骨桥蛋白：肾结石形成的重要蛋白质

肾结石的发病率平均为10%，肾结石的复发率约为1年10%，5年35%，10年50%，20年75%。但是，目前还缺乏防治肾结石的良药。骨桥蛋白（OPN）是肾结石形成的重要蛋白质，但其作用存在争议，一些研究表明它抑制结石形成，而另一些研究表明它可以促进结石形成。OPN是一种高度磷酸化的蛋白质，随着研究的深入，越来越多的证据表明它促进结石形成，磷酸化的蛋白质被认为具有粘附作用，促进结石聚集和成核。此外，OPN与免疫细胞浸润密切相关，如OPN作为促炎因子，可激活肥大细胞（脱颗粒释放各种炎症因子）、巨噬细胞（分化为M1巨噬细胞）、T细胞（分化为T1细胞）等，这些炎症细胞发挥肾损伤和结石形成中的作用。总之，OPN主要以磷酸化形式存在于肾结石中，在结石的形成中起重要作用，可能是肾结石药物治疗的重要靶点。

1 骨桥蛋白

    OPN 最早是从牛骨基质中发现的。该蛋白由大约 314 个氨基酸组成，含有一个钙结合域和多个磷酸位点，其结构域富含天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸残基，分子量在 44 至 75 kDa 之间（Franzén 等， 1985 年；克莱宁等人，2014 年）。OPN的分子结构占磷酸化位点的比例最大，超过36个位点( Yalak and Vogel, 2012 ; Kariya et al., 2014)). OPN被高尔基体酪蛋白激酶磷酸化，磷酸化水平和位点受o-糖基化状态影响（OPN在富含苏氨酸/脯氨酸的区域缺失5个o-糖基化位点，增加细胞粘附活性和磷酸化，抑制整合素结合）（Kariya 等人，2014 年）和 1,25-(OH)2D3（诱导 OPN mRNA 表达上调，同时促进磷酸化 OPN 转化为非磷酸化状态）（Safran 等人，1998 年）。OPN 的磷酸化程度会影响细胞粘附和与其他蛋白质的相互作用（Kariya 等人，2021 年）。

2 骨桥蛋白对肾结石形成的影响

    OPN 是促进还是抑制肾结石目前尚存争议 ( Huang et al., 2022 ; Liu et al., 2022 )。肾结石形成的一个重要过程是肾小管中滞留的晶体转化为“混凝土”结石，其中草酸钙（CaOx）是肾结石的主要成分，OPN是含钙结石基质的主要成分在肾脏中（Okada 等人，2008 年）。早在 2003 年，Konya 等人。比较了 OPN、纤连蛋白、Tamm-Horsfall 糖蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白对体外 CaOx 结晶的影响, 并发现固定在胶原颗粒表面的 OPN 增强了种子的粘附和聚集, 并增强了新形成晶体的粘附力 ( Konya et al., 2003 )。

2008 年，Okada 团队通过向野生型小鼠 (WT) 和 OPN 基因敲除小鼠 (KO) 腹腔注射 100 mg/kg 乙醛酸盐 1 周，诱导肾 CaOx 结石形成。结果表明，WT中的晶体数量明显多于KO，WT小管内可见较大的花状晶体，而KO则为小而均匀的晶体。OPN 的免疫组化染色显示 WT 肾晶体含有 OPN 蛋白，而 KO 肾晶体则不含 ( Okada et al., 2008 )。2013年，Tsuji团队用1.5%的乙二醇诱导大鼠CaOx肾结石，发现肾脏中OPN的表达增加。然后使用体内转染的 OPN siRNA敲低OPN，结果显示与结石模型组相比，敲低组OPN和肾结晶的表达显着降低( Tsuji et al., 2014 )。然而，在 2003 年发表的一项研究中，Wesson 等人。在用 1% 乙二醇诱导 4 周后，在 KO 小鼠而非 WT 小鼠的肾脏中诱导显着的 CaOx 晶体。并且 OPN 免疫组织化学显示在 WT 小鼠的肾脏中有显着表达，由此他们认为 OPN 作为 CaOx 晶体形成和肾小管滞留的抑制剂，在体内发挥了关键的肾脏保护作用（Wesson 等，2003）). 有趣的是，Okada 团队后来的实验发现，1%、5% 和 10% 的乙二醇均不能成功诱导 WT 小鼠肾 CaOx 结石模型（Okada et al., 2007）。这似乎表明，用于肾结石建模的物种以及诱发结石的药物和剂量可能会得出相反的结论。这可能是近年来仍然存在两种观点的原因：抑制（Paloian et al., 2016 ; Imig, 2022 ; Liu et al., 2022）和促进（Li et al., 2019 ; Zhou et al., 2022a ;黄等人, 2022). 尽管 OPN 对肾结石的影响存在争议，但我们可以看出 OPN 在 CaOx 晶体的形成中起着重要作用。

3 骨桥蛋白在肾脏中的定位

    OPN主要存在于亨勒环降支细胞和萼穹窿区的乳头状表面上皮细胞中，更新速度较快，可能受到生理调节( Imig, 2022 )。在高草酸尿症期间，肾脏中的 OPN 表达增加，但仍主要局限于细肢和乳头状表面上皮细胞。CaOx 晶体沉积后，在整个肾脏（包括近端肾小管）中观察到 OPN 表达（Paloian 等人，2016 年）。OPN 定位于 Henle 环和集合管的细胞以及斑块部位。在免疫电镜下，OPN主要出现在磷灰石晶相表面，晶体与有机层的交界处（Paloian et al., 2016 ), 以及像年轮一样的CaOx结石之间( Li et al., 2019 ) (图1).

图1石晶在肾小管中的位置和晶体结构。(A) Henle 环降支上的晶体沉积。(B)晶体的水平截面。(C)水晶正面。(D)晶体放大结构。(E) OPN-晶体结合复合物（荧光绿色是 OPN 蛋白，黄色是晶体）。

4 骨桥蛋白诱导肾脏炎症免疫细胞的产生

4.1 骨桥蛋白诱导单核/巨噬细胞趋化

巨噬细胞的表型和功能受周围微环境的调节。众所周知，M1/M2 巨噬细胞的平衡极化决定了器官对炎症或损伤的反应命运。当感染或炎症严重时，巨噬细胞分化为M1型并释放炎症因子（如TNF-α、IL-12、IL-23），而组织损伤则诱导巨噬细胞分化为M2型并分泌大量炎症因子。IL-10 和 TGF-β 抑制炎症和修复损伤 ( Zhou et al., 2022a )。OPN 是一种促炎和单核细胞趋化因子 ( Kleinman et al., 1995). 当肾细胞损伤产生大量 OPN 时，它驱使单核细胞进入肾脏，促使单核细胞的巨噬细胞浸润并分化为 M1 促炎表型，导致肾纤维化（Khan 等，2002）。导致肾细胞损伤的因素包括高血压[例如，儿茶酚胺和盐敏感性高血压后的肾损伤( Johnson et al., 1999 )、输尿管阻塞后的肾积水性高血压( Yoo et al., 2006 )]、缺氧[例如，肾缺血/再灌注( Feitoza et al., 2008 )]、毒素( Pichler et al., 2008 )、感染等。

肾结石在流行病学和组织病理学上与肾脏疾病相关，并可能导致慢性肾脏疾病和终末期肾脏疾病（Zisman 等人，2015 年）；肾单核吞噬细胞，尤其是巨噬细胞，调节晶体发育（Zisman 等人，2015 年；Okada 等人，2010 年；Ichikawa 等人，2014 年）。高草酸盐小鼠的肾脏 CaOx 晶体自发消失，并表达多种巨噬细胞相关细胞因子和趋化因子 ( Okada et al., 2010 )。尿液和肾小管 CaOx 一水合物晶体在巨噬细胞存在下被分解和溶解 ( Vervaet et al., 2009 )。

包括巨噬细胞在内的单核吞噬细胞群在肾脏疾病中具有不同的反应（Williams 等人，2010 年）。几份报告表明，M2 巨噬细胞在肾病和缺血/再灌注急性肾损伤的体内模型中具有抗炎和组织愈合作用（ Tang 等人，2020 年；Zhang H 等人，2021 年；Zheng F 等人，2021 年） ). 然而，促炎性 M1 巨噬细胞会使肾脏状况恶化，导致慢性肾脏疾病和纤维化（Wang 等人，2021 年）。此外，大量的 M1 巨噬细胞有助于代谢综合征小鼠肾晶体沉积的发展（Taguchi 等人，2015 年）). 在 M2 缺陷小鼠中通过集落刺激因子 (CSF)-1 诱导 M2 巨噬细胞抑制肾脏 CaOx 晶体形成（Taguchi 等人，2016 年）。在高草酸盐 C57BL/6J 小鼠中，输注 M1 巨噬细胞和 M1 诱导因子（LPS 和 IFN-γ）促进肾结晶形成，而 M2 巨噬细胞和 M2 诱导因子（IL-4 和 IL-13）输注抑制肾结晶形成. 这些 M2 巨噬细胞治疗降低了晶体学相关基因（如 OPN 和 CD44）的表达，而 M1 巨噬细胞治疗增加了促炎和粘附相关基因（如 IL-6、NOS 和 TNF-α）的表达（Taguchi 等人., 2016). 这就说明 M2 型巨噬细胞抑制肾结晶的发育,这可能与促结石因子 OPN 的减少有关。

4.2 骨桥蛋白和 T 辅助细胞

辅助性T细胞主要有两种类型：Th1和Th2细胞，分别是炎性T细胞和抗炎性T细胞( Rautajoki et al., 2008 )。活化 T 细胞中的 OPN 基因表达受 T-bet 调节，T-bet 是一种控制 CD4+ T 辅助 (Th1) 细胞谱系定型的转录因子。T 细胞中 OPN 的 T-bet 依赖性表达对于 CD4+ T 和 CD8+ T 细胞分别向 Th1 和 1 型 CD8+ T 细胞通路有效倾斜至关重要（Shinohara 等人，2005 年）). 在过敏性哮喘中，OPN 增强致敏作用并下调 Th2 驱动的 IL-4 主导的炎症。增加的 OPN 表达抑制特异性免疫治疗期间的 Th2 效应。在 Th1 驱动的迟发性超敏反应中，例如过敏性接触性皮炎，OPN 支持树突状细胞 (DC) 迁移和 IL-12 表达，并由 T 效应细胞和角质形成细胞分泌，增强 Th1 介导的超敏反应并支持疾病的慢性化。Frenzel 和 Weiss，2011 年）。

研究报道，在动脉粥样硬化中，Th1 细胞驱动促炎反应，Th2 驱动抗炎反应，类似于尿路结石，血管内皮细胞上有类似的钙化病变（Hsi 等人，2016 年；Ley，2020 年）。有趣的是，促炎性 Th1 表型主要存在于肾系膜细胞和肾小管上皮细胞之间 ( Iwata et al., 2014 )。在含有 Randall 斑块（被认为是结石形成的起点）的肾乳头中，辅助性 T 细胞信号通路蛋白被上调。因此，辅助性 T 细胞免疫反应和相关的炎症过程似乎会导致兰德尔斑块上形成磷酸钙结石（Taguchi 等人，2019 年）).

4.3 骨桥蛋白和树突状细胞

OPN的mRNA在DC祖细胞分化早期上调，大量合成和分泌OPN，并随着刺激而增强( Kawamura et al., 2005 ; Blengio et al., 2013 ) . 成熟的 DC 被炎症或致病因素激活以产生特异性免疫反应。在因子的抗炎调节下，DC发挥调节Treg分化的作用，分泌的OPN受这些抗炎因子的调控( Del Prete et al., 2019 )。DC 迁移和免疫功能也受 OPN 调节。OPN 通过结合 DC 表达的 CD44 和 αvβ3 受体来介导 DC 迁移（Weiss 等人，2001 年）). OPN 可以激活 DC 释放因子（如 IL-12、IFN-γ 和 TNF-α）诱导 Th 细胞分化产生 Th1（Renkl 等，2005），也可能调节 Th1/ Th2 并限制 Th2 反应 ( Kurokawa et al., 2009 )。

4.4 骨桥蛋白和肥大细胞

肥大细胞 (MC) 是肾脏的组成细胞，数量很少，但在各种肾脏疾病中显着增加。对 MC 缺陷大鼠的研究表明，它们对肾纤维化具有改善作用（Miyazawa 等人，2004 年）。在抗肾小球基底膜抗体诱导的肾小球肾炎中，MC 通过启动修复和重塑功能来防止肾小球损伤的破坏作用。保护还可能包括限制自身反应性 T 细胞反应的免疫调节能力（Kanamaru 等人，2006 年）。MC 还通过激活组织重塑和中和纤维化因子来控制肾小管间质纤维化 ( Mouchet et al., 2021)). 然而，炎症期间 MC 激活和脱颗粒释放的介质会促进肾脏结构的破坏，导致肾间质纤维化（Summers 等人，2012 年；Kaltenecker 等人，2020 年；Zhou 等人，2022b）。因此，其他细胞与炎症介质相互作用的生理环境决定了MC在肾脏疾病发展中的最终作用（Bulfone-Paus and Paus, 2008）。

OPN 可以结合 MC 表面 CD44、αv 整合素受体，增强 IgE 介导的 MC 脱颗粒和迁移 ( Bulfone-Paus and Paus, 2008 )。虽然其他研究发现固定化 OPN 增强了与 MC 的相互作用，但可溶性 OPN 没有任何明显效果。OPN 和整合素结构域通过固定化 OPN 介导 MC 的激活，但不介导 MC 上的 CD44。固定在细胞外基质上的 OPN 可以通过将 MCs 保留在炎症部位并抑制 MCs 中抗 IgE 诱导的细胞因子的释放来调节人体适应性免疫 ( Ng et al., 2018 )。现在有大量证据表明 MC 在纤维化疾病中的重要作用（Samitas 等人，2011 年）). 然而，来自不同临床环境和不同动物模型的研究得出了关于 MC 如何影响纤维化的部分相互矛盾的结论，许多研究表明 MC 具有有害作用，而其他研究表明 MC 可能起到保护作用（Bradding 和 Pejler，2018 年） . 然而，可以肯定的是，MC 活化和脱颗粒促进了肾间质纤维化（Summers 等人，2012 年；Zhou 等人，2022b）。

5 骨桥蛋白与药物治疗肾结石

5.1 CaOx结石形成过程

    肾结石的平均发病率为 10%，中东地区为 20-25%。发病率因地域、气候、饮食结构等因素而异。肾结石的复发率约为1年10%，5年35%，10年50%，20年75%（Huang et al., 2022）。肾结石的主要矿物成分有五种，包括 CaOx、碳磷灰石、尿酸盐、磷酸铵镁和方解石（Kleeman 等人，1980 年；Ye 等人，2020 年）。超过 80% 的人类肾结石是 CaOx 和磷酸钙结石，单独或混合存在，是钙不透明结石（Kleeman 等人，1980 年；Fink 等人，2012 年；Aggarwal 等人，2013 年）). 肾结石的病理机制复杂，病因众多。一般认为结石是在Randall斑（肾乳头表面形成的钙化斑）的基础上形成的，结石是从肾表面Henle氏环细肢的基底膜开始形成的乳突（Stoller 等人，1996 年；Sherer 等人，2018 年；Wiener 等人，2018 年；Khan 等人，2016 年；Khan 等人，2021 年）。CaOx 结石通常附着在肾乳头表面的 Randall 斑块上，主要由磷酸钙晶体和富含蛋白质的有机基质（包括主要成分 OPN）混合而成（Khan 等，2021 ）). Randall 斑块的形成与周围肾组织中促炎性巨噬细胞 M1 的存在和抗炎性巨噬细胞 M2 的下调有关（Taguchi 等人，2016 年）。在动物模型中，肾脏中的晶体沉积与 ROS 产生、炎性小体激活和炎症级联相关分子如 OPN 的表达增加有关（Umekawa 等人，2004 年；Li 等人，2014 年；Letavernier 等人， 2018 年）。高草酸尿症和 CaOx 结石会诱导 ROS 产生和氧化应激，从而促进肾脏损伤，随后的炎症和免疫反应会导致 Randall 斑块和钙结石的形成（Khan 等人，2021 年）。

5.2 CaOx结石药物治疗研究现状

    柠檬酸盐是临床上广泛用于预防肾结石的药物。它的治疗机制是通过增加尿液中的柠檬酸盐和 pH 值来减少结石的形成 ( Barcelo et al., 1993)). 对口服柠檬酸盐治疗肾结石的七项随机对照试验的荟萃分析包括 477 名患者，其中大多数患有草酸盐结石。在治疗开始后 6、12 和 24 个月，使用腹部 X 线平片或静脉尿路造影或计算机断层扫描 (CT) 扫描（新结石形成），结石尺寸减小（残留碎屑减少或完全消失）或结石复发减少。它的四项研究包括 160 名参与者，表明口服柠檬酸盐可显着减小结石大小。包括 324 名患者在内的七项研究表明，柠檬酸盐治疗组的新结石形成明显减少。四项研究报告了不良事件，主要是胃肠道症状（如食欲不振、恶心、呕吐和腹泻）。与对照组相比，菲利普斯等人，2015 年）。2016 年发表在Nature上的一项研究从分子结构层面比较了羟基柠檬酸盐和柠檬酸盐在抑制 CaOx 晶体方面的作用。结果表明，羟基柠檬酸盐和柠檬酸盐均具有溶解和抑制CaOx晶体形成的能力。羟基柠檬酸盐的效果更好( Chung et al., 2016 )。体外研究表明，羟基柠檬酸盐具有与柠檬酸盐相当的钙结合能力，是一水草酸钙结晶的有效抑制剂（Kim et al., 2019），体内研究表明，羟基柠檬酸盐具有结石作用-溶解效果优于柠檬酸盐（杨等，2022）。羟基柠檬酸盐是柠檬酸盐的一种结构类似物，目前主要用作减肥的非处方补充剂（Márquez 等人，2012 年）。临床研究表明，口服羟基柠檬酸盐也有较多的胃肠道症状，大多数患者不能耐受长期使用（Heymsfield 等，1998）。

5.3 肾结石治疗药物可显着抑制骨桥蛋白的表达

     柠檬酸盐是目前预防结石的主要口服药物，也是指南推荐的溶石药物( Skolarikos et al., 2021 )。大鼠实验发现，经过柠檬酸盐处理后，结石的减少伴随着 OPN 和炎症的显着减少（Yasui 等人，2001 年；Chen 等人，2013 年；Alex 等人，2014 年）。比柠檬酸盐更有效的羟基柠檬酸盐也显着抑制 OPN 表达，并减少氧化应激和炎症以抑制肾脏 CaOx 沉积（Liu 等人，2020）。OPN 与结石减少之间的正相关也已在其他药物研究中显示 [例如虾青素 ( Alex et al., 2014))、白藜芦醇( Qin et al., 2018 )、没食子单宁( Lee et al., 2012 )]用于治疗肾结石。这就意味着能够显着抑制OPN表达的药物对肾结石具有治疗作用。

六，结论

     OPN 在肾结石形成中的作用存在争议，一些研究表明它抑制结石形成，而其他研究表明它可以促进结石形成。随着研究的进展，越来越多的证据表明它促进了结石的形成。OPN是一种高度磷酸化的蛋白质，一些研究表明磷酸化的蛋白质具有粘附作用，促进结石聚集和成核。然而，其他研究表明它可以防止结石聚集和成核。此外，OPN与免疫细胞浸润密切相关，如OPN作为促炎因子，可激活肥大细胞（脱颗粒释放多种炎症介质）、巨噬细胞（分化为M1巨噬细胞）、T细胞（分化为T1细胞），图 2). 综上所述，OPN主要以磷酸化形式存在于肾结石中，在结石的形成中起重要作用，可能是肾结石药物治疗的重要靶点。

图 2

OPN诱导巨噬细胞分化为M1巨噬细胞，诱导T细胞分化为T1细胞，并激活肥大细胞脱颗粒释放各种炎症介质，从而损害肾脏，促进结石形成。(内部学习资料）

Jia Q, Huang Z, Wang G, Sun X, Wu Y, Yang B, Yang T, Liu J, Li P, Li J. Osteopontin: An important protein in the formation of kidney stones. Front Pharmacol. 2022 Nov 9;13:1036423. doi: 10.3389/fphar.2022.1036423. PMID: 36452224; PMCID: PMC9703462.