科研丨吉大: 共生菌Roseburia通过在小鼠体内产生丁酸盐抑制细菌易位从而缓减肠道菌群失调引起的乳腺炎(国人佳作)

编译：微科盟狗尾巴草，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

肠道生态失调导致肠外疾病发病的确切机制以及共生微生物如何介导这些过程尚不清楚。本研究发现患有乳腺炎的奶牛有明显的肠道菌群失调，其特征是条件致病菌Escherichia_Shigella富集和共生菌Roseburia减少。将患乳腺炎供体奶牛(M-FMT)的粪便菌群移植到受体小鼠，可显著引起乳腺炎并改变小鼠的肠道和乳腺微生物群。值得注意的是，M-FMT促进了病原体从肠道易位到乳腺，而肠杆菌科的减少缓解了M-FMT诱导的小鼠乳腺炎。相比之下，共生菌Roseburia intestinalis通过产生丁酸盐(与炎症信号抑制和屏障修复相关)来改善M-FMT诱导的乳腺炎和肠道、乳腺中的微生物失调，并限制细菌易位。本研究结果表明，共生菌Roseburia可以缓解肠道生态失调引起的乳腺炎，尽管还需要在奶牛和人类中进行进一步研究。

图文摘要  

论文ID

原名：Commensal cow Roseburia reduces gut-dysbiosis-induced mastitis through inhibiting bacterial translocation by producing butyrate in mice

译名：共生菌Roseburia通过在小鼠体内产生丁酸盐抑制细菌易位从而缓减肠道菌群失调引起的乳腺炎

期刊：Cell Reports

IF：9.995

发表时间：2022.11

通讯作者：付云贺

通讯作者单位：吉林大学动物医学学院

DOI号：10.1016/j.celrep.2022.111681

实验设计

结果

1 患有乳腺炎的奶牛有明显的肠道菌群失调，表现为Escherichia_Shigella富集和Roseburia减少

为了研究乳腺炎和肠道菌群失调之间的关系，作者通过临床诊断和体细胞计数(SCC)收集了9头临床乳腺炎奶牛(M)和9头健康奶牛(H)共18份粪便样本(图S1A)。细菌学检测发现，乳腺炎奶牛的乳腺主要富集大肠杆菌(E. coli)(数据未显示)。血液检测发现与H组相比，乳腺炎奶牛具有明显的血液生化特征，包括球蛋白升高，总胆红素和总胆汁酸降低(表S1)。此外，与H组相比，M组奶牛的全身促炎参数上升(图S1B-S1D)。肠道菌群的维恩图分析显示，H组和M组的操作分类单元(OTUs)数量不同(图S1E)。H组和M组粪便样本的主坐标分析(PCoA)评分图显示H组和M组之间有明显分离(图1A和S1F)。此外，与H组相比，M组的微生物丰富度和多样性均有所降低(图1B-1D和S1G-S1I)。在门和属水平上，与H组相比，M组奶牛的细菌组成明显不同(图S1J和S1K)。LEfSe分析显示，与H组相比，M组中Escherichia_Shigella等6个菌属富集，而包括Roseburia在内的其他6个细菌属则减少(图1E-1Q)。利用FAPROTAX进行细菌功能分析，主成分分析(PCA)表明M组与H组相比具有不同的肠道细菌功能(图S1L)。值得注意的是，与H组相比，M组与炎症反应相关的细菌功能(包括人类病原体、硝酸盐和亚硝酸盐呼吸)更丰富(图S1M和S1N)。此外，不同菌属与炎症参数的Spearman相关性显示，M组富集的细菌类群(包括Escherichia_Shigella)与SCC和血清炎症指标呈正相关，而减少的菌属(包括Roseburia)与这些指标呈负相关(图1R)。这些结果表明，与健康奶牛相比，乳腺炎奶牛存在明显的肠道微生物失调，病原微生物增多，共生微生物减少。

图1. 患有乳腺炎的奶牛有明显的肠道菌群失调症状，表现为Escherichia_Shigella富集和Roseburia减少。(A)基于非加权UniFrac距离的PCoA评分图(R2= 0.15118, p = 0.005)测定健康(H)组和乳腺炎(M)组奶牛肠道微生物结构。(B-D) H组和M组肠道菌群α指数。(E)通过LEfSe(线性判别分析[LDA]评分[log 10] > 2.3)分析H组和M组奶牛的常见细菌类群富集。(F-Q)肠道菌群中不同菌属的相对丰度。(R)通过Spearman相关分析，分析肠道重要细菌类群与炎症参数的相关性。相关系数大于0.1；红色表示正相关，绿色表示负相关。颜色的强度与斯皮尔曼相关的强度成正比。数据表示为箱线图(n = 9)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001经Mann-Whitney U检验(B-D和F-Q)。

2 将乳腺炎奶牛粪便菌群移植到小鼠体内诱导小鼠乳腺炎并破坏其血乳和肠道屏障

为了研究肠道菌群失调与乳腺炎发展之间的因果关系，将健康奶牛(H-FMT)和乳腺炎奶牛(M-FMT)粪便菌群移植到小鼠体内(图2A)。与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组小鼠的白细胞浸润和乳腺腺泡结构损伤增加(图2B和2C)，乳腺肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和髓过氧化物酶活性增加(图2D-2F)，乳腺中CD11b+Gr-1+多形核中性粒细胞(PMNs)、CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD3+ T细胞和CD3-CD49b+自然杀伤细胞(NK)显著富集(图2G-2J和S2A - S2D)。据报道，乳腺肺泡中增加的免疫细胞来源于血液，这是由于TJ蛋白的减少破坏了血乳屏障。本研究发现在M-FMT小鼠中除了claudin-2(一种在炎症和感染期间通常增加的渗漏标志物)增加外，检测到的TJ蛋白水平低于对照组或H-FMT小鼠(图2K和S2E)。这些结果表明，M-FMT可诱导小鼠乳腺炎并破坏血乳屏障。

肠道菌群失调引起的肠外疾病通常伴有肠损伤、屏障损伤和全身炎症反应。本研究发现与对照组或H-FMT小鼠相比，M-FMT组小鼠回肠、结肠和肝脏有明显的组织学损伤(图S2F和S2G)，且结肠促炎基因表达增加，显示出更大程度的结肠炎症(图S2H)。M-FMT小鼠粪便中的lipacalin-2(粘膜炎症的特异性标志物)水平高于对照组或H-FMT小鼠(图2L)。此外，与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组血清LPS、TNF-α和IL-1β水平升高(图2M、S2I和S2J)，表明全身炎症反应增强。

血清LPS水平升高意味着肠道屏障的通透性增加。与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组小鼠对FITC-葡聚糖(4 kDa)的肠道细胞旁通透性增加(图2N)，结肠黏液层完整性进一步降低(图2O)，结肠黏蛋白-2(一种主要由杯状细胞分泌的特定蛋白质，形成宿主和肠道微生物之间的第一道屏障)水平持续下降。此外，与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组结肠TJ基因表达减少，包括Tjp1、occludin、claudin-3和claudin-7，但claudin-2表达增强(图2Q)。Western blot和免疫组化分析结果一致(图S2K和S2L)。总体而言，这些结果表明，M-FMT(而非H-FMT)诱导乳腺炎和全身炎症反应，并破坏血乳和肠道屏障的完整性。

图2. 从乳腺炎奶牛到小鼠的FMT诱发了乳腺炎，并破坏了小鼠的血乳和肠道屏障。(A)FMT示意图。将小鼠混合3 d，在确认怀孕后，这些小鼠被抗生素消耗掉原始的共生微生物，然后与健康(H-FMT)或乳腺炎(M-FMT)奶牛制备的肠道微生物悬液孵育。(B)具有代表性的乳腺组织H&E染色图像。比例尺，50μm(上)和20 μm(下)。(C)乳腺组织学评分(n = 7)。(D-F)乳腺促炎指数(n = 7)。(G-J)流式细胞术检测乳腺CD11b+Gr-1+ PMN、CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD3+ T、CD3-cd49b+NK细胞数量(n = 7)。(K)乳腺紧密连接(TJ)蛋白的代表性western blot图像。(L)粪便lipocalin-2水平。(M)血清LPS水平。(N)FITC-葡聚糖的肠细胞旁通透性(4 kDa)(n = 7)。(O)结肠黏液层和杯状细胞用阿利新蓝(AB，上)和MUC2抗体免疫组化染色(下)分析。比例尺，50 μm。(P) MUC2阳性细胞(n = 21)。每组随机抽取3个隐窝计数，每组7只小鼠。(Q)相关结肠基因的qPCR表达(n = 7)。数据以均值± SD表示。每个点表示一个单独的小鼠(C-J，L-N，P，和Q，n = 7)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001经单因素方差分析，然后是Tukey检验(C-J，L，M，P，Q)和Kruskal-Wallis检验，其次是Dunn检验(N)。ns，无显著性。

3 M-FMT通过在受体小鼠中富集Escherichia_Shigella和减少Roseburia引起肠道生态失调

接下来研究FMT对受体小鼠肠道菌群的影响。来自供体奶牛和受体小鼠的所有粪便样本的PCoA评分图显示出明显的分离，并且H组和M组之间的分离似乎在受体小鼠中被放大(图3A)。奶牛和小鼠共存在625个OTUs(图S3A)。各组共有168个核心物种共存(图S3B)。与其他组相比，对照组的肠道细菌种类最少(图3B和S3B)，这表明FMT成功重塑了小鼠的肠道菌群。有趣的是，与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组小鼠肠道中观察到的物种增加(图3B)。此外，与H-FMT组相比，M-FMT组小鼠的丰富度有所增加，但只有系统发育多样性(PD)指数具有显著性(图S3C-S3G)。PCoA发现M-FMT组小鼠与H-FMT组小鼠有明显分离(图3C)。在门和属水平上，与H-FMT组小鼠相比，M-FMT组小鼠显示出不同的肠道细菌组成(图3D和3E)，细菌功能始终不同(图S3H)。与供体相似，M-FMT组与人类病原细菌相关的肠道细菌功能以及硝酸盐、亚硝酸盐呼吸功能增强(图S3I)。LEfSe分析发现M-FMT组中富集了包括Escherichia_Shigella在内的3个不同的细菌属，而与H-FMT组相比，M-FMT组中只有Roseburia被耗尽(图3F和3G)。值得注意的是，在乳腺炎的奶牛和小鼠中，只有Escherichia_Shigella被富集，Roseburia减少(图1F，1M，3H，和3I)。此外，发现与Roseburia相比，Escherichia_Shigella与小鼠的大多数促炎参数呈正相关，但与结肠屏障完整性呈负相关(图3J)。总之，这些结果表明M-FMT反映了受体小鼠供体肠道微生物失调，这可能有助于乳腺炎的发展。

图3. 在受体小鼠中，M-FMT通过富集Escherichia_Shigella和减少Roseburia引起肠道菌群失调。(A)采用基于非加权UniFrac距离(n = 7-9)的PCoA评分图分析供体奶牛(H和M)和受体小鼠(对照组，H-FMT和M-FMT)的肠道微生物结构。(B)观察小鼠肠道菌群的种类(n = 7)。(C)基于非加权UniFrac距离的PCoA评分图(R2 = 0.17004, p = 0.012)显示H-FMT和M-FMT小鼠肠道微生物结构的差异(n = 7)。(D和E)门(D)和属(E)水平的前10种肠道微生物组成。(F和G) LEfSe分析(LDA分数[log 10] > 2.8)显示H-FMT和M-FMT小鼠体内富集的差异菌群。(H和I)差异类群的相对丰度(n = 7)。(L)通过Spearman相关分析分析肠道关键细菌类群与炎症参数的相关性。相关系数大于0.1；红色表示正相关，绿色表示负相关。颜色的强度与斯皮尔曼相关的强度成正比。数据表示为箱线图(B、H、I)。数据以均值± SD表示。每个点表示一个单独的小鼠(C-J，L-N，P，和Q，n = 7)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001经单因素方差分析，采用Tukey检验(B)和Mann-Whitney U检验(H和I)。

4 肠道-乳腺轴上的细菌易位导致小鼠肠道失调引起的乳腺炎

有报道称肠道和乳腺屏障通透性增加增强了肠道菌群易位到乳腺的可能性，这可能会改变乳腺微生物群。为了证实这一假设，研究者分别采集了奶牛和受体小鼠的乳汁和乳腺样本，以研究乳腺微生物的组成和功能。这些样本的PCoA评分图显示了不同组间出现明显的分离(图4A)。牛奶样品的PCoA评分图也观察到H组和M组之间有显著差异(图4B)。此外，与H组相比，M组乳腺微生物丰富度和多样性均有所增加(图S4A-S4F)，细菌组成明显不同(图S4G和S4H)。此外，与H组相比，M组乳汁中富集了Escherichia_Shigella和Bacteroides等7个细菌属(图4C-4E)。值得注意的是，Escherichia_Shigella在M组的粪便和乳汁样本中都有富集(图1E、1F、4C和4D)。

M-FMT组小鼠的乳腺微生物结构与H-FMT组明显分离(图4F)。此外，虽然在alpha多样性分析中未观察到显著性(图S4I和S4J)，但H-FMT组与M-FMT组乳腺菌群的微生物组成差异显著(图S4K和S4L)。此外，与H-FMT组相比，M-FMT组小鼠乳腺中富集了Escherichia_Shigella和Bacteroides等8个细菌属(图4G-4I)。与供体一致，与H-FMT小鼠相比，M-FMT小鼠的肠道和乳腺中富集了Escherichia_Shigella(图3F-3H, 4G和4H)。Spearman相关分析显示，乳腺Escherichia_Shigella与大多数乳腺炎症指标和免疫细胞浸润呈正相关(图4J)。这些结果表明，肠道生态失调可能通过潜在的细菌易位重塑乳腺微生物群，参与乳腺炎的发病机制。

接下来，研究肠道菌群失调是否导致Escherichia_Shigella在肠道-乳腺轴上的易位及其在乳腺炎发展中的作用。为此，绿色荧光蛋白标记的大肠杆菌(GFP-E. coli)在FMT第25天口服。结果在M-FMT组小鼠乳腺中检测到明显的GFP信号，而在对照组和H-FMT组中检测到少量的GFP-E. coli信号(图4K和4L)。未使用GFP-E. coli的小鼠乳腺中未检测到GFP信号。这些结果表明，M-FMT促进了病原体在肠-乳腺轴上的易位。接下来，研究了肠道易位的Escherichia_Shigella在肠道失调性乳腺炎发病机制中的参与程度。为了解决这一问题，在M-FMT过程中使用了靶向肠杆菌科的环丙沙星，靶向拟杆菌门成员的甲硝唑和靶向厚壁菌门革兰氏阳性细菌的万古霉素也被用于确认Escherichia_Shigella在调节乳腺炎发展方面的特异性。环丙沙星处理，而不是万古霉素和甲硝唑，减少了M-FMT诱导的乳腺损伤和炎症浸润(图S4M和S4N)。与M-FMT组相比，环丙沙星处理始终降低了M-FMT诱导的促炎标志物水平(图S4O-S4Q)。然而，万古霉素处理组的炎症反应高于M-FMT组，而甲硝唑处理组无显著性差异(图S4-S4Q)。同样，与M-FMT组相比，使用环丙沙星而不是万古霉素或甲硝唑处理可通过减少白细胞数量(包括单核细胞和淋巴细胞)来减少M-FMT引起的系统免疫失衡(图S4R)。综上所述，这些结果表明肠道生态失调导致细菌在肠-乳腺轴上易位，这有助于肠道生态失调诱导的乳腺炎的发展，并暗示共生微生物的潜在保护作用。

图4. 细菌在肠-乳腺轴上的易位导致了小鼠肠道生态失调引起的乳腺炎。(A)供体奶牛(H和M)和受体小鼠(对照组，H-FMT和M-FMT)的乳腺菌群结构的PCoA评分图，基于非加权UniFrac距离(n = 7-9)。(B)基于非加权UniFrac距离的PCoA测定奶牛乳腺微生物结构(R2 = 0.19443，p = 0.005) (n = 9)。(C)通过LEfSe分析(LDA分数[log 10] > 3.6)鉴定在H-FMT和M-FMT小鼠体内富集的差异细菌类群。(D和E)各组富集差异类群的相对丰度(n = 9)。(F)基于非加权UniFrac距离的PCoA测定小鼠乳腺微生物结构(R2 = 0.10404, p = 0.046)(n = 7)。(G)通过LEfSe分析(LDA分数[log 10] > 3)鉴定在H-FMT组和M-FMT组中富集的差异乳腺细菌类群。(H和I)Escherichia_Shigella(H)和Bacteroides(I)的相对丰度(n = 7-9)。(J)通过Spearman相关分析乳腺重要细菌类群与乳腺炎症参数的相关性。相关系数大于0.1；红色表示正相关，绿色表示负相关。颜色的强度与斯皮尔曼相关的强度成正比。(K)经GFP- E. coli口服处理的乳腺代表性图像。比例尺，20μm。(L)指定组中的GFP粒子数(n = 18)。数据表示为箱线图(D、E、H、I)或均值 ± SD(L)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001经单因素方差分析，Tukey检验(L)和Mann-Whitney U检验(D、E、H、I)。

5 共生Roseburia可改善小鼠肠道失调引起的乳腺炎

考虑到M和M-FMT 组肠道菌群中Roseburia减少，以及共生菌在肠道失调诱导的乳腺炎中潜在的保护作用，接下来通过给M-FMT小鼠补充Roseburia属的物种Roseburia testinalis(R. testinalis)来研究Roseburia在乳腺炎发展中的作用。结果发现，R. testinalis可改善M-FMT诱导的乳腺组织学损伤(图5A和5B)。同样，与M-FMT组相比，补充R. testinalis可降低乳腺促炎标志物水平(图5C-5E)。此外，用R. testinalis处理后通过增加乳腺TJ蛋白水平来恢复M-FMT引起的血乳屏障损伤(图5F和S5A)。

接下来发现，补充R. testinalis通过降低粪便lipocalin-2水平缓解了M-FMT诱导的粘膜炎症(图5G)。与M-FMT组相比，R. testinalis处理小鼠血清TNF-α、IL-1β和LPS水平降低(图5H-5J)。此外，R. testinalis处理还降低了M-FMT诱导的FITC-葡聚糖(4 kDa)肠旁细胞通透性的增加(4 kDa)(图5K)。与M-FMT组相比，补充R. testinalis改善了肠道黏液层，增加了黏蛋白-2的表达(图5L-5N)。此外，补充R. testinalis在基因和蛋白质水平上逆转了由M-FMT引起的结肠TJ表达的下降(图5O, 5P和S5B)。综上所述，这些结果表明，在小鼠中，共生Roseburia对肠道菌群失调诱导的乳腺炎、全身炎症反应和屏障损伤具有保护作用。

图5. 共生Roseburia可改善小鼠肠道生态失调引起的乳腺炎。(A)乳腺代表性H&E染色图像。比例尺，50μm。(B)乳腺组织学评分(n = 6)。(C-E) ELISA检测乳腺促炎指标(n = 6)。(F)乳腺TJ蛋白的代表性western blot图像。(G)粪便lipocalin-2水平(n = 7)。(H-J)血清炎症参数浓度(n = 6)。(K) FITC-葡聚糖的(4 kDa)肠细胞旁通透性(n = 6)。(L和M)结肠黏液层和杯状细胞用阿利新蓝(L)和MUC2抗体免疫组化染色(M)。比例尺，50μm。(N)MUC2阳性细胞(n = 18)。每组随机抽取3个隐窝计数，每组6只小鼠。(O)用qPCR方法测定各组结肠相关基因表达(n = 6)。(P) Western blot检测结肠TJ蛋白。以Villin和β-肌动蛋白作为内源性对照。数据表示为均值 ± SD(B-E、G-K、N、O)。每个点表示一只单独的老鼠(B-E和G-K， n = 6)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001双因素方差分析(O)和单因素方差分析后进行Tukey检验(B-E、G-J、和N)，Kruskal-Wallis检验后为Dunn检验(K)。

6 R. testinalis通过产生丁酸盐改善屏障完整性和抑制炎症反应来缓解肠道失调引起的乳腺炎

肠道Roseburia含量与SCFAs，特别是丁酸盐的产生相关，与H组相比，M组奶牛肠道中SCFA水平降低，但只有丁酸盐和戊酸盐具有显著性(图6A-6G和S5C)。同样，与H-FMT组相比，M-FMT组小鼠的乙酸盐、丁酸盐和戊酸盐显著降低(图6H-6N)。供体中，丁酸盐和戊酸盐与SCC、血清LPS和IL-1β呈负相关(图6O)。在受体小鼠中，乙酸盐和丁酸盐与大多数炎症和屏障完整性参数相关，而戊酸盐相关性较低(图6P)。这些结果表明，丁酸盐可能调节奶牛和小鼠乳腺炎的发病机制。此外，在奶牛和小鼠中，肠道Roseburia丰度与丁酸盐浓度呈正相关(图6Q和6R)。值得注意的是，尽管供体和小鼠之间的总SCFAs相似，但受体小鼠的丁酸盐浓度更高(图6C和6J)，这可能是与供体相比小鼠Roseburia丰度增加的反应(图6Q和6R)。此外，尽管Roseburia丰度与牛和小鼠体内的乙酸盐相关，且与小鼠体内的戊酸盐相关(图S5D - S5G)，但在H组和M组之间的乙酸盐水平上没有观察到显著性(图6A)，在牛体内戊酸盐和Roseburia之间的相关性(图S5E)表明，只有丁酸盐可能由Roseburia产生。此外，丁酸盐处理缓解了M-FMT诱导的乳腺炎；与M-FMT小鼠相比，丁酸盐处理改善了乳腺损伤和炎症细胞因子的产生(图6S-6V)。同样，补充丁酸盐通过恢复TJ蛋白水平缓解了M-FMT引起的血乳屏障损伤(图6W和S5H)。

乳腺促炎信号(包括核因子κB(NF-κB)和NLRP3)的激活增加，负责促炎细胞因子的产生，并参与乳腺炎的发病机制。与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组小鼠乳腺中NF-κB和NLRP3通路的激活增加(图S6A和S6B)。此外，最近发现，环状GMP-AMP合成酶(cGAS)介导的干扰素基因刺激因子(STING)激活是NF-κB和NLRP3激活的重要调节因子。事实上，与对照组或H-FMT组相比，M-FMT组小鼠乳腺cGAS-STING激活增加(图S6C和S6D)；与M-FMT组小鼠血清LPS水平和乳腺Escherichia_Shigella丰度增加一致，M-FMT组小鼠的乳腺toll样受体4(TLR4)水平高于对照组或H-FMT小鼠(图S6C和S6D)。与M-FMT组相比，R. testinalis和丁酸盐处理组TLR4-cGAS-STING-NF-κB/NLRP3的激活减少(图S6E和S6F)。综上所述，这些结果表明Roseburia通过产生丁酸盐改善屏障完整性和抑制炎症反应来缓解肠道生态失调引起的乳腺炎。

图6. R. testinalis通过产生丁酸盐改善屏障完整性和抑制炎症反应来缓解肠道生态失调引起的乳腺炎。(A-G)利用靶向代谢组学测定奶牛粪便样品中的SCFA浓度(n = 9)。(H-N)小鼠粪便样品中SCFA的浓度(n = 7)。(O和P) SCFAs与奶牛(O)和小鼠(P)乳腺、血清(S_)和结肠(C_)炎症参数之间的Spearman相关性。红色为正相关，蓝色为负相关。颜色的强度与斯皮尔曼相关的强度成正比。(Q和R)通过Pearson校正分析确定奶牛(Q)和小鼠(R)肠道Roseburia含量与粪便丁酸盐浓度之间的相关性。(S)乳腺代表性H&E染色图像。比例尺，50 μm。(T)乳腺组织学评分(n = 6)。(U和V) ELISA检测乳腺TNF-α(U)和IL-1β(V)水平(n = 6)。(W)乳腺TJ蛋白的代表性western blot图像。数据用箱线图(A-N)或均值 ± SD(T-V)表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001Mann-Whitney U检验(A-N)和单因素方差分析Tukey检验(T-V)。

7 R. intestinalis和丁酸盐能改善肠道和乳腺菌群失调，抑制病原体在肠-乳腺轴上的易位

研究者进一步研究R. intestinalis和丁酸盐补充剂是否有助于改善由M-FMT引起的肠道和乳腺菌群失调。M-FMT组小鼠与R. intestinalis或丁酸盐处理组的小鼠有明显的分离(图7A)，表明不同的肠道微生物结构。此外，R. intestinalis和丁酸盐处理组显示肠道微生物组中观察到的物种减少，但不显著(图7B和S7A-S7C)。在门水平上，与M-FMT组相比，R. intestinalis和丁酸盐处理组的变形菌门较低，拟杆菌门较高(图7C)。同样，在不同组中观察到不同的细菌组成(图S7D)。此外，R. intestinalis和丁酸盐处理组显示出相似的肠道细菌功能，但与M-FMT组明显不同(图7D)。具体来说，与人类病原体相关的细菌功能在M-FMT组中增强，但在R. intestinalis和丁酸盐处理后发生逆转(图S7E)。此外，在M-FMT组中富集的Escherichia_Shigella等潜在病原菌在R. intestinalis和丁酸盐处理后被耗尽(图7E和7F)。

同样，R. intestinalis和丁酸盐处理的小鼠乳腺微生物结构与M-FMT组小鼠明显不同(图7G)。有趣的是，与M-FMT组相比，R. intestinalis和丁酸盐处理的小鼠乳腺细菌α多样性增加(图7H和S7F-S7I)，且改变了细菌组成，特别是减少了M-FMT引起的乳腺中Escherichia_Shigella的丰度(图7I和S7J)。此外，R. intestinalis和丁酸盐处理小鼠乳腺中也显示出类似的细菌功能，这与M-FMT处理的小鼠明显不同(图7J和S7K)。与肠道微生物组中发现的结果一致，与M-FMT小鼠相比，R. intestinalis和丁酸盐处理小鼠降低了Escherichia_Shigella的丰度(图7K和7L)。值得注意的是，与M-FMT组相比，R. testinalis和丁酸盐处理减少了GFP-E. coli，也降低了从肠道转移的乳腺GFP-E. coli(图S7L)。综上所述，这些结果表明，R. intestinalis和丁酸盐干预可以改善小鼠肠道和乳腺的菌群失调，并抑制细菌在肠-乳腺轴上的易位。

图7. R. intestinalis和丁酸盐能改善肠道和乳腺菌群失调，抑制病原体在肠-乳腺轴上的易位。(A)基于未加权UniFrac距离的M-FMT、M-FMT + R. ntestinalis(R. i)和M-FMT +丁酸盐组粪便样本的PCoA评分图。(B)观察到的肠道菌群种类(n = 6)。(C)门水平的肠道微生物组成。(D)前十名肠道微生物功能的PCA评分图。(E)通过LEfSe分析(LDA分数[log 10] > 3)鉴定在不同组富集的差异菌群。(F)肠道Escherichia_Shigella相对丰度(n = 6)。(G)基于未加权UniFrac距离的乳腺样本PCoA评分图(n = 6)。(H)观察到的乳腺菌群种类(n = 6)。(I)门水平的乳腺微生物组成。(J)前十名乳腺微生物功能的PCA评分图。(K)通过LEfSe分析(LDA分数[log 10] > 3.5)鉴定在指定组富集的差异菌群。(L)乳腺Escherichia_Shigella相对丰度(n = 6)。数据用箱线图(B、F、H和L)表示。*p < 0.05，***p < 0.001单因素方差分析，Tukey检验(B、F、H、L)。

讨论

越来越多的证据表明，在乳腺疾病中有一个潜在的肠-乳腺轴。然而，病原体或共生微生物在这一背景下参与的潜在机制仍然未知。本研究发现患有乳腺炎的奶牛有显著的肠道菌群失调，这有助于乳腺炎的发展。潜在的机制可能归因于肠道和血乳屏障的破坏，这使得有害因素(如LPS和致病菌)从肠道转移到乳腺。然而，共生Roseburia可通过产生丁酸盐来恢复肠道屏障的完整性，从而限制肠道病原体的扩张和易位。这些结果表明，在乳腺炎期间，乳腺病原体可能来自肠道，而不仅仅是偶然的致病性感染，并强调了肠道共生微生物及其阳性代谢物通过限制细菌在肠-乳腺轴上的易位在乳腺炎发病机制中的作用。

有研究表明，肠道菌群在乳腺炎发病机制中起着不可或缺的作用。在本研究中，M-FMT(而非H-FMT)导致小鼠乳腺炎。来自肠道的炎症增加会破坏远端器官的屏障完整性；反过来，屏障的渗漏通过允许肠道衍生的微生物相关分子模式(MAMPs)的积累促进了疾病的后续发展。事实上，M-FMT小鼠显示血乳功能下降，这在其他乳腺炎模型中已被广泛报道。同样，M-FMT诱导粘膜炎症并破坏肠道屏障，导致内毒素血症和全身炎症增加，从而诱发乳腺炎，这支持了肠道渗漏是肠道失调引发肠外炎症的第一步的假设。

除了增加获得MAMPs的途径外，肠道渗漏还会促进细菌从肠道易位到肠外器官。作者之前的研究还发现，Stenotrophomonas可以通过血液从瘤胃转移到乳腺。在本研究中，M-FMT促进了Escherichia_Shigella在肠-乳腺轴上的易位。据报道，肠杆菌科在食用HFD引起的代谢不良小鼠的乳腺中积累，这支持肠道菌群在改变乳腺微生物组方面的作用。然而，肠杆菌科在HFD小鼠的肠道中没有富集，这表明不同的宿主状态和组织特异性编排了微生物谱。值得注意的是，在H和H-FMT组小鼠的肠道和乳腺中都存在少量细菌，在H-FMT组小鼠中检测到少量GFP-E. coli易位。这一证据表明，许多条件必须满足肠道病原体易位和异位定植乳腺。首先，肠道和乳腺屏障必须被破坏，使肠道微生物侵入乳腺。在本研究中，M-FMT组检测到肠道和乳腺屏障通透性增加，而H-FMT组未检测到。其次，肠道菌群失调使肠道中机会性致病微生物大量繁殖。正常情况下，肠道处于严格的厌氧环境中，有利于厚壁菌门和拟杆菌门等专性厌氧细菌的生存。然而，由肠道炎症或微生物失调引起的肠道通透性增加提升了肠道腔内的氧含量，允许变形菌门等兼性厌氧菌蓬勃生长。代谢产物包括硝酸盐和亚硝酸盐，富集在M-FMT组的细菌功能中，可以赋予肠杆菌科的生长优势。因此，H-FMT诱导的肠道炎症或生态失调可能有利于肠杆菌科在肠道中的生长，并随后易位到乳腺。第三，乳腺微环境的改变有利于致病菌的生存。肠杆菌科代谢适应于在炎症环境中迅速反应。在当前的研究中，乳腺炎症的增加可能促进了乳腺内肠杆菌科的繁殖，进而促进了乳腺炎的发展。因此，大量肠道病原体的衰减可能介导乳腺炎以及肠道和肠外疾病的发展。

研究表明，淋巴系统和血液循环可能有助于细菌从肠道易位到肠外器官。在人和小鼠中，淋巴细胞在淋巴结之间的迁移可能有助于携带细菌，从而促进细菌易位。相反，有人认为反刍动物可能没有肠-乳腺轴，因为反刍动物的乳腺不是普通粘膜免疫系统的一部分。然而，含有细菌的免疫细胞可以存在于血液中，并聚集在特定的器官中，促进细菌的释放，使血液循环可能是细菌易位最重要的途径。在奶牛中，一项研究表明，细菌可以从肠道迁移到子宫。Fu等人最近发现肿瘤细胞内微生物群可以通过血液促进乳腺癌中的肺转移定植，而这些微生物群不是由感染引起的。考虑到哺乳期间乳房血流量的急剧增加以及肠道失调对血乳和肠道屏障的破坏，反刍动物是否存在肠-乳腺轴仍然是一个悬而未决的问题。值得注意的是，本研究结果并不排除其他MAMPs在乳腺炎发病机制中的作用，如促炎细胞因子、胞壁酰二肽(MDP)、微生物DNA和LPS。相反，多种机制可能协同作用，调节肠道失调异常引起的乳腺炎的发展。

失调的肠道微环境促进了机会致病菌的扩增，降低了共生细菌的丰度，导致肠道微生物群定植抗性受损。事实上，共生肠道微生物群通过产生SCFAs等有益代谢物，在维持屏障完整性方面发挥着重要作用。患有乳腺炎的奶牛已经耗尽了肠道中被称为SCFA生产者Roseburia和Coprococcus的丰度。在M-FMT组中，与H-FMT组相比，Roseburia也减少了，这与之前的研究结果一致，即患有代谢性和炎症性疾病的宿主往往存在较低水平的肠道Roseburia。Seo等人报告称，人体肠道Roseburia丰度与酒精摄入有关，其治疗可缓解小鼠酒精诱导的脂肪肝和肠道屏障渗漏。用Roseburia和膳食植物多糖治疗也缓解了小鼠的动脉粥样硬化。同样，Roseburia对肠道生态失调引起的乳腺炎、粘膜炎症和全身炎症的保护作用也被揭示，这表明Roseburia对肠-乳腺轴的内稳态调节有共同的有益贡献。与报道的丁酸盐生产效率能力一致，患有乳腺炎的奶牛和小鼠都降低了丁酸盐水平。补充丁酸盐反映了Roseburia对乳腺炎和屏障功能的保护作用。作者之前的研究也表明丁酸盐和丙酸盐可以缓解小鼠病原体诱导的乳腺炎。也有类似的结果报道，丁酸盐介导了Roseburia对内毒素血症和动脉粥样硬化发展的保护作用。值得注意的是，奶牛体内的丁酸盐基础水平可能与小鼠不同，这是由于产生丁酸盐的细菌丰度更高和充足的纤维消耗。然而，增加精料日粮可能会降低哺乳期间丁酸盐和其他SCFA水平。此外，检测健康人群和乳腺炎患者体内产生丁酸盐的细菌和丁酸盐水平有助于验证本研究的发现，并为人类乳腺炎的治疗提供潜在的选择。体内氧化剂的存在会影响丁酸盐的产生，炎症和肠道生态失调的应激参与了这一过程的调节，这表明有益的代谢物和不利的肠道环境之间存在复杂的相互作用。高纤维饮食为肠内SCFAs的产生提供了充足的底物。因此，膳食中补充高纤维饮食可能有助于丁酸盐的产生和改善乳腺炎。

据报道，Roseburia可以改善酒精诱导的肠道生态失调。同样，来自肠道微生物群的丁酸盐通过激活PPAR-γ信号抑制了肠杆菌科的异常生长。考虑肠杆菌科的促炎能力和对炎症环境的代谢适应，很难区分Roseburia和丁酸盐降低肠杆菌科丰度、调节炎症和修复屏障的顺序。因此，Roseburia和丁酸盐处理的小鼠肠道和乳腺中屏障完整性的改善和炎症反应的降低可能归因于病原体易位的减少；与此同时，这些改善的微环境也限制了病原体的繁殖。

综上所述，本研究结果表明患有乳腺炎的奶牛具有明显的肠道菌群失调，肠道菌群失调通过破坏肠道和乳腺屏障，引发粘膜和全身炎症，促进病原体易位进入乳腺，从而促进乳腺炎的发展。补充Roseburia可减轻肠道失调引起的乳腺炎，修复小鼠肠道和乳腺屏障损伤，这取决于丁酸盐产生对乳腺炎症信号激活的限制。用Roseburia和丁酸盐处理可以改善肠道和乳腺中的微生物失调，抑制小鼠体内的病原体从肠道转移到乳腺。综上，尽管还需要在奶牛和人类中进行进一步的研究，但我们的研究表明，共生Roseburia通过产生丁酸盐来限制病原体在肠-乳腺轴上的易位，从而缓解了肠道生态失调引起的乳腺炎，这为乳腺炎的发病机制提供了新的认识，并可作为通过“肠道-X轴”干预肠道介导的远端疾病的基础。