复旦大学王永明课题组开发出三种精准性高的小型化Cas9

RNA 引导的 CRISPR-Cas9 系统被广泛应用于哺乳动物细胞的基因组编辑，在基因遗传病的治疗中展现出 巨大 的发展潜力。 限制基因编辑工具应用的主要因素包括编辑活性、 PAM 限制、蛋白大小、特 异性问题等。 识别 NG G PAM 的 SpCas9 编辑活性高，是最常用的基因编辑工具。 但 SpCas9 特异性较差，使用时往往伴随大量的有害突变。 且当 SpCas9 用于基因治疗时， SpCas9 太大无法被单个 AAV载体 递送。 SaCas9 虽然可以被单个 AAV 递送，但是向位 点 受复杂 NNGRRT PAM 的限制，编辑范围小。

因此，为了实现基因治疗目的，可被单个AAV包装且更加全面的CRISPR/Cas系统的开发成为基因编辑领域亟待解决的重要问题。

复旦大学王永明课题组致力于开发新型CRISPR/Cas9系统，扩大基因编辑范围。为此设计了Cas9蛋白的鉴定新思路，将基因编辑和GFP表达偶联，实现对CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中的快速筛选 （图1） 。团队先后对300多个Cas9进行鉴定，开发出一系列性能优异的核酸工具酶。该课题组于2020年3月开发出SauriCas9，识别NNGG PAM，蛋白较小，可被单个AAV包装，扩大了基因编辑范围。2021年4月团队开发出SlugCas9-HF，蛋白小、特异性高，活性可以和SpCas9媲美。2021年12月，该课题组开发出SchCas9，识别更简单的NNGR （R=A or G）  PAM，编辑范围得到进一步扩大。2022年8月，课题组开发出II类C型Nsp2Cas9及其嵌合体核酸酶，识别N4C PAM，进一步大幅扩展了基因组编辑范围。

图1：Cas9活性鉴定思路

2023年2月3日，王永明课题组在 Molecular Therapy 期刊发表了题为： Genome editing with natural and engineered CjCas9 orthologs 的研究论文。

CjCas9 是可编辑哺乳动物基因组的最小的Cas9核酸酶之一， 该研究通过对CjCas9同源蛋白的筛选，鉴定到3种天然基因编辑工具——Hsp1Cas9、Hsp2Cas9、CcuCas9，其PAM分别为N4RAA、 N4CC和N4CNA，扩大了基因编辑应用范围 （图2） 。

图2：CjCas9同源编辑工具的鉴定

为获得综合性质更优的编辑工具，作者以活性较高的Hsp1Cas9为骨架，与Hsp2Cas9的PI结构域嵌合，获得识别PAM为N4C和N4T的Hsp1-Hsp2Cas9 （图3） 。

图3：Hsp1-Hsp2Cas9嵌合体编辑工具的开发

作研究团队根据CjCas9晶体结构信息进行合理设计，得到了Hsp1-Hsp2Cas9-Y突变体，在不降低编辑活性的同时提高了精确性，为临床基因治疗应用提供了更加安全的编辑工具 （图4） 。

图4：Hsp1-Hsp2Cas9-Y的特异性分析

高思琪 、王瑶、齐涛为论文的共同第一作者，复旦大学王永明、孙淑娜、中国林业科学研究院华北林业实验中心刘慧慧为论文的共同通讯作者。