用于治疗癌症的CD8+T细胞受体(TCR)工程疗法的演变

工程化T细胞受体T（TCR-T）细胞疗法促进了用于治疗人类癌症的日益可靠的肿瘤抗原特异性适应性细胞产物的产生。TCR-T细胞疗法最初专注于靶向共享的肿瘤相关肽靶标，包括黑色素瘤分化和癌睾丸抗原。随着最近的技术发展，靶向来自肿瘤体细胞突变的新抗原已成为可行的，这代表了一种高度个性化的疗法，因为大多数新抗原是患者特异性的，很少在患者之间共享。TCR-T疗法已在世界各地的许多临床前研究和临床试验中进行了治疗实体瘤的临床疗效测试。然而，TCR-T疗法治疗实体瘤的疗效受到许多因素的限制，包括TCR亲和力低，脱靶毒性和靶向抗原丢失导致肿瘤逃逸。本文探讨了肿瘤抗原特异性TCRs的提取过程，包括鉴定合适的肿瘤抗原靶标、抗原特异性T细胞扩增、TCR克隆和验证，包括TCR-T细胞载体构建和表达的技术和工具。我们重点介绍了工程TCR-T细胞疗法最近临床试验的成就，并讨论了当前面临的挑战和提高其安全性和有效性的潜在解决方案，这些见解可能有助于指导未来的TCR-T癌症研究。

一、简介

过继性T细胞转移（ACT）是癌症治疗中最有前途的免疫治疗方法之一。目前有四种开发良好的ACT技术，包括自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法，抗原特异性内源性T细胞疗法（ETC），T细胞受体工程T细胞疗法（TCR-T）和嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）。虽然TIL和ETC疗法分别依赖于来自肿瘤或外周血的T细胞的分离和体外扩增，但TCR-T和CAR-T疗法使用T淋巴细胞的遗传修饰来赋予它们肿瘤抗原特异性。

淋巴细胞的遗传修饰是在30多年前首次提出的，从那时起，该领域已经取得了许多进展，促进了它们的临床效用。正如本期其他地方所讨论的那样，CAR-T方法在治疗某些造血癌方面非常成功，特别是那些针对B细胞特异性表面蛋白CD19的造血癌。CAR-T疗法使用单链可变片段（scFv）嵌合抗原受体（CAR），可以直接识别肿瘤细胞表面抗原，而无需MHC限制，这是TCR定向免疫疗法的一个主要局限性。这些CAR构建体还可以结合几种不同共刺激分子的细胞内结构域，这可以促进T细胞的激活，增殖和效应器功能。然而，虽然CAR-T疗法非常有前途，但它们仅限于靶向肿瘤细胞表面蛋白，这些蛋白通常不表现出高度的肿瘤特异性，并且在实体瘤的情况下几乎没有临床疗效。如下文进一步讨论的那样，TCR-T细胞方法可以克服这两个问题，并在实体癌中产生了令人信服的临床数据。虽然CAR使用抗体样结构进行抗原识别，但TCR-T细胞利用完整的TCR复合物，其中包括由TCR α和β链组成的异源二聚体，抗原识别时T细胞信号通过CD3链簇自然传递。随着完整TCR复合物的表达，工程TCR-T细胞可以识别在肿瘤细胞内和细胞表面表达的多肽片段，从而提供更广泛的靶抗原。从历史上看，TCR-T靶标包括癌胚抗原（CEA，结直肠癌）、糖蛋白gp100（PMEL，黑色素瘤）、T细胞识别的黑色素瘤抗原1（MART-1，黑色素瘤）、黑色素瘤相关抗原3（MAGE-A3）（黑色素瘤/多发性骨髓瘤）和纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）（黑色素瘤/滑膜细胞肉瘤）。最近，TCR-T细胞还靶向肿瘤DNA中体细胞突变产生的新抗原，这些抗原更具肿瘤特异性，但癌症患者的共享量也较少。

这些工程方法可以成功地将T细胞的特异性重定向到选择性靶向肿瘤相关抗原。然而，这些方法的几个重大局限性仍有待克服。在这里，我们回顾了生产TCR-T细胞疗法的当前技术和工作流程。我们总结了目前工程TCR-T疗法靶向的肿瘤抗原，并评估了当前临床试验的临床疗效。此外，我们还概述了需要解决的挑战，以提高TCR-T方法的成功率，并讨论潜在的解决方案。最后，我们对未来研究的关键目标和目的提供了观点，其中包括治疗性肿瘤特异性TCR的个性化鉴定以及改善TCR信号传导和效应器功能的潜在修饰。

二、TCR-T细胞免疫疗法的定义与机制概述

细胞毒性CD8 T细胞通过由α链和β链组成的外源TCR识别靶细胞上以肽的形式与人白细胞抗原I类分子（HLA-I）结合的外来抗原。在识别同源抗原后，有关抗原参与的数量和质量的信息通过细胞内信号转导传递，促进T细胞效应器功能。虽然TCR本身缺乏重要的细胞内结构域，但它与不变的CD3二聚体（CD3γε，CD3δε和CD3ζζ）相关，以激活下游信号机制（图1）。CD3 ε、γ、δ和ζ链均包含一个（ε、γ和δ）或三个（ζ）免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），这些基序通过Src激酶Lck进行磷酸化，从而启动下游T细胞信号传导级联反应。通过这种方式，TCR-CD3复合物在HLA-I /肽识别和T细胞活化之间架起了桥梁。

图1.  T细胞受体（TCR）结构和TCR-T细胞组分。TCR由α链和β链组成。TCR-T是一种用抗原特异性TCR设计的T细胞。

与HLA-I /肽复合物结合的TCR在每个Vα和Vβ结构域上包含三个互补性决定区（CDR）环。其中，CDR1和CDR2编码在TCR的可变片段中，而CDR3由DNA重组事件组成，涉及相邻的Vα和Jα片段（用于α链基因）以及Vβ，D和Jβ片段（用于β链基因）。通过构建TCR α并从具有确定抗原特异性的CDR β链，异位表达的TCRs可以利用T细胞内源性的CD3复合物。该方法用于转基因小鼠，以证明转基因TCR足以指导抗原特异性T细胞分化，后来应用于人T细胞克隆以重定向其细胞毒性。由于TCR-T细胞保留了TCR信号转导途径的所有辅助分子，因此这些细胞可以在低靶细胞抗原密度下完全激活，并且可能优于CAR-T细胞识别。此外，TCR-T细胞输注导致的不良事件较少，包括急性细胞因子释放综合征和神经毒性，这可能是由于天然TCR-CD3复合物的自调节能力。然而，由于TCR-T细胞识别特定的HLA-I /肽复合物，因此它们的使用仅限于表达适当HLA-I同种异型的患者。

三、TCR-T细胞开发的工具和技术

为了分离治疗性TCR，必须首先从患者或健康供体的血液中分离出抗原特异性T细胞，并在体外扩增特异性肽抗原以及γ链细胞因子，包括IL-2、IL-7、IL-15和IL-21。该过程需要事先鉴定可以在患者中安全靶向的特定肿瘤相关肽靶标。选择靶抗原后，可以使用不同的方法来筛选具有所需高亲和力和肿瘤特异性的TCR。临床前安全性测试也是必要的，以确保最小的脱靶效应和分离的高亲和力TCR的交叉反应性.病毒载体通常用于遗传修饰自体患者T细胞以表达经过验证的治疗性TCR，然后再输注回患者（图2）。

图2.  抗原发现、TCR 克隆和 TCR-T 重建的工作流程。TCR-T免疫疗法的开发可以通过三个独立的工作模块来促进：肿瘤抗原鉴定，TCR发现和验证以及TCR-T疗法临床试验。

1、TCR-T治疗的靶抗原

正如Steven Rosenberg的研究小组在2006年报道的那样， MART-1抗原是TCR-T临床试验中首次靶向的肿瘤相关抗原。15例患者通过转移MART-1特异性TCR-T细胞，在输注后至少2个月内，在超过10%的外周血淋巴细胞水平下进行持久移植，并显示出有益效果，包括肿瘤消退。除了抗肿瘤作用外，一些患者还对正常黑素细胞表现出靶向毒性，导致视力或听力问题，但这些问题在很大程度上通过类固醇治疗得到解决。在这一突破之后，针对多种肿瘤抗原的TCR-T疗法已经开发出来，包括靶向MAGE-A3、MAGE-A4、GD2、间皮素、gp100、MART1、AFP、CEA、NY-ESO-1以及衍生自HPV和EBV的病毒肽。其中，NY-ESO-1已被证明是TCR-T细胞最有希望的靶标之一，在治疗滑膜肉瘤方面取得了成功，客观反应率为67%（表1）。

表1.  TCR-T细胞目前靶向的肿瘤抗原。

理想的TCR-T靶抗原是那些仅在肿瘤细胞上表达的抗原，以避免对正常组织的毒性。此外，理想靶标表现出以下特征：（1）引发免疫应答的能力（例如，免疫原性），（2）与驱动肿瘤表型（例如癌基因）以降低抗原丢失和肿瘤免疫逃避的风险相关，以及（3）在癌症干细胞上的表达以促进永久性肿瘤根除。新抗原（NeoAg）是来自体细胞DNA改变的肽靶标，并显示出许多被认为是理想的特征。然而，体细胞突变谱的广泛多样性，加上高HLA-I多态性，意味着绝大多数肿瘤新抗原是个性化的，而不是在癌症患者之间共享的。如下文进一步讨论的，它们通常通过预测方法识别，而不是通过经验手段进行验证，但有一些重要的例外。肿瘤相关抗原（TAA）是起源于内源性野生型蛋白的肽，其在肿瘤中的表达升高，但在健康组织中的大小或空间表达方面受到限制。虽然它们不能证明NeoAgs的绝对肿瘤特异性，但TAAs具有在癌症患者中广泛共享的优点，并且更容易识别和验证。

2、肿瘤相关抗原的鉴定方法

高分辨率质谱（MS）已被证明是促进肿瘤细胞中HLA-I结合肽的直接鉴定的最稳健的高通量方法。通过该方法，通过免疫沉淀（IP）从肿瘤组织或细胞系中分离HLA-I /肽复合物，然后广泛洗涤并应用酸性洗脱缓冲液以解离HLA-I分子和用于IP的抗体的结合肽抗原。该策略允许鉴定每个肿瘤样本数千个经过验证的肽靶标，并已用于鉴定HLA-I木质素瘤治疗胶质母细胞瘤（GB）、黑色素瘤、肾细胞癌（RCC）和结直肠癌（CRC）等。我们的小组已经建立了一个基于MS的高通量管道以及RNA测序，以识别个体癌症患者的肿瘤相关抗原。使用这种方法，我们已经鉴定并验证了与黑色素瘤分化抗原SLC45A2相关的肽作为共享的黑色素瘤相关肿瘤靶标，并产生了识别这些肽的TCR。同样，我们鉴定VGLL1是一种共享的胰腺癌和基底乳腺癌肿瘤相关抗原，已分离出显示抗肿瘤活性的TCRs。靶向这两种TAAs的TCR-T细胞临床试验目前正处于设计阶段。

3、肿瘤新抗原的鉴定方法

虽然基于MS的技术可用于鉴定新抗原，但由于它们的丰度相对较低，并且MS的敏感性有限，特别是对于尺寸有限的肿瘤样品，因此它们更难识别。然而，下一代测序技术的发展有助于识别和靶向这类肿瘤靶标。全外显子组DNA测序与计算预测算法相结合，可以鉴定癌细胞中的特定遗传改变，这些改变可以产生突变肽，并具有在肿瘤HLA-I分子上呈现的能力。所有体细胞突变基因都可以在计算机分析中进行，以预测可能与患者单个HLA-I分子结合的潜在高亲和力表位，从而可能被T细胞识别。HLA-I肽结合预测算法通过使用大型MS洗脱肽数据库而不断更新和改进，其他预测算法试图考虑与控制蛋白酶体片段化肽的细胞内过程的复杂性以及肽向内质网中HLA I类分子的转运相关的生物学变量。其他选择过滤器可用于消除预测免疫蛋白体处理不良或结合亲和力低于相应野生型序列的肽。经常应用的另一个参数包括肿瘤RNA测序，它允许选择具有最高转录本表达的推定NeoAgs，这些NeoAgs更有可能产生丰富的肽用于呈递。重要的是要注意，虽然这些预测方法在识别所呈现和/或免疫原性NeoAgs方面通常可以显示出非常好的准确性，但它们通常预测推定的NeoAg靶标的数量比实际真实靶标的数量高1到2个对数。

通过巨噬细胞增多症发现新抗原是近年来出现的一种新方法。巨噬细胞增多症是细胞偶联过程中发生的一种生物学现象。在此过程中，细胞共享和转移膜和膜相关蛋白。研究人员发现T细胞膜蛋白特异性地转移到存在同源HLA-I /肽复合物的肿瘤靶细胞上。利用这些T细胞 - 靶细胞相互作用，他们通过共同孵育表达标记孤儿TCR的T细胞与同源靶细胞，创建了一个新抗原发现系统。随着荧光标记从T细胞转移到靶细胞，该方法能够分离这些靶细胞并测序同源TCR配体，从而建立了NeoAgs文库。与pMHC酵母显示相比，该方法产生"孤儿"TCR（即具有未知抗原特异性的TCRs）蛋白质试剂，而是使用在其自然环境中表达的孤儿TCRs。

4、肿瘤特异性T细胞和T细胞受体（TCR）的分离

肿瘤反应性T细胞和TCRs可以从自体、同种异体或异种库中鉴定，并且这些方法可以使用HLA-I多聚体、单细胞TCR测序或抗原阴性人源化小鼠。使用HLA-I多聚体方法，抗原特异性CD8 T细胞可以通过多体染色和流式细胞术分选直接分离。然后对这些多克隆T细胞进行同源肽识别和抗肿瘤功能测试，然后继续分离成对的全长TCR序列。这种功能测试通常需要扩增T细胞群，但非扩增抗原特异性T细胞也可以少量分离并进行基于高灵敏度PCR的单细胞TCR分析方法（TCR-SCAN）。使用该方法进行HLA-I多体标记和单细胞分选可以产生具有高亲和力和特异性的TCR。人源化小鼠也被生成以利用小鼠TCR库，该库不经受与人类相同程度的T细胞克隆缺失或耐受性。为此，Li等人生成了具有整个人类TCRα/β基因位点和含有多种T细胞库的嵌合HLA-A2转基因的转基因小鼠，以便能够分离出人类TCR与人类TAAs的对抗。

单细胞测序方法代表了对肿瘤特异性TCR编码基因进行高通量分离的更有前途的方法。使用靶向TCRα和TCRβ位点内每个单个变量（V）和连接（J）元素的RNA诱饵库，可以从剪切的基因组DNA（gDNA）片段中选择性分离TCR编码基因组元件，以进行随后的配对末端深度测序。这使得从人类材料或TCR人源化小鼠中鉴定寡克隆T细胞群中的抗原特异性TCRs成为可能。Ton Schumacher的研究小组使用这种方法鉴定了一大组来自肿瘤内CD8 T细胞的TCR，这些TCR对共享肿瘤抗原具有特异性。该策略还分离出对尚未定义的自体肿瘤相关抗原具有反应性的新型TCR。这一发现可能有助于利用广泛的肿瘤反应性TCR库，不受肿瘤免疫肽组当前知识的限制，这是开发靶向患者特异性新抗原的自体TCR基因疗法的重要的第一步。如果肿瘤特异性TCR可以迅速重新引入自体T细胞中，这将允许将肿瘤反应性TCR库从耗尽的T细胞"移植"到更健康的T细胞群中。

幼稚T细胞也可以是TCR-T治疗的TCR的来源。TAA和NeoAg特异性T细胞可以从癌症患者外周血中的低频前体中提取和扩增，并且可以重新输注或用作抗原特异性TCR的来源。由于癌症患者通常表现出免疫抑制或显性T细胞耐受性，因此HLA-I匹配健康供体的幼稚谱系也代表了可靠的来源，因为它具有巨大而多样化的TCR库，理论上需要T细胞具有任何抗原特异性，包括肿瘤新抗原。已经开发了高通量映射平台，以询问用于个性化过继性T细胞治疗的罕见但具有治疗价值的TCR的快速高效鉴定的幼稚谱系。

四、TCR克隆和验证方法

通过下一代测序鉴定的肿瘤抗原特异性TCR库可用于基因工程T淋巴细胞用于TCR-T治疗。大多数基于TCR的基因治疗方法依赖于T细胞与病毒载体的离体转导。基因治疗中使用的第一批载体是腺病毒。然而，由于它们无法将转基因整合到宿主基因组中，因此在T细胞增殖过程中TCR表达丢失。此外，腺病毒的免疫遗传学特征也限制了它们作为基因治疗载体的使用。相比之下，逆转录病毒作为基因转移载体显示出更大的希望，因为它们可以感染各种各样的细胞，并且具有将转基因插入宿主基因组的能力，这使得异位TCR α/β链稳定表达。源自γ-逆转录病毒（如小鼠白血病病毒（MLV））的逆转录病毒载体已被广泛用于基因转移到人类T细胞中。该方法已被用于递送各种基因，包括自杀基因，TCR基因和CAR。主要缺点是它们无法转导非增殖靶细胞，这排除了在TCR-T治疗中使用静止的T细胞。此外，逆转录病毒插入诱变可能引起潜在的副作用，这凸显了监测载体整合位点和开发更安全载体的重要性。

最近，慢病毒载体（LV）作为基因转移载体获得了更多的牵引力，因为它们可以将基因递送到分裂和非分裂细胞中。虽然幼稚T细胞的转导是旨在提供持久免疫重建的TCR-T疗法的理想选择，但已经开发了方案，允许在没有TCR触发的情况下有效地左心室转导T细胞。IL-2、IL-7和IL-15的组合可促进记忆和幼稚T淋巴细胞的长期体外存活，并在无TCR激活的情况下提高慢病毒转导效率。各种技术，如金门克隆和LR克隆，通常用于构建用于插入TCR α/β基因的载体，最近引入的Gibson组装似乎是非常快速且有前途的高通量方法。腺相关病毒（AAV）是另一种广泛使用的病毒载体。与腺病毒载体相比，AAV具有较低的免疫原性和更宽的细胞向性，因此在癌症基因治疗中得到了广泛的应用。为了促进转基因整合，开发了自互补AAV载体（scAAV），这使得AAV独立于宿主细胞的互补链合成。尽管该方法降低了载体包装容量，但scAAV在临床前模型的疗效方面优于传统AAV。

尽管它们已被广泛使用，但病毒载体不会在预定的基因组位置插入靶转基因;因此，它们可能导致驱动天然基因表达。已经实施了几种策略来提高整合载体的安全性，例如消除负责毒力的病毒基因，将包装基因分裂成不同的质粒，以及在载体的结构中引入灭活开关。将整个病毒基因组插入到远离重要基因和DNA元件的基因组区域也是可行的，从而最大限度地降低干扰天然基因表达的风险。

同时，已经开发了几种非病毒基因编辑方法。mRNA电穿孔已被证明可以实现瞬时TCR和CAR表达，从而最大限度地降低病毒元素持续存在的风险。临床数据表明，mRNA修饰的TCR-T和CAR T细胞都是可行且安全的，没有明显的证据表明对正常组织有脱靶毒性。然而，缺乏持续的TCR表达可能会限制疗效，并需要反复输注。

非病毒性睡美人反转录转座子系统也已通过电穿孔成功将TCR和CAR引入原代T淋巴细胞中，尽管这种基于质粒的基因转移系统的吸引力简单性被与病毒载体相比转导效率降低所抵消，需要在患者输注前进行更长的T细胞扩增。

基因组编辑带来了通过同源定向修复（HDR）将大转基因特异性和高效插入靶细胞的前景。Theodore Roth等人开发了一种不需要病毒载体的CRISPR-Cas9基因组靶向系统，允许在原代人类T细胞基因组中的预定位点快速有效地插入大DNA序列，同时保持细胞活力和功能。使用该方法开发的TCR工程T细胞已被证明可以在体外特异性识别肿瘤抗原，并在体内诱导生产性抗肿瘤反应。非病毒基因组靶向加速了从靶标抗原选择到转基因T细胞生产的过程，并为下一代免疫疗法提供了一种低成本的重新编程T细胞的方法。

在TCR克隆之后，需要广泛的临床前验证来证明工程TCR-T细胞的特异性和安全性，特别是在靶向共享TAAs时。验证包括通过对同源肽抗原进行滴定来评估TCRs的亲和力，以及测量HLA-I匹配肿瘤细胞系的杀伤情况。如果不存在这样的肿瘤细胞系，则可以转导靶细胞以表达抗原和相关HLA-I分子。安全性测试包括测试候选TCR-T对HLA-I匹配初级组织面板的识别，以确保没有正常组织被靶向，这可能导致毒性。在至少2项TCR-T细胞治疗的临床试验中，对正常脑细胞和心脏细胞的交叉反应导致患者死亡。然而，重要的是要注意，其中一个TCR是在转基因小鼠模型中产生的，另一个被修改以增加TCR对靶抗原的亲和力，从而绕过了确保在体内删除危险的自身抗原反应性TCRs的自然耐受机制。这些试验结果强调了在将TCR纳入临床试验之前对TCRs进行广泛安全性测试的重要性，并对所用TCRs的来源发出了强烈的警告。

现在已经开发出用于筛选数百种测序TCRs以进行肿瘤抗原识别的高通量方法，这将促进真正个性化的TCR-T细胞疗法。从TIL和/或PBMC中提取的各种克隆TCR的抗原特异性可以通过与EB病毒永生化的淋巴母细胞系共同培养来评估它们，这些细胞系具有数百种对应于个性化新抗原（NeoAgs），各种TAAs或常见病毒抗原（例如HLA-I免疫肽组）的肽。在一种更公正的方法中，NeoAgs也可以在自体抗原呈递细胞中以迷你基因的形式表达，以评估TCR组合的抗原反应性。引入DNA文库以促进使用睡美人系统快速组装TCRαβ基因是另一种通过配对单细胞TCRαβ克隆和快速组装TCRαβ基因来诱导四聚体引导分离抗原特异性TCRs的方法。测量荧光素酶活性或细胞因子产生的各种报告系统利用流式细胞术或荧光显微镜进行信号检测。许多研究小组使用活化T细胞（NFAT）诱导的核因子来生成报告细胞系，通过候选TCRα/β对有条件地测量抗原特异性活化。

五、TCR-T细胞治疗癌症的临床实验

在 ClinicalTrials.gov（2021-8-9访问）上使用TCR-T疗法的175项研究中，有71项使用针对特定TAA或新抗原的特异性TCR，32项研究已经完成。NY-ESO-1是最常见的靶向抗原，由多种癌症表达，包括骨髓瘤，黑色素瘤和多发性癌（表1和表2）。其他癌睾丸抗原，如PRAME和MAGE蛋白，也是流行的TCR-T靶标，以及黑色素瘤分化抗原MART-1和gp100，以及最近的癌症驱动因素，如WT1，KRAS和TP53。

表2.  报告了TCR-T癌症临床试验。

83个合作者被列为参与TCR-T细胞疗法，包括美国国立卫生研究院（NIH），州政府组织，行业和大学/学术机构。美国国家癌症研究所（NCI）目前支持53个项目，占所有正在进行的试验的20%左右。在开发TCR-T疗法的29家私营公司中，葛兰素史克和Adaptimmune启动了最多的临床试验，分别列出了11项试验和7项试验。最近，报道了一项TCR - T细胞的1期临床试验，该试验使用靶向人瘤病毒（HPV）-16 E7蛋白进行工程改造，用于治疗转移性人瘤病毒相关的上皮癌（NCT02858310）。本研究显示，12例接受治疗的患者中有6例报告了肿瘤的稳健消退，客观临床反应报告。这代表了TCR-T细胞疗法的一项里程碑式的临床试验，表明靶向病毒抗原对病毒相关癌症患者显示出有效的临床结果。作为TCR靶标探索的其他病毒抗原包括HPV-E6蛋白，来自EB病毒（EBV）的抗原以及人类内源性逆转录病毒（HERV）靶标，如HERV-E（表1）。

靶向TAAs MART-1和NY-ESO-1的TCR-T疗法也显示出对晚期黑色素瘤、骨髓瘤和非小细胞肺癌的临床疗效（表2）。已完成的TCR-T临床试验的总体缓解率（ORR）从0%到~60%不等，但几乎一半的试验没有报告临床反应率。值得注意的是，大多数这些TCR-T临床试验招募了少量患者（2至25名），因此ORR不太可能在统计学上准确。因此，需要更大规模的II期和III期临床试验来确认这些TCR-T疗法的实际临床疗效。许多不同的因素导致缺乏一致的临床成功：（1）由靶向正常组织引起的免疫毒性、（2）工程T细胞中TCR表达不足或短暂性、（3）T细胞衰竭和功能障碍、（4）肿瘤免疫逃逸、以及（5）缺乏经过验证的肿瘤特异性抗原靶向大多数癌症患者。克服这些挑战对于在未来取得更大的临床成功至关重要。

六、改善TCR-T细胞疗法的挑战与潜在解决方案

尽管基于TCR-T细胞的免疫疗法已在相当一部分接受治疗的患者中显示出临床疗效，但正如下面进一步讨论的那样，在许多领域仍然需要改进（图3）。

图3.  可以改善TCR-T细胞免疫治疗的方法总结。

1、发现新靶标

目前，用于促进有效和安全的基于TCR-T的免疫疗法的肽抗原靶标非常有限。目前使用的大多数靶标是TAAs，尽管在肿瘤组织中上调，但在正常组织中仍保持低水平表达，这可能导致自身免疫毒性或工程T细胞的耐受性。因此，新抗原似乎是TCR-T癌症治疗最安全的靶标。然而，在TCR介导的ACT中临床开发新抗原的主要挑战包括：（1）新抗原形成突变在很大程度上是私人的，并且在癌症患者之间有所不同，使得难以开发广泛适用的免疫治疗产品;（2）NeoAgs的表达在肿瘤组织中经常是异质性的。尽管如此，近年来的报告强调了肿瘤细胞广泛共享的免疫原性新抗原的发生，包括突变的KRAS和TP53。我们的小组报告了一种源自EGFR-L858R突变（KITDFGRAK）的新抗原肽，该肽具有免疫原性，由HLA-A * 1101呈递。由于EGFR-L858R见于~40%的EGFR突变肺癌中，因此它构成了HLA-A*1101/EGFR-L858R肺癌患者TCR-T治疗的一个有希望的、广为共享的NeoAg靶点。我们的研究小组已经产生了几种针对这种TCR和其他EGFR衍生的NeoAgs的有希望的TCR，我们计划在未来的临床试验中测试它们的疗效。许多其他研究也证明了共享NeoAgs的免疫原性，可用于产生潜在的治疗性肿瘤特异性TCR。随着下一代测序技术的最新进展，特别是单细胞DNA测序，转录组测序以及完善的体外验证方法，包括ELISPOT测定和四聚体染色，靶向个性化新抗原的TCR-T免疫疗法有可能成为未来几年癌症治疗的可行方法。此外，新类别的TAAs（如癌胎盘抗原）也可能构成未来TCR-T发展的可行共享靶标。

2、最大化治疗性TCR表达

转基因α和β链的正确配对是阻碍TCR-T细胞发育的核心挑战之一。由于每个转导T细胞包括两个内源性TCR链和两个转化的TCR链，因此特异性未知的异源二聚体可导致潜在的自身免疫后果，这已被证明在一些小鼠模型中发生。另一个相关的问题是，不适当的α/β链TCR对将竞争CD3复合物，从而降低治疗性TCR的表面表达和信号转导。有几种方法有利于通过工程对转导的TCR链进行适当的配对，包括：（1）TCR恒定区域的部分鼠源化，（2）添加半胱氨酸残基以促进引入的TCR链的二硫键，（3）改变内源TCR常数区域的二级结构，（4）将信号传导域添加到转导TCRs的细胞内部分，以及（5）将TCR-α/β链引入替代效应细胞或构建单链TCRs。增强治疗性TCR表达的方法包括：（1）TCR-α和TCR-β链转基因的密码子优化，以及（2）改变TCR-α/TCR-β载体配置以优化表达。

3、不良事件最小化

虽然TCR-T细胞疗法已经显示出显着的临床反应，但不良事件已被记录在案。如上所述，靶向MART-1和gp100黑色素瘤抗原的高亲和力TCRs在存在黑素细胞的正常组织中诱导严重的组织学破坏，包括皮肤、心脏、眼睛和内耳。一般而言，靶向脱肿瘤毒性是健康组织共有的TAAs或与结构相似的表位发生交叉反应的主要关键障碍。然而，其他黑色素瘤分化抗原如SLC45A2在正常组织中的表达水平要低得多，这可能会降低自身免疫性副作用的风险。然而，这种风险为研究人员提供了更密切地研究共享的新抗原的动力。目前，正在研究多个癌基因热点突变作为潜在的TCR靶标，例如磷鞘肌醇-3-激酶（PI3K）、KRAS和TP53，或致癌融合蛋白的断点区域。根据以往的经验，输液后监测至关重要，通过自杀基因基因的基因工程删除输注TCR-T细胞的能力是一项重要的安全措施。显然，开发可靠地识别个性化、高特异性和免疫原性肿瘤抗原靶标的能力对于最大限度地减少与TCR-T细胞疗法相关的不良事件至关重要。

4、同种异体T细胞转移中的移植物与宿主病的比较

使用同种异体T细胞是克服制造问题，患者相关免疫细胞缺陷和治疗延迟的非常有前途的解决方案。为了正确使用同种异体T细胞，有必要控制由转导同种异体活性淋巴细胞引起的移植物抗宿主疾病和宿主免疫系统排斥工程淋巴细胞的问题。内源性TCR基因、HLA-I位点或CD52分子的缺失是避免TCR-T移植失败的策略之一，这可以通过基因编辑或使用siRNA等多种方法实现。多能干细胞技术也被建议作为一种潜在的解决方案。同时，TCR破坏对T细胞增殖和存活的影响仍未完全清楚。因此，需要更多的临床前和临床数据来理解和解决这些问题。

七、结论

TCR-T疗法代表了一种非常有前途的癌症治疗方式。该领域越来越多的研究开始揭示个性化肿瘤抗原特异性TCRs的发现和克隆以及所涉及的尖端技术。然而，提高TCR-T免疫疗法的抗肿瘤疗效仍然有几个关键挑战，包括如何安全地提高治疗性TCRs的亲和力，如何在给定患者群体中识别共享的肿瘤特异性抗原和TCR，如何在癌症患者中利用个性化TCR；以及哪些相互作用或信号调节TCR表达和最佳功能。未来破译这些和相关问题的研究不仅可以更好地基本理解TCR-T疗法，而且还将为提高TCR-T治疗效果提供尚未开发的机会，旨在提高癌症患者的总体生存率。

参考文献：

Sun Y, Li F, Sonnemann H, Jackson KR, Talukder AH, Katailiha AS, Lizee G. Evolution of CD8+ T Cell Receptor (TCR) Engineered Therapies for the Treatment of Cancer. Cells. 2021; 10(9):2379.