脂多糖抑制MCT1表达引起乳酸清除障碍促进肺泡上皮细胞上皮‑间质转化

冯金华胡钺 梅舒雅 汤日 周洋 邢顺鹏 皋源 何征宇 徐侨翌　

上海交通大学医学院附属仁济医院重症医学科，上海 200127

国际麻醉学与复苏杂志,2023,43(01):28-34.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220916‑00710

 基金项目 

国家自然科学基金（81970059）；

上海市2020年度“科技创新行动计划”自然科学基金（20ZR1433000）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟通过脂多糖（LPS）诱导的脓毒症相关性肺纤维化动物模型以及LPS诱导的肺泡上皮细胞上皮‑间质转化（EMT）模型，观察LPS刺激前后肺组织乳酸积聚和肺泡上皮细胞EMT变化情况及其与单羧酸转运蛋白‑1（MCT1）表达状态之间的关系，以明确MCT1在LPS诱导肺组织乳酸积聚、肺泡上皮细胞EMT以及脓毒症相关性肺纤维化过程中的重要作用。

1 材料与方法      

24只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为对照组（Con1组）和脂多糖刺激组（LPS1组），每组12只。LPS1组小鼠连续3 d腹腔注射LPS 5 mg·kg−1·d−1，Con1组小鼠注射等体积生理盐水，造模7 d后取材。Western blot法和免疫荧光检测肺组织MCT1以及EMT相关标志蛋白［E‑钙黏蛋白（E‑cadherin）、波形蛋白（Vimentin）］的表达情况，ELISA法检测血清中乳酸含量，马松（Masson）染色评估肺组织纤维化程度。

将MLE‑12细胞按照随机数字表法分为4组（每组3个孔）：PBS对照组（Con2组）、乳酸组（Lac2组）、脂多糖组（LPS2组）及乳酸+脂多糖组（Lac+LPS2组），分别用PBS、10 mmol/L乳酸、1 mg/L LPS和10 mmol/L乳酸+1 mg/L LPS刺激48 h。使用Western blot法及免疫荧光检测各组细胞MCT1、E‑cadherin、Vimentin水平，同时检测各组细胞上清液pH值。

2 结果      

2.1　肺组织E‑cadherin、Vimentin、MCT1蛋白水平，病理学改变及血清乳酸水平比较

与Con1组比较，LPS1组小鼠肺组织E‑cadherin、MCT1蛋白水平明显降低（t=4.17，P=0.002；t=5.12，P<0.001），Vimentin水平明显升高（t=3.64，P=0.005）；血清乳酸水平明显升高（t=5.09，P<0.001）。

Masson染色显示：LPS1组小鼠肺组织出现肺泡隔增厚和胶原沉积。见图3。

2.2　肺泡上皮细胞E‑cadherin、Vimentin、MCT1蛋白水平及上清液pH值比较

与Con2组比较：Lac2组细胞MCT1蛋白水平明显升高（P=0.048），E‑cadherin、Vimentin水平差异无统计学意义（P>0.05），pH值差异无统计学意义（P>0.05）；LPS2组与Lac+LPS2组细胞E‑cadherin水平降低（P<0.001，P<0.001），Vimentin水平升高（P=0.009，P<0.001），MCT1蛋白水平明显降低（P=0.039，P=0.002），pH值均降低（P<0.001，P<0.001）。与Lac2组比较，Lac+LPS2组细胞E‑cadherin水平明显降低（P<0.001），Vimentin水平明显升高（P=0.002），MCT1蛋白水平明显降低（P<0.001），pH值降低（P<0.001）。见图4。

细胞免疫荧光结果显示：与Con2组比较，Lac2组细胞MCT1荧光强度增强，E‑cadherin、Vimentin荧光强度无明显变化；LPS2组与Lac+LPS2组E‑cadherin、MCT1荧光强度减弱，Vimentin荧光强度增强。与Lac2组比较，Lac+LPS2组E‑cadherin、MCT1荧光强度减弱，Vimentin荧光强度增强。见图5。

3 讨论     

本研究的结果表明，脓毒症小鼠肺组织发生了EMT，同时，LPS刺激小鼠肺泡上皮细胞后细胞也发生了EMT，提示LPS诱导肺泡上皮细胞EMT过程可能是脓毒症相关性肺纤维化发生的关键环节。

本研究使用外源性乳酸刺激小鼠肺泡上皮细胞，48 h后发现较Con2组细胞MCT1水平升高，细胞培养上清液pH值差异无统计学意义，EMT相关标志蛋白E‑cadherin、Vimentin差异均无统计学意义。由此可见，生理情况下，肺泡上皮细胞MCT1蛋白的表达可以帮助乳酸转运进入胞内降解，减少胞外乳酸积聚，维持细胞外液酸碱平衡。此外，本研究发现，与Con1组比较，脓毒症小鼠肺组织MCT1蛋白水平降低，血清乳酸升高；同时，与Con2组比较，LPS刺激小鼠肺泡上皮细胞后LPS2组及Lac+LPS2组MCT1表达降低，两组细胞培养上清液pH值均降低。本研究分别在细胞和肺组织水平证实：脓毒症过程中，LPS可抑制肺泡上皮细胞MCT1表达，从而抑制有氧酵解代谢产物乳酸向细胞内运输和降解，引起细胞外乳酸积聚以及细胞外液酸化，该过程可能和肺泡上皮细胞EMT以及脓毒症相关性肺纤维化的启动相关。同时，该结果证明了MCT1的正常表达对于乳酸转运进入胞内降解、抑制胞外乳酸积聚的重要作用。

综上所述，本研究证实了在LPS诱导的肺纤维化过程中，LPS可通过抑制小鼠肺泡上皮细胞MCT1的表达进而抑制细胞外乳酸的降解导致细胞外液酸化，从而促进其EMT和组织纤维化过程，对MCT1表达状态的合理调控可能是抑制脓毒症过程中肺组织乳酸积聚、肺泡上皮细胞EMT以及脓毒症相关性肺纤维化进程的理想手段。

本研究存在不足之处：未在细胞和组织水平针对MCT1的表达状态进行干预以进一步验证假说。有待更全面深入的研究以明确MCT1在脓毒症肺组织乳酸积聚、肺泡上皮细胞EMT以及脓毒症相关性肺纤维化进程中的重要作用。