作者解读丨内蒙古农大: 热灭活两歧双歧杆菌B1628可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎, 其抗炎作用与调节肠道菌群有关(国人佳作)

编译：九卿臣，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

炎症性肠病(IBD)是一种与肠道菌群失调相关的慢性炎症性疾病，本研究旨在探讨热灭活Bifidobacterium bifidum B1628(HB1628)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎的影响。包括以下3组小鼠(每组8只)：NC组(正常对照)、DSS组(结肠炎)和HB1628组(结肠炎和后生元干预)。DSS组小鼠有明显的体重减轻和组织学损伤、出血性腹泻以及高评分的疾病活动指数(DAI)，显示出血清中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)增加和抗炎细胞因子(IL-13)减少，并伴有小鼠肠道菌群的改变。与DSS组相比，HB1628组的DAIs、组织学评分和血清中促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)水平较低，抗炎细胞因子(IL-13)水平较高。此外，HB1628改善了DSS诱导的肠道菌群失调，使肠道有益菌(如乳杆菌)增加，并减少了IBD中已知的不利菌群。功能宏基因组学研究显示，3条代谢途径在HB1628组中显著富集，分别为有氧呼吸I(细胞色素c)途径、L-苯丙氨酸生物合成超途径以及L-色氨酸生物合成超途径。综上所述，本研究结果表明，HB1628能有效改善DSS诱导结肠炎小鼠的炎症状态和组织损伤，且缓解症状的同时伴有明显的肠道菌群再调节作用。  

论文ID

原名：Heat-Killed Bifidobacterium bifidum B1628 May Alleviate Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis in Mice, and the Anti-Inflammatory Effect Is Associated with Gut Microbiota Modulation

译名：热灭活两歧双歧杆菌B1628可减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎，其抗炎作用与肠道菌群的调节有关

期刊：Nutrients

IF：6.706

发表时间：2022.12.08

通讯作者：张和平，谭验

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室；深圳未知君生物科技有限公司

DOI号：10.3390/nu14245233

实验设计

将小鼠随机分为三组(每组8只)：NC组(正常对照)、DSS组(未进行后生元干预的诱导性结肠炎)和HB1628组(后生元干预的诱导性结肠炎)。从第1-7天DSS组和HB1628组的小鼠分别给予2.5%的DSS溶液，第8-17天HB1628组灌胃HB1628(2×109 CFU/0.2 mL生理盐水)，NC组和DSS组给予相同量的生理盐水。在第1-7天之间和第18天监测DAI变化，并在第18天处死所有小鼠，测量整个结肠长度，计算结肠长度与重量的比值来反映结肠组织水肿。取远端结肠(距肛门2 cm)，固定于4%多聚甲醛中进行组织病理学分析，组织标本切片染色后用光学显微镜观察，并根据上皮细胞脱落、结缔组织增殖、炎症和水肿对结肠组织病理学进行评分，血清细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13和TNF-α)使用plextm免疫分析试剂盒进行分析。在实验结束时收集小鼠粪便，对粪便样本进行DNA提取，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行宏基因组测序，物种注释和功能宏基因组分析。

图1 实验设计图。

前言

炎症性肠病(IBD)是一种免疫介导的肠道疾病，其病因涉及环境、遗传、肠道菌失调和宿主免疫等多种因素。目前，IBD的临床管理主要包括药物或手术治疗，然而这些治疗方法中都有一些缺点，特别是药物的副作用和术后并发症。利用不同测序技术对人类肠道菌群的深入研究，逐渐揭示了其在各种疾病中的作用。大量证据表明，IBD与肠道菌群失调有关，其特征是肠道微环境中有益微生物的减少和致病菌的过度生长。因此，肠道菌群的微生物干预在缓解IBD方面的潜力逐渐成为研究的热点。

粪便菌群移植(FMT)是将健康供体的粪便菌群移植到患者的胃肠道内，旨在重建健康的肠道菌群并恢复其有益功能，该方法已证明了其在治疗IBD中的临床疗效。Tan等人回顾了截至2021年11月8日关于FMT临床应用的论文，发现FMT可以提高临床缓解率。益生菌能降低炎症和改善肠道屏障功能，并可以将肠道菌群的失调恢复到相对健康状态。因此，美国胃肠病学协会(AGA)研究所建议在患有克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)的成人和儿童临床试验中使用益生菌。然而，一些研究没有观察到益生菌对改善IBD的显著临床效果，当使用大肠杆菌Nissle 1917进行干预时观察到腹泻和恶心等不良事件，这些影响可能与益生菌的菌株特异性和活菌与宿主的实际活性相互作用有关。FMT和益生菌干预都依赖于将活菌引入患者的肠道，因此生物安全风险不容忽视。

后生元被定义为“对宿主有益的无生命微生物和/或其成分的制备”，越来越多的研究表明，后生元在管理各种疾病方面有良好的临床效果。例如临床试验已经证实，热灭活Bifidobacterium bifidum MIMBb75可以缓解肠易激综合征，无活性的Lactobacillus reuteri DSMZ 17648对控制幽门螺杆菌感染有积极作用。其他一些研究表明，给予热灭活的Akkermansia muciniphila对改善超重或肥胖胰岛素抵抗患者的多种代谢指标具有显著的效果，这与补充活的Akkermansia muciniphila相当。与益生菌相比，后生元具有储存稳定性和生物安全性，当涉及到炎症性胃肠道疾病如IBD时，活菌可能通过微生物相关的分子模式激活先天免疫从而加重炎症症状，而后生元已显示出多种生物活性，包括抗炎、降压、抗氧化、免疫调节、降低血清胆固醇和抑制异常细胞增殖等。目前，对后生元功能的研究仍处于起步阶段，需要进一步的研究来揭示其有益功效和作用机制。

从青海省海北州牧区一名健康婴儿的粪便样本中分离出Bifidobacterium bifidum B1628，该菌株具有良好的酸和胆盐耐受性。此外，其代谢物富含抗坏血酸、咖啡酸、褪黑素和异丁基酮，通过非靶向代谢组学分析，可以发挥抗氧化、抗炎、和胃肠道调节作用(数据未发表)。本研究旨在探讨Bifidobacterium bifidum B1628在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中的作用，特别是从调节免疫和肠道菌群的角度。

结果

1 靶向代谢组学检测HB1628中的有机酸和短链脂肪酸

HB1628中有机酸和短链脂肪酸的种类和含量如图2所示。检测到10种有机酸，包括乳酸(0.0726±0.00)、柠檬酸(12872.71±211.9)、酒石酸(50.03±2.49)、苹果酸(253.88±17.60)、苯乳酸(3421.95±296.78)、琥珀酸(2775.86±264.70)、4-羟基苯乳酸(826.33±41.88)、苯甲酸(32127.70±1675.55)、香草酸(21.38±4.11)和苯丙氨酸(7882.86±242.52)，苯甲酸和柠檬酸的含量最高。发现了5种短链脂肪酸，分别为乙酸(402.56±40.09)、丙酸(324.42±64.46)、丁酸(10.08±3.80)、戊酸(104.23±26.26)和己酸(12.14±0.63)，其中乙酸和丙酸占优势。

图2 热灭活Bifidobacterium bifidum B1628中的有机酸和短链脂肪酸。绿色梯度代表不同种类的有机酸，红色梯度代表不同种类的短链脂肪酸。误差条代表了五项测定的标准差。(原文图1)

2 HB1628可减弱DSS诱导的小鼠结肠炎

使用HB1628治疗小鼠10天，以确定其对结肠炎的改善作用(图3A)。DSS显著抑制了两组小鼠的体重增加，在停止DSS摄入后，体重减轻效果一直持续到第10天开始逆转(图3B)。DAI是结肠炎的一个指标，在整个DSS诱导期间均有所上升(图3C)，在第18天，DSS组的DAI值显著高于NC组(p<0.05；图3D)，HB1628干预降低了DAI，但并不显著(p>0.05；图3D)。在第18天，DSS组和HB1628组的结肠长度/重量比值均显著小于NC组(p<0.001；图3E)，但HB1628组的比值显著大于DSS组(p<0.05；图3E)。NC组的肠道组织较为健康，DSS组则有严重的诱导性炎症浸润、上皮细胞损伤和组织水肿，而HB1628组的严重程度明显低于DSS组(图3F)。因此，DSS组的组织学评分明显高于NC组和HB1628组(p<0.001；图3G)，但NC组与HB1628组之间的差异无统计学意义(p>0.05；图3G)。这些结果共同表明，DSS诱导了小鼠的结肠炎，而HB1628干预减轻了结肠炎的严重程度。

图3 热灭活Bifidobacterium bifidum B1628干预减轻了葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎的结肠损伤。

(A)实验设计。(B)每日体重变化。(C,D)在DSS诱导期间和第18天的疾病活动指数。(E)结肠长度/重量。(F)第18天结肠组织切片的苏木精和伊红染色代表性显微镜图(放大20倍和200倍)。(G)组织学评分。对照组(NC)：无DSS诱导；DSS组(DSS)：2.5%DSS诱导；HB1628组(HB1628)：2.5%DSS，0.2 mL Bifidobacterium bifidum B1628 (每组n=8；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。误差条表示标准偏差。(原文图2)

3 HB1628可调节血清细胞因子水平

细胞因子是由免疫和免疫相关细胞产生的可溶性蛋白，用于维持免疫稳态和响应外部损伤，反映了小鼠的炎症状态。在第18天测定了三组小鼠的血清细胞因子水平(图4)，DSS组的促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平明显高于NC组(p<0.01；图4)，抗炎细胞因子IL-13水平呈相反的趋势。与DSS组相比，HB1628组的TNF-α和IL-1β水平显著降低(p<0.05)，而IL-6水平不显著(p>0.05)，但IL-13水平显著升高(p<0.05)，抗炎细胞因子IL-10的变化趋势与IL-13相似。这些结果共同表明，DSS引起了结肠炎症反应，而HB1628的治疗在很大程度上减轻了结肠炎症。

图4 三组小鼠在第18天的血清细胞因子水平。

测定5种细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-13的血清浓度。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。(原文图3)

4 HB1628干预调节肠道菌群结构

采用下一代宏基因组测序技术来表征小鼠肠道菌群的多样性和组成。NC、DSS、HB1628组间Shannon和Simpson指数差异无统计学意义(p<0.05；图5A、B)。然后通过主坐标分析(Bray-Curtis距离)分析小鼠肠道菌群的β多样性，发现NC、DSS和HB1628组的粪便菌群存在显著差异(Adonis检验：R2=0.305，p=0.002；图5C)，通过非度量多维尺度分析进一步证实了这一结果。虽然代表三个样本组的符号在评分图中表现出轻微的重叠，但基于组的分布趋势很明显(stress=0.10；图5D)。

图5 三组小鼠在第18天肠道菌群的多样性。

(A) Shannon指数。(B) Simpson指数。(C)主坐标分析(PCoA，Bray-Curtis距离)和(D)非度量多维尺度分析(NMDS，Bray-Curtis距离)(“ns”表示不显著)。(原文图4)

5 组间肠道菌群的科、属和种水平差异

我们鉴定了TOP类群及差异丰富的科、属和种，总体平均相对丰度为完整肠道菌群数据集的1%(图6A，C；表S2-S4)。在科水平上，Verrucomicrobiaceae和Lactobacillacea是三组小鼠肠道菌群中的优势科，表明这些微生物是维持肠道屏障稳定的重要常驻细菌。DSS组和HB1628组的Bacteroidaceae多于NC组(DSS组18.47%，HB1628组20.90%，NC组1.44%)，科水平和属水平的分类学分布基本一致。Akkermansia(属于Verrucomicrobiaceae)和Lactobacillus(属于Lactobacillaceae)是所有组的优势属，然而与其他两组相比，DSS组检测到更多的Akkermansia(DSS组42.60%，NC组21.98%，HB1628组19.34%)，而HB1628组有最丰富的Lactobacillus(HB1628组30.93%，NC组21.99%，DSS组11.73%)。在物种水平上，Akkermansia muciniphila和Ligilactobacillus murinus是NC组和DSS组两大优势物种，但在HB1628组中，Akkermansia muciniphila和Lactobacillus johnsonii最丰富(图6，表S2-S4)。

进一步分析两组之间的显著差异(NC组与DSS组；DSS组与HB1628组)，探讨DSS和HB1628对个体肠道微生物的特异性影响。与NC组相比，DSS组的Rikenellaceae和Eubacterium明显减少，Peptostreptococcaceae、Bacteroides vulgatus和Parasutterella excrementihominis显著增加(p<0.05；图6B)，这些细菌可能与DSS诱导的肠道炎症升高有关。

HB1628组的Lactobacillus含量明显多于DSS组(p<0.05)，同时HB1628组的Porphyromonadaceae、Subdoligranulum、Lachnospiraceae bacterium 3_1_46FAA和Alistipes indistinctus明显减少(p<0.05；图6C)。

图6 小鼠肠道菌群的分类分布和丰度差异显著的肠道微生物。

(A)小鼠肠道菌群的科、属和种水平分布。(B) NC组和DSS组与(C) DSS组和HB1628组之间的肠道菌群科、属和种水平存在显著差异。(*p<0.05，***p<0.001)。(原文图5)

6 DSS组和HB1628组之间肠道菌群代谢通路的差异

我们确定了DSS组和HB1628组之间肠道微生物宏基因组中编码的显著差异通路，以评估两组小鼠之间功能微生物宏基因组通路的差异(图7A)。共鉴定出21条差异通路，DSS组中有18条通路显著富集，如S-腺苷-L-蛋氨酸循环I、硫胺回收II、gondoate生物合成(厌氧)、腺苷脱氧核糖核苷酸从头生物合成II、鸟苷脱氧核糖核苷酸从头生物合成II、霉菌酸酯生物合成等。相比之下，HB1628组富集了其余三条通路，即有氧呼吸I(细胞色素c)途径、L-苯丙氨酸生物合成超途径和L-色氨酸生物合成超途径。DSS组和HB1628组之间差异通路的分布不同，表明其代谢功能存在潜在的差异。

图7 肠道菌群代谢通路及相关性分析。

(A) DSS组和HB1628组之间的肠道菌群代谢通路有显著差异。颜色尺度表示粪便宏基因组中编码特定通路的相对丰度，从高相对丰度(2；深棕色)到低相对丰度(−2；深绿色)。误差条表示标准偏差。(B)差异丰度类群与不同参数之间的Spearman秩相关系数的相关热图。颜色标度表示相关系数的强度，范围从0.6(棕色，强正相关)到−0.6(绿色，强负相关)。*p<0.05；**p<0.01。(原文图6)

7 肠道菌群差异与临床参数的相关性

我们构建了一个相关热图来说明肠道菌群与临床参数之间的关系(图7)。发现Lactobacillus(在HB1628组中高度富集)与组织学评分呈显著负相关(p<0.05，R=−0.58)。Lachnospiraceae bacterium 3_1_46FAA(在DSS组中显著富集)与组织学评分、DAI和血清TNF-α水平呈显著正相关(p<0.05，R>0.50)。此外，Subdoligranulum与IL-13呈显著负相关(p<0.01，R=−0.71)，与IL-6呈正相关(p<0.05，R=0.56)，并与L-苯丙氨酸生物合成和L-色氨酸生物合成超途径呈负相关(p<0.05，R>0.50)。

讨论

IBD的病因尚不完全清楚，但我们认为宿主免疫和肠道菌群之间复杂的相互作用在肠道炎症的进展中起着关键作用。本研究旨在确定后生元HB1628对DSS诱导的结肠炎小鼠肠道炎症和肠道菌群失调的缓解作用，结果表明HB1628可以有效调节血清中促炎和抗炎细胞因子之间的平衡，减少结肠组织损伤和调节肠道菌群及其功能通路，这些作用共同减轻了结肠炎的严重程度。给IBD患者使用活益生菌的安全性仍存在争议，使用热灭活的益生菌可以将应用活菌的风险或潜在副作用降至最低。本研究结果表明，Bifidobacterium bifidum B1628制备的后生元可以减轻结肠组织损伤，有利于小鼠结肠炎的缓解。HB1628中的有机酸和短链脂肪酸可能是通过减轻组织损伤和炎症反应来发挥积极作用，例如有机酸可以激活免疫系统，诱导宿主产生抗菌肽等物质，从而抑制肠道病原体的生长。短链脂肪酸具有黏膜免疫调节作用，可以促进B细胞发育，调节T细胞分化和扩张，并激活炎症小体。因此，我们设想后生元可能是改善结肠炎的一种有前景的治疗策略，然而关于阐明后生元减轻结肠炎机制的研究仍然有限。

目前，已经发现了100多个IBD遗传风险位点，包括许多免疫调节基因，如基因编码细胞因子。抗炎细胞因子IL-10和IL-13是组织稳态的组成部分，而促炎细胞因子TNF-α和IL-1β已被证明是IBD中粘膜损伤最重要的病理介质，广泛参与局部和全身炎症。一项研究表明Bifidobacterium adolescentis可降低结肠组织匀浆中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、IL-22和IL-9的水平，同时增加抗炎细胞因子IL-10、IL-4、IL-4和IL-5的水平。热灭活Levilactobacillus brevis SBC8803已被证明可以抑制TNF-α、IL-1β和IL-12的表达水平，从而在氧化应激时增强肠上皮屏障功能，减轻结肠上皮的肠道炎症。此外，该研究还发现，在DSS处理的结肠炎小鼠中，TNF-α、IL-1β和IL-12的表达水平显著升高，经肛门给药热灭活Levilactobacillus brevis SBC8803部分显著逆转。我们的研究一致表明，HB1628干预10天显著降低了促炎细胞因子水平(TNF-α和IL-1β)，增加了血清中的抗炎细胞因子水平(IL-13)。组织病理学分析显示，在炎症部位积累了大量的免疫细胞，表明HB1628的应用明显减少了肠道组织的炎症反应，有利于结肠健康的恢复。

炎症性肠病是一种预后不良的免疫性疾病，涉及多个细胞和分子。假设IBD应激致敏的罪魁祸首不是过度炎症反应，而是肠道菌群失调引发的有害刺激，研究发现任何肠道菌群的改变都可能增加结肠炎患者和实验动物的炎症反应。因此，针对宿主肠道菌群的各种疗法已经出现。与益生菌不同的是，后生元通过促进内源性肠道菌群和有益菌的生长而维持宿主的肠道稳态，而不是将新物种引入肠道菌群。本研究结果表明，DSS诱导显著降低了一些产丁酸细菌的相对丰度，并增加一些炎症相关细菌的相对丰度。同时，在DSS组的粪便菌群中检测到相对丰度较高的Akkermansia muciniphila，它是IBD发病机制中的一把双刃剑。它被认为是一种抗炎物种，但有报道称该物种可降解肠道黏膜的粘蛋白和黏液层，其异常增殖可能是加重肠道屏障损伤、诱发肠道炎症的病理因素。另一项研究报道，Akkermansia muciniphila加重了小鼠结肠炎相关结直肠癌的症状。因此，Akkermansia muciniphila相对丰度的变化与其对健康的总体影响需要仔细解释。

HB1628的干预伴随着肠道菌群组成的显著变化，其处理的结肠炎小鼠粪便菌群中Lactobacillus的数量显著高于DSS组。Lactobacillus与组织学评分呈显著负相关，与DAI、IL-6和TNF-α呈弱负相关，该属的许多物种分泌抗菌物质，通过抑制肠道条件致病菌和产生代谢物来调节肠道稳态，刺激免疫系统并维持肠道菌群平衡和正常的肠道屏障功能。与HB1628组相比，DSS组粪便菌群中Porphyromonadaceae和Alistipes indistinctus的相对丰度高于HB1628组。Porphyromonadaceae被认为是IBD的主要病原体，与肠道屏障功能障碍和炎症有关，而Alistipes indistinctus在IBD中的作用尚不清楚，但其同一属的近缘种是已知的肠道炎症触发菌。此外，在IBD的临床诊断和治疗过程中，患者除了出现胃肠道症状外通常还会出现一些心理健康问题，包括抑郁、焦虑和压力等。与DSS组相比，HB1628组的粪便菌群中Subdoligranulum和Lachnospiraceae bacterium 3_1_46FAA较少，虽然由于抗炎特性这两个类群通常被认为是有益细菌，但在自闭症患者中Subdoligranulum丰度很高，而Lachnospiraceae也被发现与睡眠效率和总睡眠时间呈负相关。因此，尽管与DSS组相比，在接受10天HB1628干预的小鼠粪便菌群中发现的Subdoligranulum和Lachnospiraceae bacterium 3_1_46FAA明显减少，但这不一定是不良反应。

由于HB1628通过促进对宿主有益的微生物来抑制潜在的有害菌，从而缓解DSS诱导的肠道菌群失调，因此功能宏基因组潜力也可能受到调节。我们随后确定了HB1628组和DSS组之间的差异代谢途径，L-色氨酸生物合成和L-苯丙氨酸生物合成的超途径都与氨基酸合成相关，与DSS组相比，它们在HB1628组中均显著富集。在IBD中，色氨酸代谢水平的降低与肠上皮屏障受损有关，一些肠道微生物可将色氨酸转化为生物活性分子，激活芳香烃受体降低炎症反应。此外，色氨酸是人体中重要的神经递质5-羟色胺的前体，具有抗抑郁作用，可改善睡眠质量并具有镇痛作用。L-苯丙氨酸是一种必需的芳香族氨基酸，已被证实具有抗炎作用，可以有效地缓解抑郁和焦虑等精神问题。因此，富集色氨酸和L-苯丙氨酸生物合成途径是HB1628干预后的理想效果之一。

综上所述，本研究表明，HB1628是一种后生元候选药物，在减轻结肠组织损伤、炎症等与IBD相关的症状方面具有很高的应用潜力，症状缓解作用伴随着宿主的血清细胞因子谱、肠道菌群及其编码功能潜力的显著变化。我们的研究结果为HB1628在小鼠模型中减轻结肠炎症状的有效性提供了原理证明，这为未来使用后生元来调节患者的肠道菌群开辟了前景，值得进一步研究HB1628在IBD临床中的功能效应。然而，后生元HB1628中的具体有效物质尚不清楚，因此需要更详细的分离和验证来探索HB1628缓解结肠炎的机制，今后应对不同菌株制备的特定后生元进行更精确的研究。