WGCNA+单基因肿瘤分析，发表8分+

导语

M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是黑色素瘤的独立预后因素。 

背景介绍

第一今天小编为大  家带来一篇构建预后模型与单基因肿瘤分析相结合，成功发表8分+的文章，题目为  Transcri  ptome-based network analysis related to M2-like tumor-associated macrophage infiltration identified VARS1 as a potential target for improving melanoma immunotherapy efficacy，发表在Journal of Translational Medicine上。

数据介绍

本文包括来自四个SKCM队列（GSE65904，GSE98394，GSE78220，GSE91061）和TCGA-SKCM的患者。

研究流程          

结果解析 

01   识别M2肿瘤相关巨噬细胞  

首先，作者使用CIBERSORT算法来评估患者免疫细胞浸润的比例。在TCGA和GSE98394数据集中，M2巨噬细胞浸润比例较高的患者预后较差（图1A）。考虑到更多的M2巨噬细胞与较差的预后和CD8 T细胞浸润有关，作者进行了WGCNA以检测与CD8 T细胞和M2巨噬细胞浸润相关的模块。选择软阈值功率β = 5来构建无标度网络。

热图表明，在TCGA-SKCM中，黄色模块分别与CD8 + T细胞和M2巨噬细胞的浸润呈负相关和正相关（图1B）。使用黄色模块中的基因和TCGA-SKCM数据集中的存活数据进行单变量Cox回归分析，TCGA-SKCM中125个基因与OS相关。

图1

使用R ConsensusClusterPlus软件包在基于125个预后基因的TCGA-SKCM数据集中进行一致的聚类，并确定了两个cluster：cluster1（319例）和cluster2（148例）（图1C）。主成分分析还表明，这两个群体是不同的群体。cluster1的OS结果比cluster2差（P=0.0071，图1D）

02   功能富集和多组学分析  

为了证明每个cluster中的信号通路激活，作者使用MSigDB v7.4中的KEGG信号通路基因集计算了GSVA富集评分。图2A描述了每个cluster中前20条富集途径。与cluster2相比，cluster的特征在于缺乏免疫相关途径，例如T细胞受体信号通路。先前的一项研究将TCGA-SKCM肿瘤分为3种亚型：（1）免疫型，（2）角蛋白和（3）MITF低型。与cluster2相比，cluster1含更高比例的角蛋白亚型（57%对13%）和较低比例的免疫亚型（34.7%对56.2%）（图2B）。

图2

GSEA分析表明M2巨噬细胞途径在cluster1中富集（图2C）。对免疫检查点基因差异表达的检查显示，与cluster1相比，cluster2表现出更高的免疫检查点相关基因表达（图2D）。为了研究每个cluster中的突变，作者用瀑布图突出显示了两个簇中前20个显着突变基因（SMG）（图3A-B）。 这两个cluster共享了大部分SMG。然而，cluster1包含独特的SMG，包括XIRP2（31%），FAT4（31%），USH2A（30%）和ANK3（29%），而cluster2包含独特的SMG，包括FLG（40%），APOB（40%）和CSMD2（37%）。

图3

较高的肿瘤突变负荷（TMB）与更好的免疫治疗反应相关。cluster2样本的TMB严重程度高于cluster样本。使用GISTIC 2.0分析了体细胞拷贝数变异（SCNV），并总结了两亚组的扩增和删除区域。第1亚组共包含56个焦点缺失峰和69个焦点扩增峰，而第2组包含37个焦点缺失峰和28个焦点扩增峰（图4 A-B）。 

对每个亚型中免疫检查点基因扩增或缺失频率的检查显示，cluster2包含更多的免疫检查点（VTCN1，TNFRSF家族）和效应T细胞功能基因（GZMK，GZMA，IFNG）的扩增，而cluster1具有更多的缺失（VTCN1，ADORA2A，TJP1，IDO1，HAVCR2）（图4A）。作者使用R ChAMP包分析了两个亚组的甲基化差异，并在cluster1和2之间获得了28870个差异甲基化探针（DMP）。cluster1的CD8A和HAVCR2的甲基化水平高于cluster2（图4C）。

图4

03   构建M2巨噬细胞预后模型  

作者使用两个cluster之间的差异表达基因构建预后模型（图5A）。首先，对差异表达基因进行单因素Cox分析，获得3390个具有预后意义的基因。然后，基于3390个基因进行套索回归和多变量Cox分析，在TCGA-SKCM数据集中构建预后模型。

风险评分计算如下：0.323×ATP13A5 + 0.465×C1orf105 + 0.195×TM6SF2 + 0.151×HEYL + 0.146×PTK6 + 0.065×KIT + 0.049×ENTHD1–0.209×SLC18A1–0.201×ZMAT1–0.158×CD14。TCGA-SKCM患者根据其风险评分分为高风险组和低风险组。风险评分较高的患者OS预后较差，cluster1患者的风险评分较高（图5B-C）。

图5

时间依赖性AUC和1（0.70）、2（0.74）、3（0.72）和5（0.74）年的AUC表明，在TCGA数据集中，M2巨噬细胞cluster相关风险评分对于预测黑色素瘤患者的OS具有潜在价值（图5D）。为了验证模型的预后意义，使用相同的模型评分阈值来计算验证队列（GSE65904）中的风险评分，结果相似，其中风险评分较高的患者的OS更差，并且风险评分具有预后价值（图5E-F）。在TCGA和GSE65904数据集中，风险评分被确定为独立的预后因素。

04   M2评分与免疫细胞浸润和免疫基因表达  

为了评估M2巨噬细胞cluster相关风险评分对肿瘤微环境（TME）的影响，作者比较了高分组和低分组之间的免疫细胞浸润。与低风险评分的患者相比，高危评分的患者M2巨噬细胞浸润增加，CD8 T细胞浸润减少（图5G）。

作者还探讨了TCGA和GEO数据集中高危评分组和低风险评分组中HLA家族基因和免疫检查点标志物表达的差异。与TCGA数据集的低风险评分组相比，高风险评分组抗原呈递和免疫检查点相关基因的表达显着增加（图6A-C）。与这些结果一致，对GSE65904样品数据的分析产生了类似的结果。

图6

此外，作者将M2巨噬细胞簇相关模型应用于具有可用免疫治疗结果的合并数据集（GSE78220和GSE91061），并检查了黑色素瘤患者的风险评分。作者进一步观察了高风险评分组和低风险评分组对免疫治疗的不同反应，与低风险评分患者相比，高风险评分患者对免疫治疗无反应的比例更高（64%对28%）。（图6D）

05   VARS1为黑色素瘤和M2巨噬细胞的hub基因  

作者探索了黄色模块中的hub基因。使用黄色模块中的275个基因，根据STRING数据库结果构建PPI网络。 然后，通过Cytoscape cytoHubba确定hub基因。黑色素瘤细胞生长所必 需的hub基因是用DepMap（https://depmap.org/portal/download/）确定的。

作者仅鉴定出VARS1基因为hub基因（图7A）。 在TCGA数据集中，高VARS1表达与较短的OS相关（图 7 B）。此外，作者探索了哪种细胞类型在黑色素瘤中主要表达VARS1。GSE115978数据集的单细胞RNA-seq结果表明，VARS1主要在肿瘤细胞中表达，但不在基质细胞和免疫细胞中表达（图 7 C）。此外，高风险评分患者的VARS1表达水平高于低风险评分患者。

图7

作者研究了VARS1是否在黑色素瘤进展中起重要作用，并构建了VARS1过表达和VARS1敲低A375和SK-MEL-28细胞系。 VAR S1过表达促进了细胞的迁移和侵袭能力，而VARS1抑制显着降低了它（图7D-F）。GSEA分析表明，在TCGA-SKCM数据集中，高VARS1水平与转移相关途径呈正相关（图7G）。此外，对人类蛋白质图谱（HPA）数据库的搜索显示，与正常皮肤组织相比，原发性黑色素瘤中的VARS1表达增加，而在转移性黑色素瘤中进一步增加。

06   VARS1的功能富集  

为了研究VARS1相关通路，根据VARS1基因表达的中位数将TCGA-SKCM数据集患者分为两组。KEGG通路的GSVA显示，免疫相关通路（如T细胞受体通路）在低VARS1表达患者中富集，而肿瘤生长通路如细胞周期通路和mTOR通路在高VARS1表达患者中富集（图 8 A）。

图8

作者调查了VARS1表达与CIBERSORT免疫细胞浸润评分之间的相关性。 VARS1表达与肿瘤内M2巨噬细胞浸润呈正相关，与M1巨噬细胞和CD8 T细胞浸润呈负相关（图 8 B-C）。 综上所述，VARS1可能在M2巨噬细胞浸润和极化中起重要作用。

07   VARS1与免疫浸润和免疫检查点  

在TCGA-SKCM数据集中，高VARS1表达与CD8 T细胞浸润呈负相关（图9A）。在TCGA和GSE65904数据集中，许多免疫检查点基因的表达与VARS1表达呈负相关（图9B）。

作者进行了SubMap分析，以评估高和低VARS1表达黑色素瘤患者的抗PD-1免疫治疗反应。结果表明，低VARS1表达预测对抗PD-1免疫治疗的部分反应（PR），而高VARS1表达预测抗PD-1免疫治疗的耐药性（SD）（图9C）。为了探索VARS1在免疫调节中的抑制作用，作者使用不同的算法来研究Pan-TCGA数据集中VARS1基因表达与CD8 T细胞浸润之间的相关性。热图显示，VARS1基因表达和CD8 T细胞浸润在大多数癌症中呈负相关（图9D）。

图9

GSEA分析表明，许多免疫相关途径，例如T细胞介导的细胞毒性途径，在70%的癌症类型中具有高VARS1表达的患者中富集（图 9 E）。最后，作者评估了VARS1在33种癌症类型的生存情况。高VARS1表达与六种癌症类型的生存率较差相关。这些结果表明，VARS1可能对患者预后和PD-1免疫治疗疗效具有预测价值。

小编总结

本文应用WGCNA鉴定了黑色素瘤中的M2样巨噬细胞模块，并基于hub基因预测其作为黑色素瘤预后标志物的可能性和免疫治疗反应的可靠性。 随后，作者 基于M2样巨噬细胞相关的基因模块建立预后模型，该模型对黑色素瘤的临床结局和免疫治疗反应具有预测价值。 作者进一步验证了M2样巨噬细胞的高评分与TCGA和GSE98394数据集中较差的生存率显著相关。

为了检查M2样巨噬细胞作为黑色素瘤预后标志物的可靠性，在M2样巨噬细胞相关模块中按基因对两个cluster进行分组，并显示出不同的OS和临床特征。 在OS较差的情况下，cluster1的特征是M2巨噬细胞通路富集和缺乏免疫应答通路。这些免疫应答途径的激活与良好的免疫治疗反应和良好的临床结果相关 ，表明缺乏免疫应答途径是与cluster2相比，cluster1结局较差的主要原因之一。

TMB升高可能与免疫检查点阻断治疗的临床获益增加有关。cluster2的TMB严重程度高于cluster。cluster2具有更多的免疫检查点和效应T细胞功能基因扩增，而cluster1有更多的基因缺失。这表明与cluster2相比，cluster1从免疫治疗中获得的益处下降更多。因此，M2样巨噬细胞模块对于在黑色素瘤的临床结果和免疫治疗反应中提供有意义的预后价值是可靠的。

作者进一步确定了M2巨噬细胞簇相关预后模型，并根据M2样巨噬细胞相关簇之间的差异表达基因生成了预后风险评分。在TCGA队列中，cluster1的风险评分明显高于cluster2，与低风险评分组相比，高风险评分组的OS显著降低。与低风险评分组相比，高风险评分组表现出更少的CD8 + T细胞浸润和更多的M2巨噬细胞浸润。基于M2样巨噬细胞相关预后模型的风险评分是黑色素瘤OS和免疫治疗反应的独立预测因子。

为了确定预测黑色素瘤OS和免疫治疗反应的潜在生物标志物，作者通过三种不同的算法确定了特定M2样巨噬细胞模块中的hub基因。仅鉴定出VARS1与M2样巨噬细胞极化和黑色素瘤肿瘤细胞生长有关。在TCGA-SKCM数据集中，VARS1主要由肿瘤细胞表达，高VARS1表达与不良OS和转移相关通路显著相关。