TCR-T细胞免疫疗法：挑战和解决方案

T细胞受体工程T细胞（TCR-T）疗法不受靶细胞表面抗原表达的限制，是一种潜在的癌症治疗细胞免疫疗法。细胞免疫疗法治疗血液系统恶性肿瘤的重大进展引起了研究人员对实体瘤治疗的兴趣。然而，与血液系统恶性肿瘤相比，TCR-T细胞免疫疗法在实体瘤中的总体疗效并不显着。本文重点关注TCR-T细胞免疫治疗实体瘤的障碍，以及影响TCR-T细胞免疫治疗疗效的策略。为研究人员更好地克服TCR-T细胞效率对实体瘤的影响提供一些参考。

前言

目前正在改变癌症治疗概念的免疫疗法是基于免疫细胞可以识别和消除癌细胞的理论。临床经验表明，输注到同一患者体内的体外扩增的肿瘤浸润细胞/淋巴细胞(TIL)可以产生重复的、甚至持续的肿瘤反应。T细胞受体(TCR)分离技术和基因工程计划的发展使患者的T细胞能够表达TCR，识别特定肽和人类白细胞抗原(HLA)的多种组合。由此产生的TCR-T细胞可以特异性识别肿瘤相关抗原并有效消除肿瘤细胞。

具有异质TCR的T淋巴细胞可以识别肿瘤细胞上的HLA肽复合物，并通过免疫酪氨酸基激活基序(ITAM)的磷酸化传递抗原刺激信号，激活T细胞的免疫作用以消除肿瘤细胞。TCR-T技术在发展过程中经历了四次迭代。最初，从患者中分离出的肿瘤抗原特异性T细胞亚群在体外扩增并重新注入同一患者体内。由于这些T细胞克隆很少见，个体间差异很大，因此很难在工业水平上生产它们。在第二代开发中，克隆了肿瘤抗原特异性T细胞，并确定了它们的TCR基因序列。这些TCR基因序列随后被转导到患者的外周T细胞中。这种方法使TCR-T细胞生产和治疗的工业化成为可能。在第三代开发中，通过优化其TCR对肿瘤细胞的亲和力，提高了TCR-T细胞的治疗效果。第四代TCR-T细胞疗法是一种针对新抗原的高特异性细胞疗法，可显着提高肿瘤反应和患者安全性。然而，由于个体间的差异，需要进一步的研究来确定治疗的可及性。

T细胞受体工程T细胞（TCR-T）疗法不受靶细胞表面抗原表达的限制，是一种潜在的癌症治疗细胞免疫疗法。策略性选择底物细胞可以增强TCR-T细胞的运输、扩增、持久性和记忆功能，形成具有合成共刺激电路的TCR-T细胞系统。进一步了解TCR-T疗法治疗实体癌的障碍和解决方案，将为这种免疫疗法的未来临床应用带来好处（图1）。

图1  TCR-T细胞结构示意图。TCR复合物是由两条不同的肽链组成的异二聚体。MHC1类呈递癌细胞的细胞内抗原肽，供T细胞受体识别，并被CD28和B7包围。

TCR-T 疗法的挑战

T细胞激活不足会导致免疫逃逸，从而降低特定患者的免疫治疗效果。TCR-T细胞独立于患者的内源性T细胞库，不受肿瘤特异性表面蛋白可用性的限制。然而，构建能够识别具有足够亲和力和功能以消除现有肿瘤和防止复发的可靠靶标的TCR-T细胞群仍然是一个挑战。

1、目标抗原的选择

人类肿瘤抗原主要可分为两类——肿瘤特异性抗原（例如，新抗原和病毒抗原）和肿瘤相关抗原（例如，癌症/睾丸（CT）抗原、过表达抗原和分化抗原）。尽管TCR-T细胞可以靶向所有肿瘤抗原，但迄今为止确定的具有足够安全性和有效性的靶点数量仍然有限。选择合适的TCR-T细胞治疗靶抗原的首要考虑应该是抗原的高特异性。通常选择在肿瘤中高表达但在正常组织中低水平表达的靶抗原来限制任何潜在的脱靶效应和由破坏表达靶抗原的正常组织引起的剂量限制毒性。迄今为止，大多数TCR-T细胞疗法的临床试验都针对CT抗原和病毒抗原，其中纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)是最常针对的，占迄今为止试验的37%。

目前，过表达的睾丸抗原和分化抗原是基于TCR的过继细胞免疫治疗最常见的靶点。NY-ESO-1是一种CT抗原，在黑色素瘤和滑膜肉瘤患者中的客观反应率为40-60%。TCR基因治疗中考虑的其他肿瘤特异性抗原包括突变抗原和新抗原，其中大多数是安全的靶标，因为它们在肿瘤细胞中特异性表达。突变抗原在许多肿瘤类型中广泛表达，并且由于其个体化特征，可以通过测序获得新抗原。免疫选择压力可能导致靶抗原表达下调，降低TCR-T细胞治疗的疗效，特别是对于特定的T淋巴细胞。即使在输注过继功能细胞后，靶向肿瘤抗原的丢失也会导致肿瘤复发。靶向在肿瘤存活中具有核心功能的蛋白质可以克服靶抗原的下调；用不同的肿瘤特异性TCR注入多个T细胞克隆；或注入靶向两种或多种肿瘤抗原的T细胞。

TCR只能识别肽-HLA并杀死具有匹配HLA等位基因的癌细胞，因此筛选合适的HLA匹配也是必要的。来自非中国人的TCR-T细胞不能直接应用于中国患者。筛选具有最佳亲和力阈值的TCR仍然很困难。应鉴定对抗原具有高亲和力的TCR以增强免疫反应。然而，亲和力应控制在一定范围内，因为T细胞会受到超出生理功能的TCR亲和力的伤害。表达抗原受体（TCR）的T细胞识别抗原的机制对T细胞免疫很重要，而T细胞对病原体表达的抗原的定量反应能力是T细胞反应的重要指标。然而，这些T细胞必须对宿主组织上的类似抗原保持无反应。转基因T细胞的抗肿瘤活性应通过转化过程增强，将改变它们的亲和力。然而，亲和力应控制在一定范围内，因为太低的亲和力可能对靶向非肿瘤组织有毒，T细胞会攻击表达肿瘤相关抗原或类似配体的宿主非恶性组织。反之，亲和力也不能太高，否则可能导致免疫激活异常，增加引发细胞因子风暴的风险。此外，肽-HLA结合的改变会导致对自身抗原的不可预测的交叉反应，这可能会导致严重的不良事件。

最新一代的TCR-T技术面临着有效识别抗原的挑战。Kite Pharma公司已利用免疫组库(HTS-IR)的高通量测序和计算生物学方法（包括群体和单细胞水平的TraCeR和单细胞TCRseq）来重建TCR并鉴定免疫原性新抗原。流式细胞仪已被用于从患者中筛选出肿瘤抗原特异性T细胞，通过单细胞技术获得识别这些抗原的TCR基因，并将其导入患者的外周T细胞进行治疗。这种探索为分析T细胞的多样性和动态提供了新的工具。需要进一步的生物信息学进展来开发更多新颖的工具。

2、肿瘤抗原异质性与肿瘤免疫逃逸

在I/II期临床试验中，将靶向MAGE-A3的TCR基因转入T细胞治疗转移性黑色素瘤，反应率为57%(4/7)，一名患者达到完全反应(CR)15个月，其中3个月达到部分缓解(PR)。然而，另外三名患者因脑损伤而出现精神障碍，其中两名患者出现严重的中枢神经系统损伤并死于多灶性坏死性白质脑病。这些不良反应可能是由于T细胞在正常脑组织中识别与MAGE-A12交叉反应的抗原而引起的神经毒性。

肿瘤抗原异质性对TCR-T治疗效果的影响仍不清楚。癌症相关抗原的表达在肿瘤内的不同细胞中有所不同，这使得一些肿瘤细胞能够逃避特定的抗原靶向治疗，并导致一些接受免疫检查点抑制剂(ICIs)和过继性T细胞治疗的患者产生治疗抗性。TCR-T是由慢病毒转染产生的T细胞产物，产生的细胞在患者体内表达针对多种肿瘤抗原的多种TCR。CRISPR-Cas9可以使用源自聚合酶链式反应的DNA质粒或模板转移基因，而无需病毒载体。多重CRISPR-Cas9 T细胞基因组工程已被证明在晚期难治性癌症患者中是安全可行的。为了减少编码内源性T细胞受体(TCR)链的两个基因的TCR错配，从T细胞中删除TCRα(TRAC)和TCRβ(TRBC)，合成肿瘤特异性TCR转基因NY-ESO-1的表达增强，并去除编码程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的基因。可以在所有三个基因组位点编辑工程T细胞过继转移到患者体内，以实现持久植入。在注入一名患者的细胞中，30%的细胞经历了两个和三个基因的编辑，4个月后循环中20%的TCR转基因T细胞显示出两个和三个基因的编辑。虽然也检测到染色体易位，但易位频率随着时间的推移而降低。总体而言，这项研究表明CRISPR-Cas9基因编辑为增强人类T细胞的天然抗癌活性和癌症免疫治疗的可行性提供了强大的工具。

这种优化可能会敲除特定基因，导致TCR和共刺激蛋白同时表达，同时消除抑制信号。这可以通过例如防止T细胞功能障碍、抑制肿瘤逃逸、克服有限的T细胞增殖和控制毒性来促进TCR-T产品的功能。

CRISPR-Cas9在基因治疗中的安全性和有效性引起了人们的关注。在超过80%的健康人中检测到针对金黄色葡萄球菌（S.aureus；SaCas9）和酿脓链球菌（S.pyogenes；SpCas9）的体液、抗体介导、细胞和T细胞介导的免疫；理论分析表明，在促炎性“危险”细菌感染期间，这些免疫反应的激活伴随着细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的信号生成。免疫系统可能会破坏CRISPR-Cas9修饰的基因工程细胞，使治疗无效，并消除受感染的宿主细胞。因此，确定人体免疫系统是否可以产生抗Cas9反应是合理的。在动物模型中，尚未发现抗Cas9抗体会在使用AAV等非炎症载体进行基因治疗后导致表达Cas9的细胞死亡。目前尚不清楚Cas9的表达是否可以刺激预先存在的抗Cas9免疫，从而导致转导细胞的破坏。如果CTL介导基因治疗后的杀伤，则可以使用各种策略来尽量减少抗Cas9T细胞的发展和影响。

CRISPR-Cas9的发现极大地提高了基因治疗的有效性。基于CRISPR-CAS的治疗技术的可能临床应用使得最大限度地减少基因治疗的免疫原性变得尤为重要。据报道，调节性T细胞(Treg)可促进对基因治疗的免疫耐受，并且可以从人外周血中富集Cas9特异性Treg细胞。由于Cas9特异性Treg细胞可以促进免疫耐受，因此在基因治疗之前和期间用这些细胞进行治疗可能会促进肿瘤生长。严格的免疫监测可以评估内源性Cas9反应性Treg细胞在临床治疗中的作用。因此，CRISPR-CAS疗法和Treg细胞之间的相互作用可以确定基因疗法和抗原特异性之间的关系。

肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞通过各种机制避免被免疫系统识别和攻击而在体内存活和增殖的能力。实体瘤的特点是复杂的免疫抑制微环境和内在的异质性，使得持久的TCR-T诱导反应困难。肿瘤微环境(TME)的细胞和成分包括肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、信号分子和细胞外基质。TME显着影响肿瘤诊断、患者生存和治疗敏感性。不同肿瘤组织的TME具有明显的特征。这些缺点可以通过例如修饰T细胞以释放可以抵消TME中的免疫抑制因子的细胞因子和结合TME抑制剂来克服。

3、TCR基因转移中的脱靶和安全问题

由于工程化TCR-T细胞无法区分肿瘤细胞和表达靶抗原的正常细胞，因此TCR-T细胞免疫治疗可能会严重损伤相应的正常组织。用靶向MART-1和MAGE-A3的TCR-T细胞治疗转移性黑色素瘤患者会导致致命的心脏毒性，这可能是因为MART-1和MAGE-A3在心脏组织中高度表达。已发现化学疗法和其他靶向疗法的组合可导致一些疾病进展患者的暂时疾病缓解并延长中位生存期。诱导TCR-T细胞凋亡或敲除内源性TCR也可以减少TCR-T细胞免疫疗法的副作用。

TCR基因治疗期间的脱靶事件可能是由含有两条α链和两条β链的异二聚体之间的自身/交叉反应引起的，这可能导致新的自身免疫特异性。四种不同的TCR可以形成一个复合物，其中两条链来自外源性α/βTCR，另外两条来自天然/内源性α/βTCR。这些异二聚体TCR可以形成具有新特异性的受体或无功能的复合物。已经在TCR基因治疗的小鼠模型中评估了异二聚体TCR产生的自身反应性T细胞和这些细胞的自身免疫表现。治疗诱导的自身免疫反应导致造血细胞池的致命破坏，有证据表明这种病理反应是由混合TCR二聚体的形成引起的。尽管这种TI相关的移植物抗宿主病(GVHD)与输血相关的移植物抗宿主病(TA-GVHD)相似，但在体外培养小鼠TCR转导的T细胞时，TI-GVHD的发生率显着降低10天。这一观察结果与早期过继性细胞转移的结果非常吻合，表明“老”T细胞的功能在体内大大减弱。或者，注射到患者体内的大多数细胞移植物中CD4+T细胞的比例相对较低，CD4+T细胞在TI-GVHD的发生中起重要作用。TCR二聚体依赖性混合毒性也可能成为临床应用中的安全问题。将TCR基因转移到人类T细胞可导致混合TCR二聚体的形成，这可在体外诱导特定反应。这些发现强调了评估和实施可以预防TI-GVHD的技术的重要性。

已经开发了方法，主要是分子方法来提高引入的TCR的表达水平。这些方法旨在提供更好的外源TCR的α/β链之间的匹配/关联。例如，将小鼠恒定区的部分/全部基因引入人类TCR可以提高TCR转导水平。

其他匹配优化方法包括在TCR恒定区中引入额外的二硫键，使用单链TCR，以及应用TCR/CD3融合产物。因为TCR的α/β和γ/δ链不能相互匹配，所以使用α/βTCR转导的T细胞是一种替代方案。或者，可以通过共转移内源性TCR siRNA/shRNA或TCR链特异性锌指核酸酶来沉默内源性TCR。与修饰和内源性TCR相关的CD3分子相互竞争，显着降低修饰TCR细胞表面异二聚体的表达并损害T细胞功能。逆转录病毒载体和siRNA已被用于沉默内源性TCR基因表达并优化肿瘤抗原特异性TCR。前病毒颗粒数量相对较少的淋巴细胞转导，导致引入的TCR有效表达，降低内源性TCR的表达，增强靶细胞的抗原特异性裂解。作用于TCR恒定区的特异性siRNA，可增加和优化MAGE-A4特异性TCR的细胞表面表达。减少内源性和外源性TCR之间的错配以及它们对CD3分子的竞争可以增加修饰的TCR细胞的表面表达(图2)。

图2  减少内源性和异质TCR之间的错配并减少对CD3分子的竞争可以介导修饰TCR细胞表面表达的增加。

4、T细胞无反应和衰竭

嵌合抗原受体-T(CAR-T)细胞和T细胞受体工程化T细胞的治疗效果高度依赖于这些T细胞的功能活性。然而，T细胞耗竭的机制仍不清楚。T细胞无反应性代表T细胞的低反应性状态，由TCR的过度激活和强烈的共抑制触发，通过CD28分子信号或有限的共刺激。在慢性感染或肿瘤进展期间反复激活T细胞可导致T细胞衰竭。在清除急性感染期间，一群活化的T细胞分化成高功能记忆T细胞；然而，在慢性感染期间或在TME中，维持T细胞的激活会导致功能失调的表型，其特点是效应器功能和抑制性受体表达不佳。功能失调的T细胞不能产生白细胞介素(IL)-2并逐渐失去增殖和体外杀伤能力，随后变得不能分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α。在最后阶段，干扰素的产生部分或完全受损，最终导致身体损失。效应器功能的下降伴随着CD4+T细胞的逐渐丧失和抑制性受体的表达增加，包括CD160、CD244、CTLA4、LAG-3、PD1、TIGIT和TIM3。

早期记忆T细胞和其他T细胞的消耗会改变基因工程T细胞疗法的有效性。功能失调的T细胞是肿瘤中主要的增殖免疫细胞，功能失调的强度与肿瘤反应性有关。耗尽的CD8+T细胞可以包括祖细胞耗尽的T细胞亚群，它们可以保持通用性，并在长时间后最终分化为耗尽的T细胞。通过细胞表面抑制性受体PD-1、趋化因子受体CXCR5和可溶性因子TCF-1的表达，可以评估失败前的CD8+T细胞。

T细胞功能障碍和衰竭是工程T细胞疗法的重要缺点。内源性T细胞的功能障碍和衰竭表型源自周围的TME，并被诱导向终末分化。TME中的PD-1上调显着抑制T细胞功能，因此由受损T细胞产生的工程化T细胞对血液系统恶性肿瘤和实体瘤的疗效可能较低。此外，T细胞的内源性TCR可能对工程化T细胞产生持续的负面影响。最后，来自转化的T细胞的信号可能会增加细胞分化和衰竭。

总之，增强工程T细胞抗肿瘤功能的关键是调节肿瘤相关的T细胞功能障碍和衰竭。目前，恢复T细胞池的策略主要有3种：替换、重编程和耗尽细胞恢复。

1）替换涉及从循环中物理去除功能失调的细胞，以确保效应和记忆T细胞的稳态增殖。一种可能的方法是靶向功能失调的T细胞并促进它们的选择性凋亡。工程化肽用于干扰FOXO4/p53，导致衰老成纤维细胞凋亡。目前尚不清楚这种方法是否也适用于功能失调的T细胞。然而，与自体干细胞移植(ASCT)一样，稳态增殖已导致在自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤中成功重建功能性幼稚、记忆和效应T细胞池。此外，从脐带血中分离出的造血干细胞已被用于重建免疫系统和治疗血液疾病，这些疾病可能允许效应T细胞稳态增殖。

2）重编程是一种将T细胞从功能障碍和衰竭状态中拯救出来的实用方法。它涉及最初源自T细胞(T-iPSC)的诱导多能干细胞的再分化或它们在自身谱系中的去分化。尽管从人类胚胎干细胞和iPSCs生成T细胞是可行的，但看似随机的VDJ基因重排产生的TCRs仍然无法预测。在异种移植模型中发现用肿瘤抗原特异性工程TCR和CAR转染的人类iPSC衍生T细胞浸润实体瘤组织并延缓肿瘤进展。此外，从iPSC再生的CTL，包括WT1抗原特异性CTL，在异种移植白血病模型中显示出治疗效果。这些细胞还在使用肾细胞癌细胞系的原位异种移植模型中显示出强烈的治疗效果。该方法通过用WT1特异性TCRα/β基因转导HLA单倍型纯合iPSC进行了扩展，该方法已在临床上进行了测试。此外，这种抗实体瘤策略的可行性在源自患者的肾细胞癌异种移植模型中得到证实，其中再生的抗原特异性CTL抑制了肿瘤生长。

iPSCs分化为T细胞的DP阶段通常以额外的T细胞受体变化为特征，这可能会改变抗原特异性；发现通过基于CRISPR的T-iPSC基因组编辑敲除RAG2可抑制额外的TCRα重排。HLA匹配的同种异体iPSC和TCR的联合转导有望促进同种异体过继性T细胞免疫治疗。此外，重编程可以通过增加端粒酶活性来恢复端粒长度，通过防止端粒依赖性细胞耗竭来延长细胞寿命，这可能会逆转T细胞耗竭（图3）。

图3  T-iPSC中基于CRISPR的基因组编辑敲除RAG2可防止额外的TCR重排。

3）恢复方法旨在通过生物工程化胸腺类器官物质、生长促进因子和细胞因子（如IL-21）来恢复和维持胸腺环境，并进一步逆转胸腺退化。IL-21是一种胸腺刺激细胞因子，可在老年小鼠中引发新的胸腺形成，已显示出显着的免疫储存功能并促进外周T细胞池再生。

同样，在严重联合免疫缺陷小鼠模型中，将异基因造血细胞注射到重建的胸腺中可恢复功能性T细胞发育。临床前研究表明，从脱细胞基质中产生胸腺类器官是恢复T细胞和适应性免疫系统功能的有效途径。然而，供体特异性免疫耐受、复杂的胸腺细胞外基质(ECM)再生、胸腺上皮细胞支持和T细胞成熟仍然是主要挑战。

5、细胞因子风暴引起的毒性

与基因工程T细胞免疫治疗相关的毒性反应可分为两种类型，自身免疫毒性和细胞因子相关毒性。自身免疫性毒性，也称为靶向性和非肿瘤性毒性，是由对表达靶向肿瘤相关抗原的非恶性宿主组织的抗原特异性攻击引起的。在使用免疫检查点抑制剂和输注基因工程T细胞后，可能会发生自身免疫毒性。细胞因子相关毒性，也称为细胞因子释放综合征（CRS），由高水平免疫激活引起，是一种非抗原特异性毒性。

在肿瘤负荷较大的患者中，与过继性T细胞治疗相关的CRS的发生率和严重程度会增加，这可能与更高水平的T细胞活化有关。与单克隆抗体治疗相关的CRS类似，过继性T细胞治疗相关的CRS与IL-6和TNF-α水平的升高密切相关，伴随着IL-2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-5、IL-8和IL-10。IL-6是CRS毒性的中心介质，已被证明在T细胞的激活、扩增、存活和极化中起重要作用，并促进T细胞粘附因子的表达。此外，还发现IL-6通过STAT3上调抗凋亡因子来调节Fas受体的表面表达，从而抑制T细胞凋亡。

IL-6也被证明与肿瘤中存在的骨髓间充质干细胞中细胞因子的积累有关。此外，IL-6在急性免疫反应中起重要作用。当受到局部炎症刺激时，IL-6可通过作用于肝脏促进急性期蛋白的产生。IL-6是影响肝细胞、造血祖细胞以及心血管、内分泌和神经系统稳态的重要因素。此外，许多临床试验表明，IL-6的高表达与CRS相关，启动促炎症信号级联反应。

细胞毒性T细胞释放细胞因子导致T细胞受体激活和异常巨噬细胞激活可能最终导致噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。HLH的主要特征是免疫激活不当和细胞因子释放。原发性HLH是由参与溶细胞颗粒胞吐作用的基因突变引起的，它降低了自然杀伤(NK)功能，并允许巨噬细胞响应最小触发而自发激活。继发性HLH由感染、恶性肿瘤和自身免疫性疾病引起。部分患者的HLH症状在用IL-6受体阻滞剂治疗后得到缓解。宿主因素可能在易患严重CRS的个体的免疫治疗中发挥重要作用，尽管需要更多的研究来确定遗传是否与这种综合征有关。

增强工程 T 细胞功能的其他改进方法

尽管已经发现一些患者从TCR-T治疗中受益，但仍需要努力提高T细胞在体内的扩增/持久性，以避免效应功能的快速丧失。这可能会提高肿瘤负荷高的患者的反应率，并减少对大量TCR-T细胞的需求。因为单独插入TCR可能不足以产生有效的抗肿瘤反应，共刺激受体和TRC“底物”细胞的其他特征可能提供克服这些障碍和改善临床结果的潜在方法。

1、增加结构亲和力可以增强抗肿瘤功能

迄今为止，大多数TCR-T细胞免疫疗法的临床研究都集中在黑色素瘤上。目标包括T细胞(MART)-1、P糖蛋白100(P-gp100)、NY-ESO-1、MART-A3和p53识别的黑色素瘤相关抗原。为了确定重建的T淋巴细胞在治疗黑色素瘤中是否有效，用逆转录病毒载体将编码MART-1特异性TCR的α和β链的基因转染到外周血单个核细胞(PBMC)中，并将重组T细胞用于治疗17名转移性黑色素瘤患者。在这项I期临床试验中，两名(12%)患者达到PR超过20个月，另外15名(88%)患者在治疗2个月后外周血T细胞计数增加≥10%，没有治疗-相关的不良事件。

在另一项试验中，转移性黑色素瘤患者接受了表达MART-1或P-gp100并具有高TCR活性的TCR-T细胞治疗。分别在30%(6/20)和13%(2/16)接受表达MART-1和P-gp100的TCR-T细胞治疗的患者中观察到PR，其中后一组患者中的一名患者达到CR。然而，在皮肤和眼睛的正常黑色素细胞中观察到二次损伤，在耳朵中观察到三次损伤。这些结果表明，工程化T细胞区分正常细胞和肿瘤细胞的能力不同，从而导致不同的治疗效果。因此，在设计TCR时，除了高亲和力外，还应考虑区分能力。这一技术瓶颈制约了TCR-T的发展。具体而言，亲和力的提高会增加TCR攻击脱靶位点的风险，从而导致脱靶毒性，而靶向健康组织中相似的抗原表位会损害后者。然而迄今为止，新抗原中只有1%~2%的肿瘤突变可以与MHC分子结合被T细胞识别，这表明新的抗原特异性T细胞识别肿瘤组织的能力有限突变负荷低。

由于在身体任何部位施用的T细胞都有可能被主动运输到全身各处，因此选择正确的靶标非常重要。大多数潜在靶标不是肿瘤特异性的，并且在健康组织中以较低浓度表达，从而增加了脱靶效应的风险。即使可以识别出高表达或特异性的肿瘤靶点，由于肿瘤的异质性，它们在整个肿瘤中的表达并不均匀。针对并非所有肿瘤细胞中存在的抗原的T细胞疗法可能导致靶阴性肿瘤细胞的选择性生长。因此，构建具有共同新抗原、新抗原覆盖大部分肿瘤亚克隆、驱动新抗原突变的TCR-T细胞有望提高新抗原TCR-T的治疗效果，造福更多患者。

增加TCR的结构亲和力可能会增强其抗肿瘤活性。1）对TCR α和β链的CDR3区域进行选择性修饰已证明对抗原识别和结合至关重要。2）配对和密码子优化，从而增加蛋白质表达，可以增强T细胞的抗原特异性反应。3）减少TCR的糖基化可提高其功能亲和力并防止转导TCR的内化。4）将TCRα链的三个跨膜残基修饰为疏水性氨基酸可以增强T细胞的抗肿瘤功能亲和力，以及增加TCR在这些转导的T细胞中的稳定性和表达水平。5）基因表达盒的设计也可能影响TCR的表达，P2A或IRES元件连接α和β链的应用已被证明可以增加TCR表达水平并降低诱导自身免疫性病理变化的风险。

除了TCR转基因的T细胞特异性工程外，几种遗传方法已被用于进一步诱导或放大重要的T细胞功能（例如，共刺激、细胞因子分泌以及趋化因子受体和归巢因子的表达）。例如，向肿瘤小鼠模型中施用IL-12可以促进肿瘤消退并提高宿主存活率，尽管它也增强了毒性。已显示通过逆转录病毒载体在体内诱导工程化T细胞产生IL-12可增强B16小鼠对黑色素瘤的抗肿瘤活性。将T细胞与细胞因子佐剂纳米颗粒结合可以导致细胞因子的局部产生或递送，从而降低毒性。转导T细胞的亚型也很重要，最近的研究显示各种淋巴细胞亚群的良好表现，包括记忆T细胞、原代T细胞、记忆干细胞和中枢记忆T细胞。

2、基质细胞选择的必要性

在临床前模型中，CD8+T淋巴细胞的幼稚、中央记忆和干细胞记忆亚群介导过继性T细胞疗法的持久性和抗肿瘤作用。在急性髓性白血病患者中使用WT-1特异性TCR转导供体EBV特异性CD8+T细胞的临床试验进一步证实了这些发现。转导的TCR-T细胞维持了共刺激受体的表达，抑制性受体的表达水平较低，这可能介导TCR-T频率的稳定性和在患者中观察到的持久性。然而，并非所有患者都能从EBV特异性底物细胞中受益，尤其是那些肿瘤负荷高和活化诱导的T细胞死亡的患者。这表明替代方法是必要的。

除了TCR信号传导外，T细胞功能还受到正向和负向两种方式的调节。例如，TME可以诱导免疫抑制，而转化生长因子-β(TGF-β)可以抑制T细胞增殖和功能。表达TGF-β的肿瘤细胞可能会逃避凋亡。TGF-β诱导的抑制可以通过将截短的显性失活TGF-β受体引入基因工程T细胞来减少。

3、CD4+ T细胞的组合可增强TCR-T疗法的疗效

目前基于TCR的免疫疗法主要利用识别I类HLA呈递的肿瘤抗原的CD8+T细胞。如鼠白血病模型和CD19定向CAR疗法所示，共转染的CD4+T细胞可通过促进杀伤肿瘤的CD8+T细胞的增殖和存活来增强抗肿瘤作用。肿瘤特异性II类限制性CD4+T细胞促进I类限制性CD8+T细胞增殖、存活和效应功能，部分是通过产生IL-2和促进树突细胞介导的活化来扩大免疫反应范围（表位扩散）。表达II类HLA限制性TCR的CD4+T细胞显示出对转移性黑色素瘤的直接溶细胞活性和对人胆管癌的抗肿瘤作用。然而，II类表达在实体瘤中很少见，很难区分相同肿瘤抗原的I类和II类限制性TCR。

病毒和新抗原特异性I类TCR有足够的亲和力与CD4+和CD8+T细胞结合，但胸腺选择导致TCR很少识别过表达的自身抗原。鉴定不依赖CD8的I类HLA限制性TCR需要广泛筛选，但对于每个靶标并不总是成功的。CD8的 α 和 β 链与 TCR（结合CD4+和CD8+T细胞的替代方案）的共表达可应用于任何类型的受限TCR。在一些临床前模型中，肿瘤特异性CD4+T细胞支持CD8+T细胞增殖和功能。然而，在复杂的TME中，仅CD4+T细胞的参与可能是不够的。

在从靶向特异性CD8+T细胞克隆或自发转移CTR基因后，获得HLAI类限制性基因修饰的CD4+T细胞被证明是可行的。WT1 siTCR/CD4+T细胞可以产生Th1细胞因子并增强由WT1 siTCR/CD8+T细胞介导的WT1反应性CTL功能。此外，WT1 siTCR/CD4+T细胞的给药不仅增强了抗白血病细胞的杀伤作用，而且在体内识别白血病细胞的过程中增强了WT1 siTCR/CD8+T细胞的增殖和分化。此外，WT1 siTCR/CD4+T细胞表达趋化因子CXCL12及其受体CXCR4。表达CXCR4的CD4+T细胞可以通过CXCR4-CXCL12轴进入骨髓。因此，静脉注射WT1 siTCR/CD4+T细胞不仅可以转运到外周血，还可以进入患者的骨髓。还发现施用WT1 siTCR/CD4+T细胞可增加WT1 siTCR/CD8+T细胞在白血病细胞周围的积累，从而增强其抑制作用。此外，WT1 siTCR/CD4+T细胞的存在可以延长功能性WT1 siTCR/CD8+T细胞在体内的存活时间。这些发现表明，同时给予WT1 siTCR/CD4+T细胞和WT1 siTCR/CD8+T细胞可以最有效地抑制白血病，并且这种增强的抗白血病效应显着。也就是说，靶向特异性CD4+T细胞，可以增强过继基因修饰的CD8+T细胞抗白血病作用的持续时间。

4、共刺激受体的独立激活对于改善 TCR-T 治疗至关重要

将共刺激结构域（最显着的是CD28和41BB，以及ICOS和OX40）并入细胞内CAR-T信号转导结构域已被证明对CAR-T细胞功能至关重要。CD19 CAR-T细胞已显示出对血液恶性肿瘤的抗肿瘤作用。TCR和MHC的组合启动TCR信号传导，导致T细胞和抗原预防细胞(APC)之间形成免疫突触。T细胞和APC之间的这些相互作用可以同时触发共刺激信号受体（如CD28）的结合并导致CD8或CD4共受体的募集，它们分别与MHCI类或MHCII类复合物中的保守区域结合。CD4和CD8的细胞内结构域可以招募SRC家族成员酪氨酸激酶LCK与TCR:pMHC结合。TCR:pMHC与TCR的相互作用促进了LCK介导的ITAM在CD3亚基的细胞质结构域中的磷酸化。这种磷酸化可导致蛋白酪氨酸激酶ZAP70募集到TCR并促进LCK对ZAP70的激活。早期T细胞激活模型假设TCR信号传导的启动涉及并需要LCK的完全激活。然而，随后的研究表明，很大一部分（高达40%）的LCK在静息T细胞中具有催化活性，最近的研究表明，静息T细胞中LCK的活性池可能比最初估计的要小。此外，发现T细胞的完全激活需要肿瘤配体与独立触发的共刺激受体相匹配，同时通过TME中高表达的配体克服抑制性受体信号。

T细胞通过TCR与MHC的相互作用导致几种蛋白质募集到质膜，在那里它们参与信号转导（图4）。初始TCR信号通过p38-γ1 (PLC-γ1)和维生素D受体(VDR)持续诱导磷脂酶C，这两者都是T细胞活化所必需的经典TCR信号通路。PLC-γ1膜磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)被发现由肌醇三磷酸(IP3)和二酰基甘油(DAG)组成。反过来，IP3与内质网受体相互作用以上调细胞内Ca2+的水平，激活T细胞的结合蛋白钙调蛋白和核因子(NFAT)蛋白2。此外，DAG激活Ras细胞外调节激酶(ERK)通路，最终激活核因子(FOS)蛋白。这些相互作用的信号通路诱导T细胞的活化和大量细胞因子和趋化因子的释放。

图4  T细胞通过TCR与MHC相互作用后，几种蛋白质会被募集到质膜参与信号转导。

最近的一项临床前研究表明，增强的共刺激信号可以促进TCR-T细胞增殖、细胞毒性、和细胞因子的产生。迄今为止，临床研究中尚未使用为最佳TCR-T细胞活化而定制的特定结构，因为需要考虑几个因素。首先，共刺激域的选择会影响线粒体生物合成和整体细胞代谢，导致效应分子和中央记忆T细胞的分化以及T细胞动力学的变化。其次，共刺激域在免疫突触中的位置会影响设计。所谓的开关受体（例如，CD20R/CD28和PD1/CD28）通过抑制刺激信号在体外和小鼠模型中都显示出巨大的功效。然而，这种方法依赖于TME中的额外配体相互作用，而不是TCR:pHLA相互作用。在TCR旁边插入这些结构需要两个单独的载体或一个大载体，从而限制了转导的效率。第三，靶细胞丰度和TCR亲和力也是关键因素。靶细胞数量的增加将通过TCR:pHLA相互作用导致TCR信号的放大。这进而可能导致有害的细胞因子风暴或T细胞耐受性，影响安全性和抗肿瘤功效。此外，CAR-T细胞（具有内在的共刺激特性）在实体瘤中的功效有限。这些发现表明，TCR-T疗法需要基于增加的共刺激信号进行工程改造。

有前途的方法包括去除抑制TCR激活的信号、增加肿瘤定位和外显率以及改变T细胞代谢。

旨在增强由TCR触发的下游T细胞功能的临床前构建体的数量突出了对无偏见的系统文库筛选的需求，以揭示抗原靶标、转基因TCR和增强的工程化T细胞适应性之间的潜在协同效应。

TCR-T细胞免疫疗法的展望与总结

TCR-T细胞疗法是治疗肿瘤的强大免疫疗法。它的复杂性使其在临床前优化和临床试验中具有挑战性。本文表明TCR-T疗法可以进一步改进以充分发挥其潜力。优化包括TCR-T靶抗原的系统选择、肿瘤抗原异质性的影响以及TCR基因转移中的安全问题。同时，随着概念和技术的发展，产生了新的基因工程方法来增强TCR-T细胞功能和优化抗肿瘤免疫反应。这种优化是一个复杂的跨学科问题，它集成了免疫肿瘤学、肿瘤生物学和基因工程。

TCR-T细胞疗法的临床应用仍然具有挑战性。涉及多基因敲除和个体化治疗的复杂基因工程可以提高这些治疗的安全性和有效性。我们相信，解决这些问题并将其应用于TCR-T细胞产品的开发，将推动TCR-T细胞成为抗癌治疗的重要组成部分。

参考文献：

Liu, Y., Yan, X., Zhang, F., Zhang, X., Tang, F., Han, Z., & Li, Y. (2022). TCR-T Immunotherapy: The Challenges and Solutions. Frontiers in Oncology, 11.