不是CRBN？一种基于新E3连接酶的天然共价分子胶降解剂

导语

随着分子胶新技术的涌现与日益成熟，已经成为一种新的药用靶向策略，特别是对于那些通常认为“undruggable”靶点。然而，迄今为止大多数分子胶都是偶然发现的，如何更好的发现新的分子胶成为了新药研究中的关键问题。

由于分子胶可被视为蛋白-蛋白相互作用（PPI）的稳定剂，合适的筛选方法对新分子胶的发现至关重要。针对稳定PPI进行片段筛选或构建筛选文库等量身定制的方法，可以作为分子胶发现的化学起点，而重新筛选已有药物中的靶向特异性化合物，尤其是那些天然产物可能是发现具有额外降解机制的化合物的一个富有成效的来源。事实上，分子胶研究的起点也是源于对天然产物环胞菌素A、FK506与雷帕霉素作用机理的确定。

下文就介绍一种基于蛋白质微阵列筛选发现的中药蟾酥主要活性成分蟾毒灵（Bufalin），作为天然产物共价分子胶降解剂，可招募新的E3连接酶ZFP91实现对“undruggable”中枢转录因子E2F2的泛素化降解，具有潜在的转化医学价值。

研究背景

转录因子E2因子（E2F）家族在癌症基因网络的转录控制中发挥关键的调节功能，癌症基因网络对细胞周期进展、增殖、凋亡和分化至关重要。E2F2是E2F家族的一个重要成员，其异常表达与各种癌症的不良预后高度相关，这表明E2F2是潜在有价值的抗肿瘤靶点。E2F2作为一种中枢转录因子，在多种肿瘤细胞中见高表达，且E2F2高表达患者总体生存率低。此外，E2F2的表达也与癌症发生过程中致癌途径的转录和免疫细胞浸润呈正相关。然而，作为一种转录因子，E2F2缺乏典型的配体结合结构域，传统上被认为是“undruggable”。因此，选择性抑制E2F2功能的潜在治疗策略具有很高的研究价值。

分子胶是一类小分子，可以诱导蛋白质与蛋白质间的相互作用。广义上分子胶有三大类。分别是[1]作为胶水伴侣蛋白（AP）与靶蛋白（POI）的新PPI；[2]稳定AP与POI的原有PPI；[3]最熟知也是通常所说的分子胶降解剂，能够驱动以前认为“undruggable”蛋白质的降解。从机制上讲，分子胶通过使致病蛋白与泛素-蛋白酶体系统的成分直接相互作用，促进蛋白质-蛋白质的结合，从而导致靶标的选择性降解。与传统的酶抑制剂不同，分子胶通过靶蛋白和E3连接酶之间的邻近诱导相互作用，催化先前无法接近的蛋白质的快速和亚化学计量降解。由于分子胶可以利用广泛生物功能所需的蛋白质-蛋白质相互作用，使得其在治疗白血病、结直肠癌等多种人类癌症方面具有极大的潜力。

图1. 分子胶三大分类

基于这一背景，北京大学屠鹏飞/曾克武团队在eBioMedicine上合作发表了题为“Atypical E3 ligase ZFP91 promotes small-molecule-induced E2F2 transcription factor degradation for cancer therapy”的研究论文。论文阐明了中药蟾酥主要活性成分蟾毒灵（Bufalin）以天然分子胶方式促进转录因子E2F2的降解。文章揭示了ZFP91作为选择性降解E2F2的一种独特的非典型E3连接酶，并且还提供了基于分子胶的E2F2靶向策略用于癌症治疗的概念证明。

实验验证

研究团队设计了基于链霉素亲和标记的Bufalin-Biotin（图2），探测由20000个纯化的重组蛋白组成的人类蛋白质组微阵列，以检测潜在的Bufalin结合蛋白。经验证发现E2F2蛋白与Bufalin的解离常数（Kd）为3.15 ± 1.43 μM。同时，研究发现E2F2蛋白水平显著降低，且Bufalin能介导E2F2上多泛素链的形成。实验结果表明，Bufalin是一种E2F2的小分子降解剂。通过下拉分析显示，125–310的氨基酸残基片段，其含有E2F2的二聚化和DNA结合结构域，负责Bufalin的结合。免疫沉淀实验表明，E2F2倾向于与ZFP91形成免疫共沉淀，结合WB实验，证明了ZFP91是E2F2降解的E3连接酶。

图2 . 基于Bufalin-Biotin的蛋白微阵列筛选发现了靶点E2F2

MST结合试验表明Bufalin以462±146 nM的解离常数（Kd）与ZFP91结合。鉴于Bufalin含有一个可通过Michael加成反应与Cys反应的共轭不饱和系统，经LCMS/MS分析发现了Cys349，且C349A突变削弱了ZFP91与Bufalin的结合，表明Cys349为ZFP91上Bufalin的直接共价结合位点。

将Bufalin拆分成α-吡喃酮（α-Pyr）与DHA两个结构，发现α-Pyr直接与ZFP91蛋白结合（Kd=900 ± 322 nM），表明α-Pyr是Bufalin与ZFP91发生共价结合的关键基团。此外，α-Pyr和DHA都抑制了Bufalin诱导的HepG2细胞E2F2降解。这些发现表明，DHA结构负责与E2F2的结合，α-Pyr结构主要与ZFP91相互作用。特别是，当Bufalin浓度低至0.8μM时，E2F2显著降解，而E2F2的降解在约1.2μM时逆转。

图3. Bufalin招募ZFP91降解E2F2的作用模式

通过RNA测序进一步发现，经Bufalin诱导的E2F2降解导致了3000个基因的上调与2450个基因的下调。一系列验证表明，Bufalin显著促进了c-Myc、Polr2a、GMNN、CDK1、CCNE1、CCNE2和MCM5基因表达的下调。

图4. E2F2蛋白降解下调关键靶基因

E2F2降解策略的潜在转化医学价值

为了探究E2F2降解策略的潜在转化医学价值，研究团队设计了ICR小鼠中H22肝癌细胞异种移植模型进一步验证。在连续14天每天腹腔注射一次Bufalin（4 mg/kg）后，与对照组相比，Bufalin显著降低了ICR小鼠的肿瘤体积，效果与25 mg/kg的环磷酰胺（CTX）相当。同时，Bufalin在明显减轻了小鼠肿瘤重量的同时没有引起体重和器官重量的变化，实验表明Bufalin没有明显的副作用。通过H&E染色进行的病理检查显示，与载体组相比，异种移植肿瘤细胞松散地包裹着小细胞核。接下来，使用免疫组化（IHC）染色测量肿瘤中E2F2的蛋白表达水平，结果发现Bufalin给药显著降低瘤内E2F2表达水平，与阳性对照CTX有显著差别。以上实验结果表明，Bufalin作为一种可用的E2F2降解剂分子胶，对体内肝细胞肿瘤的生长表现出强大的抑制作用。

图5. Bufalin表现出显著的抗肿瘤活性并下调瘤内E2F2水平

此外，为了进一步研究Bufalin是否参与抗肿瘤免疫调节，作者建立了ICR小鼠肿瘤移植模型。分析免疫细胞（尤其是T细胞）浸润的结果表明，Bufalin显著提高了肿瘤组织中CD4+和CD8+T细胞的数量，增强抗肿瘤免疫应答。

图6. Bufalin参与抗肿瘤免疫调节

总结

锌指蛋白91（ZFP91）参与多种生理调控过程的研究以及比较充分，然而其作为癌症治疗靶点的潜在应用在很大程度上仍有待探索。ZFP91能是一种非典型E3连接酶，以泛素-蛋白酶体依赖的方式介导多种底物蛋白的降解，其中包括NF-κB诱导激酶（NIK）、FOXA1、hnRNPA1以及hnRNPAB等。本文提供了E2F2降解以依赖于ZFP91的方式选择性调节的证据。这些发现进一步扩大了先前未公开的E3连接酶ZFP91，在靶向“undruggable”蛋白尤其是在广泛的人类疾病中的转录因子方面的潜在应用范围。到目前为止，TPD领域探索的可用E3连接酶数量仍然有限（通常为CRBN、VHL、IAPs、MDM2、DCAF15和RNF114），。扩大E3连接酶工具箱对于加速小分子蛋白质降解剂的研发至关重要。

目前，招募E3连接酶的分子胶的应用非常有限，该研究揭示了蟾毒灵Bufalin作为一种独特的天然来源的分子胶，能够靶向一种全新的E3酶，扩充了我们对分子胶多样性的理解。此外，其吡喃酮结构可能是靶向ZFP91的潜在结构基团。值得注意的是，羰基共轭结构可能具有与ZFP91中的半胱氨酸共价结合的亲电加成能力。因此，更多的研究将使该结构基团能够用于发现新的具有分子胶性质的药物。此外，Bufalin对E2F2的降解范围相对温和。事实上，与传统的“占用驱动”模式不同，分子胶只提供结合活性，这是“事件驱动”的可重复使用，且具有相对较长的半衰期。因此，Bufalin能够持续以温和的方式促进靶蛋白降解。

作为一种特殊类型的分子胶，Bufalin还表现出与靶蛋白E2F2的特异性结合能力，这不同于经典的分子胶（仅针对E3连接酶）。然而，Bufalin与ZFP91的结合能力远高于E2F2。因此，这一特性为通过分子胶介导的机制有效降解底物蛋白提供了关键的生化基础。

尽管由于在结晶条件下E2F2的高度不稳定性，Bufalin与E2F2和ZFP91的复合物的晶体结构尚未解决，但荧光实时动态分析已经证实了Bufalin介导的E2F2和ZFP91之间的相互作用以及细胞质中复合物的形成。抗癌药物沙利度胺是分子胶的代表，它可以将E3泛素连接酶CRBN重定向为多泛素化转录因子IKZF1和IKZF3，用于蛋白酶体降解。然而，Bufalin是一种独特的分子胶骨架，其靶向ZFP91这一全新的E3酶，从而扩大了我们对靶向蛋白质降解策略的理解。

总之，该研究证明了一种新的非典型E3连接酶作为降解E2F2转录因子的药物靶点。此外，Bufalin作为分子胶发挥作用，通过ZFP91显著诱导E2F2降解，从而在癌症治疗中产生有前景的药用价值。

编者寄语

随着分子胶新技术的涌现与日益成熟，分子胶已经成为一种新的药用靶向策略，特别是对于那些通常认为“undruggable”靶点。作为靶向蛋白降解（TPD）技术的两大发展方向之一，分子胶相比于PROTAC更符合类药五原则，在药物研发成药性优化方面也更有优势。因此，分子胶也大有风头盖过PROTAC的趋势。

图7. 分子胶相比于PROTAC更符合“RO5”原则

然而，迄今为止大多数分子胶都是偶然发现的，如何更好的发现新的分子胶成为了新药研究中的关键问题。由于分子胶可被视为蛋白-蛋白相互作用（PPI）的稳定剂，合适的筛选方法对新分子胶的发现至关重要。针对稳定PPI进行片段筛选或构建筛选文库等量身定制的方法，可以作为分子胶发现的化学起点，而重新筛选已有药物中的靶向特异性化合物，尤其是那些天然产物可能是发现具有额外降解机制的化合物的一个富有成效的来源。事实上，分子胶研究的起源也是源于对天然产物环胞菌素A，FK506与雷帕霉素作用机理的确定。

图8. 分子胶发展史

鉴于目前对分子胶的研究发现其构效关系（SAR）范围较为狭窄，调节分子“表面暴露”部分可能是实现将现有小分子配体转化为分子胶，或是基于现有分子胶拓展新的降解靶点的合理策略。事实上，目前很多理性设计分子胶也是基于这一策略，这些发现的天然产物分子胶也成为了理性设计针对新靶点分子胶的化合物起点（如图9）。

图9. 基于天然产物分子胶理性设计（1）

图10. 基于天然产物分子胶理性设计（2）

本文对Bufalin的研究证明了其潜在的转化医学价值，其详细的体内作用机制还有待进一步的探究。同时，本文也证明了Bufalin这一天然产物在癌症治疗中有前景的药用价值。在今后探明其具体转化医学价值后，可以作为进一步成药性优化的起点。

在这篇研究论文中，有意思的一点是，E2F2蛋白与Bufalin的解离常数（Kd）为3.15 ± 1.43 μM，而其α-Pyr片段与ZFP91蛋白结合的Kd = 900 ± 322 nM（沙利度胺与CRBN结合的Ki值为249.2 nM，且其戊二酰亚胺结构是与CRBN结合的关键基团），远高于与E2F2的亲和力。目前已有PROTAC或分子胶分子中E3配体是简单的戊二酰亚胺结构。虽然目前缺乏E2F2-Bufalin-ZFP91三元复合物的晶体结构，且Bufalin的具体作用机制也有待进一步探究。是否可以设想，未来可以基于α-Pyr及其潜在结构优化片段，结合现有小分子配体的溶剂暴露区，理性设计针对新靶点的分子胶降解剂。同时，也希望今后有更多新的筛选方法，能发现针对新靶点新机制的分子胶。

图11.设想基于α-Pyr的新分子胶

撰文 | 谢伊

校对、排版 | 崔敏