新型双载荷ADC！比ADC联合用药更有效？

前言

乳腺肿瘤通常由具有不同基因表达谱的不同细胞群组成。乳腺肿瘤异质性是导致化疗后耐药、复发和转移的主要因素。目前获批的用于HER2阳性乳腺癌的T-DM1等ADC，虽然疗效不错，但经常存在无法对抗肿瘤内异质性相关的问题。

来自美国德克萨斯大学休斯顿健康科学中心的安志强教授和Kyoji Tsuchikama 副教授，结合双方关于抗体与点击化学的优势，构建出了“双载荷ADC”。并且其DAR可灵活调节，如 2 + 2，4 + 2和2+ 4。从而微调 ADC 的理化特性、功效和毒性特征。

作者 | NING

01“双载荷ADC”的结构设计  

抗体使用的靶向HER2的Trastuzumab。侧链是研究者合成的一种三叉分支链，该分支链有两个接头为“N3”，一个接头为“me-tetrazine”，其中“N3+二苯并环辛炔DBCO”为一个点击化学对，“me-tetrazine+反式环辛烯（TCO）”为一个点击化学对，并且证实这两个点击化学对不会发生交叉偶联。同时前者DBCO偶联了“谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（GluValCit）-PABC接头-MMAE”；后者TCO偶联了“GluValCit-PABC接头-MMAF”。通过这种结构设计，便合成了基于点击化学的“双载荷ADC”

02“双载荷ADC”的DAR灵活性

通过调整分支链的的结构与点击化学反应对，可实现双载荷ADC的灵活重组，微调ADC的物理化学性质，功效和毒性特征。液相色谱（LC）-质谱（MS）表明，这种双载荷偶联不会产生杂质偶联物。将每种偶联物在PBS（pH 7.4）中在37°C下孵育28天后，ADC均未观察到显著降解或聚集。

03“双载荷ADC”的细胞杀伤毒性  

“双载荷ADC”仅在表达HER2的细胞系中表现出高细胞毒性，KPL-4 细胞中的EC50值为 0.017–0.029 nM，JIMT-1 细胞中EC50值为0.024–0.045 nM. HER2阴性细胞系中均未观察到显著毒性。

MDR1基因，即多药耐药基因,含有MMAF的单药和“双载荷ADC”对这种高耐药细胞类型均表现出有效的细胞毒性，而MMAE单药ADC则没有。这一结果表明，“MMAF的共同结合”可以帮助疏水性化疗药物（MMAE）克服具有极高抗性的乳腺肿瘤。

04“双载荷ADC”对HER2异质性/耐药性的乳腺肿瘤的治疗潜力很大  

研究者建立了由HER2阳性JIMT-1细胞和HER2阴性231细胞（4：1）转移到免疫缺陷PDX鼠。这种混合肿瘤生长迅速，免疫组化显示肿瘤内HER2阳性和阴性细胞的异质分布。

MMAF DAR 4 ADC在该HER2异质模型中仅表现出对肿瘤生长的有限抑制作用。这一结果与我们之前关于JIMT-1单细胞系提供完全缓解的显著功效的报告形成鲜明反差，猜测可能是由于MMAF单独使用无旁观者效应，导致在体内实验无法高效发挥作用。

MMAE/F 4+2的“双载荷ADC”完全消除了该异质瘤，该组小鼠也一直未发生死亡。

为了使上述实验结果更加清晰，研究者使用1mg /kg的较低剂量治疗，结果发现：MMAE / F 4 + 2“双载荷ADC”的治疗效果进一步凸显。这一结果也凸显了“MMAF共结合”治疗乳腺肿瘤耐药性的优势。同时，鸡尾酒疗法“MMAF DAR4+MMAE DAR4”疗效较差，肿瘤生长依旧迅速。

试验结束后通过肿瘤免疫组化，发现所有肿瘤均由HER2阴性细胞组成;未检测到HER2阳性细胞.这一结果表明， MDA-MB-231细胞的增殖是该模型中肿瘤复发的主要因素。

05“双载荷ADC”为什么比“ADC联合用药”更有效？  

为了探索是什么使”双载荷ADC”比ADC联合用药更有效。研究者制备了与Alexa Fluor® 488或Cy5共轭的抗HER2 mAb作为单药ADC的替代物。此外还制备了与两种染料共轭的抗HER2 mAb作为”双载荷ADC”的替代品。

结果显示， 双染料偶联物在肿瘤中积累比共施单染料抗体荧光更聚集更强 ，基于这一观察结果，研究者推测，靶向相同抗原的两种单药ADC的联合治疗可能引起结合竞争，导致每种有效载荷的递送效率降低。

06总结与展望  

1.相比于MMAE=4，MMAE/F=4+2更具备抗耐药性，同时可以发挥出旁观者效应

2.相比于MMAF=4， MMAE/F=4+2具有旁观者效应，在异质瘤中抑瘤效果显著。

3.相比于MMAE=4+MMAF=4， MMAE/F=4+2递送效率更高，前者有竞争

4.显示出了点击化学的便捷性、普适性、稳定性、安全性。

点击化学是一种多功能性的工具，它的使用并不局限于某一特定情况，目前多家ADC公司开始布局点击化学在ADC领域的应用，这是一个值得开拓的新方向。

图注：使用点击化学制备ADC的生物技术公司

图源：Nat Biotechnol. 2019 Aug;37(8):835-837.

参考资料：

[1]Yamazaki CM, Yamaguchi A, Anami Y. Antibody-drug conjugates with dual payloads for combating breast tumor heterogeneity and drug resistance. Nat Commun. 2021 Jun 10;12(1):3528.

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[3]Nilchan N, et al. Dual-mechanistic antibody-drug conjugate via site-specific selenocysteine/cysteine conjugation. Antib. Ther. 2019;2:71–78.

[4]Nat Biotechnol. 2019 Aug;37(8):835-837.