是肠干细胞生态位中关键的PGE2产生者。然后对受体小鼠进行10 Gy的辐照处理，并进行骨髓移植以比较基质和髓系PGE2的差异功能(图S5e)。在SPF条件下，将WT骨髓移植到Ptges-KO小鼠体内可促进ISC特征基因和增殖基因的表达，非髓系细胞(基质细胞)也参与了ISC的激活。相反，髓系细胞在ISC激活中的作用受损，而在GF条件下，基质细胞起主要作用(图S5f)。 Ptges在CD45+免疫细胞中广泛表达，尤其是巨噬细胞，表现出5-HT依赖性Ptges表达(图5f)。事实上，巨噬细胞的消耗大大减少了小肠和结肠中的ISC数量(图5g)。过继转移WT巨噬细胞(而非Ptges-/-巨噬细胞)能够改善Tph2耗竭小鼠的ISC数量(图5h)，表明5-HT主要通过巨噬细胞中的PGE2在ISC自我更新中发挥作用。类似地，在类器官形成试验中，5-HT促进的ISC自我更新需要PGE2+巨噬细胞激活(图5i)。接下来，我们培养了WT和Tph2-KO小鼠(有或无巨噬细胞)的肌间神经丛神经元，以进行类器官形成试验。我们观察到Tph2-KO肌间神经丛神经元以巨噬细胞依赖性方式抑制类器官的形成(图S5g)。

我们还研究了巨噬细胞在5-HT介导的ISC维持中的作用。我们注意到，在缺乏巨噬细胞的小鼠中，微生物群、VA或5-HT均不影响ISC的数量(图5j，k；图S5h，i)。此外，巨噬细胞耗竭的小鼠在辐射损伤后显示出肠道再生受损，而微生物群-VA-5-HT轴在巨噬细胞耗竭后未能调节肠道再生(图5l)。这些结果表明，肠巨噬细胞是5-HT介导的ISC维持所必需的。

图5 5-HT通过巨噬细胞发挥作用。a，b ISC和隐窝的类器官形成(a)，或ISCs与CD45+细胞(b)共培养。类器官形成培养基添加或不添加5 μM 5-HT。4只小鼠用于类器官形成。c Tph2-KO和对照CD45+细胞的热图，右侧列出了Tph2敲除细胞中前10位低表达基因。红色，高表达；蓝色，低表达。d 与CD45+免疫细胞共培养的ISCs类器官形成率，其中指示基因单独沉默，补充5 μM 5-HT。结果来自 4个独立实验。e Ptges+/+和Ptges-/-的ISC比率，在ISC检测前3天用150  mg/kg pCPA处理。5只小鼠用于ISC检测。f RT-PCR分析从Tph2+/+和Tph2-/-分离的指示细胞中Ptges的表达。使用了3只Tph2+/+和Tph2-/-小鼠。g 在腹腔注射CSF1R ab(抗体，10 mg/kg)的巨噬细胞耗竭小鼠的SI和结肠组织中进行Lgr5原位杂交。每组取5只小鼠的100个视野。比例尺，50 μm。h FACS检测指示处理小鼠的SI和结肠隐窝中的ISC比率。对于每组，每3天(两次)用100 ng DT处理5只Tph2DTR小鼠，过继转移2 × 106个巨噬细胞(Mφ)。Mφ被5 μM 5-HT激活8 h，在Mφ过继转移后2天检测到ISCs。i ISCs的类器官形成，与WT或Ptges-KO巨噬细胞和5 μM 5-HTT共培养。每组使用6只小鼠。j 在所示小鼠的小肠中进行Lgr5原位杂交。比例尺，50 μm。k 收集CSF1R抗体(ab)处理和对照的小肠隐窝，通过FACS检测ISCs。每组使用5只小鼠并显示ISC的比例。l 所示小鼠用10 Gy辐照处理5天后处死。收集肠组织进行H&E染色(上图)，下图显示完整隐窝的数量(平均值± SD)。每组取5只小鼠的n = 20个视野。比例尺，100 μm。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，非配对单尾t检验。每个实验至少进行三次独立重复，并显示了具有代表性的结果。 

6 5-HT通过与受体HTR2A和HTR3A结合促进PGE2+巨噬细胞中PEG2的表达

5-HT通过其同源受体发挥作用，因此我们接下来检测了巨噬细胞上5-HT受体的表达模式。我们沉默了巨噬细胞中的每个受体，并检测了5-HT在Ptges表达中的作用。我们注意到，Htr2a或Htr3a基因敲除降低了Ptges的表达，而其他5-HT受体的敲除没有明显的抑制作用(图6a)。事实上，Htr2a和Htr3a在巨噬细胞中高度表达(图6b)。此外，用抑制剂酮色林和托烷司琼阻断HTR2A和HTR3A可抑制5-HT依赖性PGE2的产生(图6c)。然后，我们生成了Htr2a和Htr3a KO小鼠，并通过杂交这些KO小鼠建立了双KO(DKO)小鼠(图S6a-d)。在Htr2a和Htr3a KO巨噬细胞中观察到PGE2释放减少(图6d)。这些数据表明，HTR2A和HTR3A是5-HT依赖性PGE2产生所必需的。更重要的是，Htr2a和Htr3a KO小鼠的ISCs数量减少，表明Htr2a和Htr3a在ISC维持中的重要作用(图6e)。 然后我们检测了PGE2在ISC自我更新中的作用。PGE2处理增加了ISC数量，而PGE2抑制剂吲哚美辛处理减少了ISC数量(图6f，g)。此外，PGE2处理促进了ISCs类器官的形成(图6h)，表明PGE2在ISC自我更新中起着关键作用。有趣的是，我们发现PGE2在一个巨噬细胞亚群中富集，并且在GF小鼠中PGE2+巨噬细胞的比率降低，而FMT和VA处理恢复了PGE2+巨噬细胞的比例(图6i；图S6e，f)。我们使用FACS分析了CD45.1细胞数量及其在转移测定中PGE2的细胞内水平。我们观察到巨噬细胞主要分布在宿主SI中(图S6g)。当转移后两天检测到ISCs时，转移巨噬细胞中的PGE2水平与WT小鼠相当(图S6h，i)。 以前的报道表明，巨噬细胞产生PGE2需要表面标记物CX3CR1和P2RX4。我们观察到PGE2+细胞高表达CX3CR1和P2RX4(图S7a)。此外，CX3CR1hiP2RX4+细胞能够生成PGE2，而非CX3CR1int、CX3XR1neg或CX3CR1hiP2RX4-细胞(图S7b，c)，我们得出结论，CX3CR1hiP2RX4+细胞与PGE2+巨噬细胞亚群有关。我们还证实CX3CR1hiP2RX4+细胞受微生物群和代谢物VA调节(图S7d，e)。据报道，肠道巨噬细胞要么来自胚胎前体细胞，要么来自成人骨髓来源的单核细胞。根据我们的骨髓移植试验，我们发现PGE2+骨髓可以生成PGE2+巨噬细胞，维持ISCs的自我更新(图S5e，f)，这表明PGE2+巨噬细胞是骨髓来源的。先前的一份报道表明，肠道巨噬细胞包含两组，固有层巨噬细胞(LpMs)和肌层巨噬细胞(MMs)。我们注意到PGE2+巨噬细胞均分布在肌层和固有层(图S7f，g)。 然后我们分离PGE2+和PGE2-巨噬细胞进行过继转移。我们发现在ISC生态位中分布的PGE2+巨噬细胞比PGE2-巨噬细胞多(图6j；图S7h)。在肌间神经丛中，PGE2+巨噬细胞主要位于5-HT含量高的区域附近(图S7i)。我们还同时展示了肠内5-羟色胺能神经元、PGE2+巨噬细胞和ISCs的存在，并证实PGE2+巨噬细胞存在于肌间神经丛(靠近5-羟色胺能神经元)和固有层(靠近ISCs)(图S7j)。此外，过继转移PGE2+巨噬细胞显著恢复了GF小鼠和5-羟色胺能神经元耗竭小鼠的ISC比率(图6k)。这些结果表明，PGE2+巨噬细胞参与了ISC的自我更新维持。最后，我们观察到5-HT激活NF-kB信号通路以启动Ptges表达(图S7k-n)。综上，5-HT通过巨噬细胞上的同源受体HTR2A和HTR3A激活PGE2的产生。

图6 5-HT通过与其受体HTR2A和HTR3A结合促进PGE2的表达。a RT-PCR检测经5-HT处理的肠巨噬细胞中Ptges的表达水平，其中所示的5-HT受体被单独沉默。2×105个沉默的肠巨噬细胞用5 μM 5-HT处理8 h、24 h后检测到Ptges的表达。结果来自3个独立的测定。RT-PCR证实了Htr基因敲除效率。b 通过FACS富集的肠巨噬细胞高表达Htr2a和Htr3a。c 用指定的5-HT受体抑制剂处理的巨噬细胞产生PGE2。以10 μg/mL酮色林和25 μg/mL托烷司琼为对照，分别进行3个独立实验。d 通过ELISA检测5-HT处理的Htr2a KO、Htr3a KO或DKO小鼠中巨噬细胞产生PGE2的情况。所有PGE2水平均标准化至赋形剂处理小鼠水平(每组n=3)。e 2月龄Lgr5GFP、Lgr5GFP;Htr2a-/-、Lgr5GFP;Htr3a-/-和Lgr5GFP;Htr2a-/-;Htr3a-/-小鼠的肠组织荧光染色。观察了5只小鼠的100个视野。f，g FACS检测dmPGE2处理(f)或吲哚美辛(Indo)处理(g)小鼠的SI或结肠组织中的ISC比率。腹腔注射5  mg/kg dmPGE2、10 mg/kg indo和150 mg/kg pCPA，每组5只小鼠。h ISCs的类器官形成，添加/不添加1 μM dmPGE2。展示了三种独立分析的代表性类器官图像。i 在CSF1R+巨噬细胞中分析PGE2的表达，这些巨噬细胞来自SPF、GF、GF+FMT和GF+VA的小鼠SI组织。每组5只小鼠。代表性FACS结果显示在左图中，PGE2+巨噬细胞比率显示在右图中。j 从CD45.1小鼠的回肠组织中分离出PGE2+巨噬细胞，并转移到Lgr5GFP小鼠体内，显示了CD45.1+巨噬细胞的SI组织定位。每只小鼠使用2×106个活PGE2+巨噬细胞。k 对GF-Lgr5GFP小鼠和DT处理的Lgr5GFPTph2DTR小鼠进行PGE2+巨噬细胞转移试验，并用FACS测定ISC比率。测量SI和结肠组织。n = 5只小鼠/组。*P < 0.05，**P < 0.01，***P <0.001 ，ns；不显著；非配对单尾t检验。 

6 PGE2通过Wnt/β-catenin信号通路促进ISC自我更新

PGE2在ISC自我更新中的作用机制尚不清楚。在体外类器官形成实验中，我们沉默了所有四种PGE2受体。我们发现，敲除Ep1或Ep4可显著抑制类器官的形成(图7a)。接下来，我们生成了EP1和EP4基因敲除小鼠，这些小鼠的隐窝和绒毛较短，而DKO小鼠的隐窝和绒毛比单KO小鼠短得多(图7b；图S8a-d)。预期地，Ep1、Ep4 KO小鼠和DKO小鼠的ISC数量减少(图7c、d)。这些结果表明，EP1和EP4介导的PGE2信号是ISC维持所必需的。此外，辐射损伤后，DKO小鼠的肠道再生受损(图7e)。通过谱系追踪分析进一步验证ISC干细胞减少(图7f)。为了进一步确定EP1和EP4在ISC调节中的细胞自主作用，我们分离了WT、Ep1-/-、Ep4-/-和DKO ISCs，并辅以dmPGE2或巨噬细胞加5-HT以形成类器官。我们发现EP1和EP4都以ISC固有的方式发挥作用(图S8e)。然后我们将WT巨噬细胞转移到Ep1-/-和Ep4-/-小鼠，发现WT巨噬细胞不能改善这两种KO小鼠的ISC表型(图S8f)。总之，PGE2信号通过与其受体EP1和EP4的结合启动，以维持ISC的干性。考虑到PGE2和Wnt/β-catenin信号之间的串扰，我们接下来检测Wnt/β-catenin激活。我们注意到，DKO ISCs对Wnt/β-catenin信号激活的抑制降低(图7g；图S8g，h)。此外，我们将DKO小鼠与Axin2lacZ小鼠杂交，发现DKO ISCs表现出Wnt/β-catenin激活受损(图7h)。这些数据表明PGE2信号促进Wnt/β-catenin信号的激活。总之，PGE2通过Wnt/β-catenin信号传导促进ISC自我更新。

图7 PGE2驱动Wnt信号激活以维持ISC干性。a 指示的PGE2受体沉默ISCs的类器官形成分析，补充1 μM dmPGE2。结果来自 5个独立实验。b WT、Ep1-/-、Ep4-/-和DKO小鼠的SI和结肠的H&E染色。左图显示了代表性图像，右图显示来自5只小鼠的100个视野。比例尺，50 μm。c FACS检测WT、Ep1-/-、Ep4-/-和DKO小鼠SI和结肠隐窝中的ISC比率。每组5只小鼠。d 2月龄Lgr5GFP、Lgr5GFP;Ep1-/-、Lgr5GFP;Ep4-/-和Lgr5GFP;Ep1-/-;Ep4-/-小鼠肠组织的荧光染色。观察了5只小鼠的100个视野。比例尺，50 μm。e WT和DKO小鼠用10  Gy辐射处理，并在指定的时间点处死，显示代表性图像。比例尺，100 μm。f 将Lgr5GFP-CreERT2;Rosa26lsl-lacZ(LRlacZ)小鼠与DKO小鼠杂交，并进行β-gal的肠道全组织染色以进行谱系追踪分析。每组观察8只小鼠，并展示代表性切片。P60，出生后第60天；TAM，三苯氧胺。g WT和DKO ISCs中Wnt/β-catenin靶基因的热图。每组3只小鼠。h WT和DKO小鼠与Axin2lacZ小鼠杂交。对SI和结肠组织进行β-gal表达染色。β-gal染色显示Wnt/β-catenin信号的激活。显示了5只小鼠的代表性图像。比例尺，50 μm。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，非配对单尾t检验。每个实验至少进行三次独立重复，并显示了具有代表性的结果。

讨论

在稳态条件下，肠上皮细胞具有显著的自我更新能力，这是由位于隐窝底部特殊生态位内的ISCs驱动的。ISCs的自我更新受到各种细胞内和细胞外信号的精确调节。在这项研究中，我们发现神经递质5-HT和PGE2是ISCs自我更新维持和肠道再生所必需的。PGE2+巨噬细胞作为隐窝生态位细胞，通过与PGE2受体EP1/EP4的结合，促进ISCs中Wnt/β-catenin的信号传导。肠道微生物群产生的VA通过抑制NuRD复合体的募集，促进肠道5-羟色胺能神经元中Tph2的表达。本研究揭示了微生物群、肠道神经元、免疫细胞和肠道干细胞之间的相互作用，为肠道稳态调节增加了一个新的层面。值得注意的是，用FMT或VA处理并不能完全恢复GF小鼠中PGE2+巨噬细胞的频率，这表明可能有一种替代机制有助于该表型的形成。PGE2+巨噬细胞亚群发育和决定细胞命运的确切机制有待进一步研究。 肠道5-HT由肌间神经丛的两种细胞产生，即EC细胞和肠道5-羟色胺能神经元，分别由限速酶TPH1和TPH2合成。EC细胞产生的5-HT溢出到胃肠道腔和血液中。从EC细胞溢出的5-HT被吸收并集中在血小板中，作为血液5-HT的唯一来源。据报道，肠道5-羟色胺能神经元产生的5-HT介导快速和缓慢的兴奋性神经传递，并调节胃肠运动。Gross的研究表明Tph2-/-(而不是Tph1-/-)小鼠隐窝深度降低，隐窝增殖受损，而Sert-/-小鼠表现出相反的效果。据我们所知，神经元5-HT和Tph2+肠道5-羟色胺能神经元是否以及如何调节ISC功能尚不清楚。在本研究中，我们确定5-HT是一种新的生态位因子，Tph2+神经元是一种新的生态位细胞亚群，用于调节ISCs，并提供了从戊酸的Tph2表达到神经元5-HT介导的ISC功能的完整机制。 5-HT通过与5-HT受体结合发挥其功能，包括13个不同的七螺旋GPCRs和一个配体门控离子通道。5-HT及其受体被发现存在于中枢和外周神经系统中，它们也存在于非神经组织中，如肠道、心血管系统和血液。在这里，我们发现Htr2a和Htr3a在巨噬细胞上高度表达，这些受体介导5-HT信号对PGE2产生的影响。5-HT参与后，这些受体激活Ptges表达，从而诱导PGE2的产生。PGE2通过EP1和EP4进一步促进Wnt/β-catenin激活和ISC自我更新。作为干细胞中最重要的通路之一，Wnt/β-catenin被精确调节。我们已经确定了Wnt调节中的几种调节剂，在这里我们揭示了ISC自我更新中的5-HT-PGE2-Wnt轴。最近的一项研究表明，表达PTGER4的肠巨噬细胞(PTGER4+肠巨噬细胞)的一个亚群在肠道炎症恢复期间是上皮再生的驱动因素，充当ISCs的生态位细胞，但巨噬细胞特异性PTGER4缺乏对肠道稳态无影响。在本研究中，我们发现Ep1和Ep4在ISCs上高度表达，Ep1/Ep4DKO抑制ISC的自我更新维持。我们得出结论，EP1和EP4以ISC固有的方式发挥作用。 肠道巨噬细胞在肠道发育、内环境稳定、再生、衰老、病原体感染以及炎症中起着关键作用。肠巨噬细胞是一种驻留在组织中的巨噬细胞，其功能也受到各种组织因子的精细调节。越来越多的证据表明，巨噬细胞在肠道干细胞中起着关键作用。CSF1R阻断导致Lgr5+ ISC减少和肠上皮细胞系的异常分化。肠巨噬细胞中的AhR消除也会干扰肠上皮细胞的发育。巨噬细胞分泌肝细胞生长因子，促进ISC自我更新和分化。本研究揭示了肠巨噬细胞在ISC自我更新中的一种新机制。肠道巨噬细胞在神经免疫干细胞调节回路中充当信号传递细胞，并通过上游肠道5-羟色胺能神经元调节ISC自我更新。肠巨噬细胞表达Htr2a和Htr3a，这是肠内5-羟色胺能神经元启动5-HT信号所必需的。肠巨噬细胞中5-HT与其受体Htr2a/3a的结合促进Ptges表达和PGE2释放，从而通过Wnt/β-catenin通路驱动ISCs自我更新。除肠巨噬细胞外，一些5-HT受体也在肠上皮细胞中表达，其在ISCs自我更新中的确切作用仍需进一步研究。 肠道微生物群在宿主健康和疾病中起着关键作用，其调节主要依赖于细菌细胞成分的直接刺激和细菌代谢产物的作用。细菌细胞成分通过直接刺激结肠粘膜中树突状细胞和结肠细胞表达的Toll样受体(TLR)影响免疫系统的生理和病理功能。只有少数细菌代谢物被定义，如短链脂肪酸(SCFAs)，其中大多数还不为人所知。本研究证明只有VA驱动Tph2和ISC特征基因的表达。最近的一项报道显示，许多细菌代谢物可被结肠细胞吸收并进入体细胞血液，表明细菌代谢物在宿主健康和疾病调节中的关键作用。Kaiko等人报道，在类器官形成试验中，许多细菌代谢物能抑制ISC自我更新。本研究表明肠道微生物群和代谢物VA是ISC自我更新和肠道再生所必需的。此外，VA可以抑制NuRD复合物在Tph2启动子上的富集，从而启动Tph2表达，进而促进肠道5-羟色胺能神经元中的5-HT生成。在我们的研究中，我们通过体内谱系追踪实验证明，细菌代谢物VA可以诱导ISC自我更新。Kaiko等人和我们的研究结果之间的差异表明，特定的细菌代谢物在调节肠道内环境稳定和再生方面可能具有不同的作用。我们的工作增加了一个由肠神经系统、肠道免疫细胞和肠道微生物群调节ISC的新层面。 不同肠段和结肠的微生物水平不同。在这项研究中，我们关注回肠和结肠，它们表现出相似的表型。我们发现注射的Megasphaera massiliensis分布在回肠和结肠。至于其他微生物的节段分布，还需要进一步研究。肠道微生物群和肠上皮内环境稳定之间的联系是一个令人着迷的领域，越来越多的研究揭示了“微生物群-上皮”的交叉对话，如“真菌代谢产物-巨噬细胞-上皮完整性”轴和“产乳酸菌-乳酸-肠干细胞-上皮发育”轴。Lee等人发现，乳酸产生菌通过在Paneth和基质细胞上表达的乳酸受体GPR81促进ISC介导的上皮细胞发育。然而，关于微生物群和肠神经细胞之间的串扰，以及“微生物群-神经”串扰对ISCs干性调节的影响，我们知之甚少。在此，我们揭示了ISC自我更新维持的新生态位因子(包括微生物群代谢产物VA和神经递质5-HT)和生态位细胞(肠道5-羟色胺能神经元，PGE2+巨噬细胞)，这为ISC调节提供了额外的层面。