快报 | 使用38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC融合蛋白和LAM增强人结核病血清IgG检测潜能

作者：闫卓红，王小珏，易玲，杨斌，韦攀健，阮洪云，王敬慧，杨新婷，张洪涛

第一作者及单位：闫卓红和王小珏，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所中心实验室

通信作者及单位：杨新婷，首都医科大学附属北京胸科医院结核科；张洪涛，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所中心实验室

Enhanced Serum IgG Detection Potential Using 38KD-MPT32-MPT64，CFP10-Mtb81-EspC Fusion Protein and Lipoarabinomannan （LAM）for Human Tuberculosis

Yan Z, Wang X, Yi L, Yang B, Wei P, Ruan H, Wang J, Yang X, Zhang H.

Pathogens，2022，11(12):1545.

doi: 10.3390/pathogens11121545.

PMID: 36558879.

研究背景

在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行之前的4年内，结核病是单一微生物造成感染性死亡的主要原因。由于没有单一且最佳的检测方法，结核病的诊断仍具有一定挑战性。结核抗体是结核病的候选生物标志物。然而结核病患者对结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原的抗体反应存在异质性。许多结核分枝杆菌抗原已被探索用于结核病的辅助诊断。使用单一抗原并不能同时实现可重复的敏感度和特异度。融合蛋白包含单个抗原的多个表位，有可能提高抗体检测的敏感度。

研究方法

1. 患者入组及样本收集：

本研究纳入了来自首都医科大学附属北京胸科医院的50例活动性肺结核患者（PTB）和17例非结核病受试者。50例肺结核患者中，分枝杆菌培养阳性者37例，阴性者13例；Xpert检测阳性者42例，阴性者8例；合并2型糖尿病（DM）者12例，未合并者38例；初始抗结核药物治疗时未治疗结核病者38例，治疗结核病者12例。收集血清样本备用，−80      ◦C保存。

2. 抗原准备：构建及表达纯化38KD-MPT32-MPT64（Rv0934-Rv1860-Rv1980c），CFP10-Mtb81-EspC（Rv3874-Rv1837c-Rv3615c）和Ag85B-HBHA（Rv1886c-Rv0475）融合蛋白。应用纯度至少为90%的蛋白质制剂进行后续检测，保存于 −80 ◦C。

3. ELISA检测：采用ELISA法检测38KD、MPT32、MPT64、CFP10、Mtb81、EspC、38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC、Ag85B-HBHA融合蛋白和脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）多糖抗原特异性IgG水平。

研究结果

1.研究对象的临床和人口统计学特征：本研究共纳入67例参与者，包括50例肺结核患者和17例非结核病受试者。研究对象的临床和人口统计学特征见表1。

2. 融合抗原的制备：38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC和Ag85B-HBHA融合蛋白分别包含867、981和514个氨基酸，预测分子量分别为89、105和55 kDa。通过SDS-PAGE检测观察到的3种融合蛋白分子量与预测值一致，纯度>90%（图1）。

图1

SDS-PAGE电泳鉴定纯化的结核分枝杆菌融合蛋白

注 M =分子量标记物；1 = 38KD-MPT32-MPT64；2 = CFP10-Mtb81-EspC；3 = Ag85B-HBHA。分子量以kDa表示

3. 38KD-MPT32-MPT64和CFP10-Mtb81-EspC融合蛋白较单个抗原提高了肺结核患者IgG检测能力：通过ELISA检测，发现结核病患者中38KD-MPT32-MPT64和CFP10-Mtb81-EspC融合蛋白及单个抗原（除EspC外）特异性IgG水平均明显升高（图2A和2B）。采用ROC曲线比较融合蛋白与单个抗原的IgG检测效能，结果显示，38KD、MPT32、MPT64和38KD-MPT32-MPT64的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.7788（95%CI：0.6619～0.8957）、0.7729（95%CI：0.6560～0.8899）、0.7006（95%CI：0.5560～0.8452）和0.8588（95%CI：0.7672～0.9504）（图2C）；CFP10、Mtb81、EspC和CFP10-Mtb81-EspC的AUC分别为0.6747（95%CI：0.5330～0.8164）、0.6900（95%CI：0.5551～0.8249）、0.5853（95%CI：0.4494～0.7211）和0.7118（95%CI：0.5878～0.8357）（图2D）。表明融合蛋白与单个抗原相比，AUC值有所提高。

应用矩阵图比较每例肺结核患者的融合蛋白和单个抗原IgG检测结果。发现38KD-MPT32-MPT64融合蛋白可以分别检测到94.4% （17/18）、88.9%（16/18）和83.3%（10/12）的38KD、MPT32、MPT64的特异性IgG阳性样本（图2E）；CFP10-Mtb81-EspC融合蛋白可以分别检测到90.0%（9/10）、92.3% （12/13）和61.5%（8/13）的CFP10、Mtb81和EspC特异性IgG阳性样本（图2F）。表明与单个抗原相比，融合蛋白的IgG检测效能有所提高

图2

结核病患者和非结核病受试者融合蛋白和单个结核分枝杆菌抗原特异性IgG检测。A、B：散点图，比较融合蛋白和单个抗原特异性IgG水平。水平线表示临界值，该值等于非结核病受试者的OD450平均值+2倍标准差。C、D：受试者工作特征（ROC）曲线，评价融合蛋白与单个抗原IgG检测效能。E、F：矩阵图，比较每例结核病患者融合蛋白和单个抗原的IgG检测结果。结核抗原特异性IgG阳性和阴性结果分别用蓝条和白条表示

4. 结核病患者Ag85B-HBHA融合蛋白和LAM多糖抗原特异性IgG检测：Ag85B是一种分泌蛋白，参与分枝杆菌细胞壁分枝菌酸的合成。HBHA是一种分枝杆菌细胞表面蛋白。LAM是MTB细胞壁的主要成分，是一种外表面抗原。结核病组Ag85B-HBHA和LAM抗原特异性IgG水平明显高于非结核病受试者（图3）。

图3

通过ELISA比较结核病患者和非结核病受试者的Ag85B-HBHA和LAM多糖抗原特异性IgG水平散点图

5. 抗原单独和联合使用时肺结核患者IgG反应特征：应用ROC曲线比较MTB特异性IgG检测对辅助诊断结核病的效能。38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC，Ag85B-HBHA、LAM和4种抗原组合的AUC值分别为0.8588（95%CI：0.7672～0.9504）、0.7118（95%CI：0.5878～0.8357）、0.7000（95%CI：0.5681～0.8319）、0.8294（95%CI：0.7082～0.9506）和0.8965（95%CI：0.8163～0.9766）（图4A和4B）。

当临界值设置为非结核病受试者的平均OD450+2倍标准差时，54.0%（27/50）、40.0%（20/50）、30.0%（15/50）和28.0%（14/50）的肺结核患者分别检测到38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC、Ag85B-HBHA和LAM的特异性IgG，特异度分别为94.1%（16/17）、100.0%（17/17）、94.1%（16/17）和94.1%（16/17）（图2A和2B、图3、图4C，表2）。通过抗原组合分析，37例（74%）患者被识别为结核抗体阳性（TB-Ab+），13例（26%）患者被识别为结核抗体阴性（TB-Ab-）（图4C）。通过韦恩图显示了TB-Ab+样本中每种抗原的IgG识别特征（图4C）。我们发现，38KD-MPT32-MPT64融合蛋白可以完全鉴定出Ag85B-HBHA特异性IgG阳性样本。我们的结论是，38KD-MPT32-MPT64、CFP10- Mtb81-EspC和LAM在IgG检测方面具有明确互补性。该组合检测IgG的敏感度、特异度、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和准确率（ACC）分别为74.0%、88.2%、94.9%、53.6%和77.6%（表2）。38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC和LAM组合与4种抗原组合相比具有相同的AUC（0.8965）。

图4

四种抗原在结核病鉴定中的性能分析。A: 采用ROC曲线评价4种抗原的IgG检测效能。B: ROC曲线下面积（AUC）。C: 依据图2和图3的数据，通过韦恩图显示4种抗原在抗体阳性患者（TB-Ab+，37例）中的检测分布特征

6. 结核病患者多亚组中抗原特异性IgG分布特征：Xpert阳性结核病患者和Xpert阴性结核病患者抗38KD-MPT32-MPT64抗体水平均高于非结核病组，但Xpert检测阳性患者与Xpert阴性患者间的差异无统计学意义；Xpert阳性结核病患者抗CFP10-Mtb81-EspC和Ag85B-HBHA抗体水平均高于非结核病受试组（图5A）。4种抗原的IgG水平在未合并糖尿病的结核病患者和合并糖尿病的结核病患者均明显高于非结核病受试组，但未合并糖尿病的结核病患者与合并糖尿病的结核病患者之间的差异均无统计学意义（图5B），表明合并糖尿病不影响MTB特异性抗体检测。初始未治疗的结核病患者和初始治疗结核病患者的IgG水平差异无统计学意义（图5C），与未治疗结核病患者相比，治疗患者LAM特异性IgG水平有下降趋势，但差异未达到统计学意义（P= 0.0541）。

图5

结核病（TB）患者和非结核病受试者（Non-TB）中融合蛋白和LAM多糖抗原特异性IgG检测。ELISA检测4种抗原特异性IgG水平的散点图。A：Xpert检测阳性结核病患者（TB-Xpert+）、Xpert检测阴性结核病患者（TB-Xpert−）与Non-TB的比较。B：未合并糖尿病的结核病患者（TB-Non-DM）、合并糖尿病的结核病患者（TB-DM）与Non-TB的比较。C：初始未治疗的结核病患者（TB-Non-T）、初始有抗结核药物治疗的患者（TB-T）与Non-TB的比较

研究结论

结核病患者中，38KD-MPT32-MPT64、CFP10-Mtb81-EspC和Ag85B-HBHA融合蛋白与单个抗原相比，显示出更高的IgG检测效能。

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

供稿：闫卓红

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2023-01-12

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