科研丨SBB: 土壤微生物组特征与耕地中的农药残留有关

编译：微科盟放文，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

农药在农业中广泛应用于防治疾病、害虫和杂草，导致农药残留对农业土壤造成长期污染。虽然传统的风险评估实验反复讨论了农药带来的直接影响，但我们采用生态学方法研究了土壤中的残留农药如何影响现实农业条件下的土壤微生物组。本研究评估了广泛的土壤特征，包括在常规、免耕和有机管理下的60块田中出现的48种广泛使用农药。然后，我们测试了哪些因素最能解释土壤微生物组的特征，环境因素(包括气候、地理和土壤特征)是土壤微生物组的主要驱动因素。值得注意的是，在所有管理因素中，农药残留与土壤微生物组特征的相关性最强，甚至比种植系统的影响更为明显。农药残留几乎完全与113种细菌和130种真菌类群的相对丰度呈正相关，其中许多类群属于已知农药降解菌的类群。虽然真菌多样性和丰度主要与农药残留呈正相关，但细菌多样性和nifH基因(生物固氮所必需)丰度与单个农药残留浓度呈负相关。本研究结果表明，农药残留会改变土壤微生物组，对农业土壤的功能具有潜在的长期影响。

论文ID

原名：Soil microbiome signatures are associated with pesticide residues inarable landscapes

译名：土壤微生物组特征与耕地中的农药残留有关

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：8.546

发表时间：2022.9

通讯作者：Florian Walder

通讯作者单位：瑞士Agroscope植物-土壤相互作用研究组

DOI号：10.1016/j.soilbio.2022.108830

实验设计

结果

1 细菌和真菌微生物群的组成

16S rRNA和ITS基因片段扩增分别产生11,600和1,764个OTUs。去除低丰度OTUs后，分别保留了8375个16S-和1444个ITS-OTUs。在8375个16S-OTUs中，7065个被归类为细菌，6个被归类为古菌，剩余1304个未分类或未知。在细菌域内，6个最常见的门占所有16S-OTUs的88.7%；它们分别是变形菌门(9.7% α变形菌、9.6% β变形菌、6.2% γ变形菌、8.4% δ变形菌和1.5%其它变形菌门)、酸杆菌门(19.7%)、拟杆菌门(12.6%)、疣微菌门(9.2%)、放线菌门(8.9%)和浮霉菌门(2.9%)。

在1444个ITS-OTUs中，717个被归类为真菌，727个仍未分类或未知。6个最常见的门占所有真菌ITS-OTUs的96.5%；它们是子囊菌门(52.2%)、担子菌门 (12.7%)、Chytridiomycota (12.1%)、Mortierellomycota (8.8%)、Glomeromycota(6.4%)和Rozellomycota(4.3%)。

2 土壤微生物组的环境决定因素

在测试的因素中，土壤、气候和地理变量主要决定了土壤微生物组，而农业管理的影响相对较小。土壤特征是真菌和细菌多样性指数最重要的驱动因素。它们解释了14-31%丰富度和均匀度的显著变化(图1，表S6-9)，其中质地是主要因素(表S10)。地理也是细菌和真菌有效物种丰富度的重要预测因子(解释了15-22%的变异)，其中空间位置比海拔解释更多(表S10)。作为一个整体，气候对细菌16S有效丰富度(12-14%)有显著影响，但解释的方差比例小于土壤特征和地理(图1，表S6-9)。在气候变量中，降水对多样性指数的变异解释最显著(表S10)。

除了对细菌和真菌多样性的影响外，我们还评估了这些因素对16S和ITS基因绝对丰度的影响。16S基因的丰度主要受地理因素的影响，其次受土壤和气候的影响(图1C)。相比之下，ITS基因的丰度受土壤影响最大。

细菌和真菌群落的PCA反映了环境决定因素的强烈影响，表明土壤pH值存在固定梯度，但没有根据种植系统进行分组(图2)。前两个主成分分别解释了16S-和ITS-OTUs中总体方差的56.4%和49.8%。不同环境特征对细菌和真菌群落组成和系统发育距离影响的PERMANOVA结果证明了环境条件的重要性(表S11/S12)。对于16S-OTUs，土壤对群落组成有显著影响。相比之下，地理仅在细菌群落之间的系统发育距离的情况下才有意义。对于ITS-OTUs，只有土壤显著影响群落组成，但对真菌群落的系统发育距离没有显著影响。在环境条件方面，两种OTU类型最重要的条件似乎是坐标系的空间变化(地理)、采样前六个月的平均温度(气候)和pH值(土壤；表S10)。

在下一步中，我们测试了环境决定因素是否会影响单个OTU的丰度。对于16S-OTUs，土壤的影响最为显著，所有OTU中有58.9%受到土壤特性的显著影响(图3A，表S13)。土壤特性可解释16S-OTUs中一半以上个体OTUs丰度的变化(70%)。地理和气候也显著影响特定OTU，其中18.6%和12.6%的OTU是显著的，并解释了50%和40%的单个OTU丰度变化。对于ITS-OTUs，结果相似，尽管远小于对16S-OTUs的影响，土壤、地理和气候的显著OTUs分别为5.9%、4.6%和0.5%(表S14)。

图1 环境特征(土壤、地理和气候)、种植系统和管理因素(包括农药)在解释细菌(左)和真菌(右)物种丰富度(A)、Pielou均匀度(B)和16S或ITS基因拷贝数(C)方面的相对重要性。颜色表示农药对细菌和真菌特性的影响方向(橙色表示负面影响，深灰色表示正面影响，白色表示无法指定方向)。显著性：• P<0.1, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。

图2 细菌和真菌群落的主成分分析(PCA)。

对所有样本的归一化操作分类单元(OTU)丰度进行PCA分析。(A)对于16S-OTUs，前两个轴分别解释了所有方差的40.6%和15.8%。(B)对于ITS-OTUs，前两个轴分别解释了所有方差的44.4%和5.4%。样品根据种植系统(左)和pH值(右)着色。

3 农 业管理和农药残留对微生物群落的影响

几种农药残留与细菌和真菌多样性指数相关。例如，2-羟基莠去津、草甘膦、AMPA、多菌灵与细菌多样性指数呈负相关(图1、图S4/S5、表S6/7)。相比之下，农药残留与真菌多样性指数呈负相关和正相关。2-羟基莠去津与真菌均匀度呈负相关，而S-异丙甲草胺与真菌多样性和均匀度呈正相关(图1，图S6，表S8/9)。值得注意的是，农药残留在解释细菌和真菌多样性方面的相对重要性是相似的，无论是单独拟合还是在种植系统之后分别拟合(图1和S2，表S6-9)。与土壤层的相互作用是明显的，但它们至多是相等的，通常弱于农药残留的主要影响(图S3)。

种植系统只是细菌均匀度的一个重要预测因素(图1，表S7)。作物多样化、土壤耕作、氮肥投入和有机改良剂的管理与细菌或真菌多样性指数没有显著关联(表S6-9)。而单个农药残留量与细菌和真菌多样性指数有明显的相关性，但除草剂、杀菌剂、杀虫剂用量和农药残留总量无显著相关性(表S5-S8)。细菌和真菌群落组成与种植系统、管理指标或农药残留无显著相关性(表S11/12)。

与多样性指数的响应相比，管理效应对绝对16S和ITS基因丰度的相对重要性也相对较小(图1C)。在所测试的农业管理特性中，只有有机改良剂对16S基因的绝对丰度有影响，并且影响是负面的。相比之下，ITS基因的丰度与几种残留农药呈正相关，并容易受到种植系统的影响(图1C)。

4 农药残留敏感微生物类群

然后，我们测试了种植系统、管理指标和农药残留是否与8375个16S-OTUs和1444个ITS-OTUs的相对丰度相关(图3)。特定农药残留与113个16S-OTUs显著相关，多菌灵、戊唑醇、草甘膦和2-羟基莠去津与10多个16S-OTUs相关(图3A，表S9/10)。除了2-羟基莠去津和几个16S-OTUs相关外，农药残留几乎完全与单个OTU丰度呈正相关(图3B/C)。在显著相关的16S-OTUs中，71.7%的特定农药残留总体上呈正相关。同样，130个ITS-OTUs显示出与特定农药残留的显著相关(97.7%的正相关)，其中利谷隆、S-异丙甲草胺和去乙基莠去津的残留量最高。农药残留可以解释高达32%的个体OTU丰度变化(图3A)，这些农药残留敏感的OTU既不稀有也不占优势(图S7)。有趣的是，真菌ITS-OTUs的丰度与农药残留的相关性高于16S-OTUs的丰度(真菌为8.9%，细菌为1.3%)。

相比之下，种植系统仅与41个16S-OTUs和3个ITS-OTUs相关(表S13/14)。从管理指标来看，只有土壤耕作与少数16S-OTUs和ITS-OTUs有显著关联；但是，只有在不考虑种植系统影响的情况下才适用。

农药残留敏感的OTU广泛分布在整个系统发育树中，在所有主要门中都有发现(图4和S8)。一些属富含对农药敏感的16S-OTUs，并始终与各种农药残留呈正相关。积极反应原核属的例子是Mucilaginibacter、Niastella、Edaphobacter、Polaromonas和Burkholderia，大多数与2-羟基莠去津或多菌灵有关(图4，表S15)。少数属含有明显较多的农药敏感16S-OTUs，表现为负相关，特别是Skermanella和Pedomicrobium。在显著富集的农药敏感OTU真菌属中，有Chytridiomycota的Spizellomyces，担子菌门的Volopluteus和Heterobasidion，以及子囊菌门的几个属，如Aspergillus、Beauveria、Candida和Fusarium，与残留物去乙基莠去津、嘧菌环胺和S-异丙甲草胺有关(图S8，表S16)。

图3 农药残留对单个OTU丰度的影响。

(A)环境特征(土壤、地理和气候)、种植系统和农药残留在解释8375个16S-OTUs和1444个ITS-OTUs的丰度中的相对重要性。每个柱状图后面的数字表示受所示变量(nsig)显著影响的分类群数量。(B)农药敏感类群的热图，其中113个16S-OTUs和130个ITS-OTUs的丰度随农药残留而显著改变。所示为模型系数，蓝色和红色分别为与农药正相关或负相关的OTUs。仅显示具有显著OTU的农药残留。(C)对农药敏感的16S-和ITS-OTUs与土壤中相应农药残留浓度之间关系的示例。

图4 对农药残留敏感的细菌类群。

显示与农药残留相关的原核OTUs的分类树。条形图显示了特定农药残留的相对重要性。颜色表示农药作用的方向(橙色表示负面影响，深灰色表示正面影响)。指定的属级别显示在内部文本圈中。如果属名以粗体显示，则该属富含对农药残留敏感的OTUs。

5 农药残留与土壤氮循环有关

最后，我们评估了农业管理和农药残留的发生是否与土壤氮循环中心基因的绝对丰度相关(图5)。当统计模型首先考虑种植系统时，除nirK之外的所有基因都与至少一种残留农药显著相关。参与固氮的nifH丰度仅与几种残留农药负相关，包括草甘膦及其代谢物AMPA(图5)。AOA的amoA也与农药残留S-异丙甲草胺和特丁津呈负相关。而AOA和AOB的amoA基因与其它残留农药呈显著正相关。

同样，nosZI与几种残留农药的浓度呈正相关或负相关，而nosZII仅与甲霜灵呈正相关。农药残留在解释这些功能基因的绝对丰度方面的相对重要性相对较高，平方和在4.0和9.6%之间。在所有管理变量中，只有种植系统与AOA的amoA基因丰度显著相关。我们的结果表明，农药残留会影响耕地土壤微生物组。我们观察到农药残留浓度与微生物多样性、特定微生物类群的相对丰度以及与氮循环相关的功能基因的绝对丰度之间存在明显的关联。观察到的关联具有高度的化合物特异性，而代表总体农药污染的指数(包括每个样品的残留量、除草剂等)的影响则不太明显。同样，我们没有发现任何证据表明特定农药类别(例如杀菌剂、除草剂或杀虫剂)或作用方式可以解释土壤微生物组特征(表S17)。然而，农药残留与微生物组特征的关联比其他管理特征更强，甚至超过了种植系统的影响。

图5 环境特征(土壤、地理和气候)、种植系统和管理因素(包括农药)在解释N循环中不同功能基因丰度方面的相对重要性。

这些基因是土壤氮循环的标志：amoA基因负责硝化，nirK和nosZ基因负责反硝化，nifH负责固氮。颜色表示系数的方向(橙色表示负，深灰色表示正)。显著性：• P<0.1, * P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001。

讨论

农药是现代农业不可分割的一部分，但会导致农业土壤的广泛和长期污染。虽然一系列研究在前瞻性风险评估中调查了农药施用对土壤微生物群落的直接影响，但尚未有研究检查农药残留在农业土壤中对微生物群落的影响程度。本研究通过将48种广泛使用的残留农药与耕地土壤中的土壤微生物组特征联系起来，首次阐明了这一关键问题。本研究结果表明，农药残留对耕地土壤微生物组结构和功能的影响大于其它管理特征，如种植制度、施肥和耕作。

农药残留与土壤微生物组特征之间的联系是高度可变的，范围从严格的负面影响到大部分正面影响。在单个OTU水平上，大多数细菌和所有真菌OTU与农药残留呈正相关，表明残留农药具有刺激作用。可以解释微生物类群与农药残留之间的这种正相关的一个可能的直接影响是生物降解，农药被微生物代谢并作为一种资源的过程。虽然我们的数据没有提供直接证据，但我们的观察结果表明生物降解发挥了作用，正如与阿特拉津及其代谢物的关联所概述的那样。

真菌降解阿特拉津会产生两种主要的代谢物，去乙基阿特拉津和去异丙基阿特拉津。我们发现，几种真菌OTU的丰度与这两种代谢物呈正相关，例如，在曲霉属中含有能够降解阿特拉津的真菌(图S8)。相反，细菌通常会引发阿特拉津的降解，从而产生代谢物2-羟基阿特拉津。事实上，我们发现细菌OTU的丰度仅与2-羟基莠去津的增加有关，而与前两种代谢物无关(图4)。特别是，属于Mucilaginibacter的OTU与2-羟基莠去津呈正相关，Mucilaginibacter早先已被确定为好氧莠去津降解菌群落中的优势属。

在我们的数据中，生物降解的进一步迹象是在较高的戊唑醇浓度下Burkholderia的富集，因为已经通过实验表明Burkholderia细菌可以降解三唑类杀菌剂(图4)。其它一些细菌和真菌属，如已鉴定出的农药降解菌Polaromonas、Fusarium和Acidobacteria的细分属也与农药残留呈正相关。早期的研究表明，特定微生物群丰度的增加与它们产生专门的酶来降解这些杀虫剂的能力有关。从这个意义上来讲，额外的宏基因组分析可以更直接地了解生物降解对耕地土壤微生物群落组成的重要性。

因此，农药残留可能代表农业土壤中特殊微生物类群的新生态位，可以增加整体微生物多样性。然而，我们只看到了对真菌多样性的刺激作用的迹象(图1)。相比之下，农药残留与细菌多样性指数始终呈负相关。很可能，这种对细菌多样性的影响可归因于残留物的潜在毒性作用，这威胁到易感细菌类群的丰度。与此一致，我们发现多菌灵、2-羟基莠去津和草甘膦(与细菌多样性降低相关的残留物)也显示出与几种细菌OTU相对丰度呈显著负相关(图3)。这种负相关尤其经常出现在细菌属Skermanella和Pedomicrobium以及Acidobacteria subdivision 6的OTUs中(图4)，其对杀虫剂的敏感性已在之前的研究中得到证实。因此，这些微生物群可以作为农业土壤中农药胁迫的微生物指标。然而，需要进行进一步的实验研究以确认农药是否直接威胁这些分类群。

值得注意的是，我们发现与OTU的积极关联远大于消极关联。造成这种情况的一个原因可能是残留物的生物降解依赖于化合物特异性酶，只有当微生物具有适当的酶时，它才能在残留物的存在下茁壮成长，从而导致大量的特异性反应。相比之下，对微生物的毒性来自于对大多数细菌或真菌共同的基本过程的抑制，但其易感性程度不同。这导致了更渐进和更广泛的响应，而在OTU的相对丰度中可能不太明显。因此，负相关类群可能在当前的分析中没有被完全捕获，因此被低估了。

农药残留对细菌和真菌微生物群的显著影响可能不能完全归因于毒性和生物降解的直接影响，而是由间接影响驱动的。尽管我们的研究结果没有提供直接证据，但众所周知，农药可以通过对不太敏感的微生物提供优势并取代生态位竞争者来影响生态位的竞争。当猎物/宿主受到农药胁迫时，农药也被证明会加速捕食者-猎物和宿主-病原体的关系。除了这些间接影响和直接毒性影响之外，人们还可以推测，少数农药降解菌群的优势导致整体细菌多样性随之下降。

相比之下，我们的数据表明，真菌种群表现更好，即多样性和丰度增加(图1)。然而，我们预计杀菌剂会对土壤真菌产生特别严重的不利影响，正如早期研究单一杀菌剂影响的研究中所报道的那样。令人惊讶的是，我们发现杀菌剂与真菌多样性和其它性状的关联很弱，如果有的话，也是正向的。目前尚不清楚为什么我们没有发现与杀菌剂有任何负面关联。然而，分析的除草剂多于杀菌剂，因此这项研究可能没有充分体现杀菌剂的作用。值得注意的是，我们用于检测真菌的引物仅少量覆盖了Glomeromycota，并发现其丰度与土壤中农药的数量和浓度呈负相关。最近的一项研究还表明，杀菌剂的应用与丛枝菌根真菌的多样性呈负相关，并降低了它们为植物获取磷的能力。

尽管微生物多样性的影响似乎很显著，但这些数据并不能直接表明土壤功能受到影响的程度。因此，我们通过大量对氮循环至关重要的微生物基因来研究土壤功能的更直接指标。我们只发现农药残留与固氮细菌常见的基因nifH之间存在负相关(图5)。我们的研究结果补充了早期的研究，这些研究报告了农药对生物固氮、根瘤菌招募和根瘤形成的不利影响，并暗示农药残留可能对农业土壤生物固氮构成长期风险。

我们可以进一步将农药残留与参与硝化作用的基因联系起来，但会产生不同的化合物特异性结果，而在早期的研究中，土壤硝化菌主要受到负面影响。相比之下，我们发现在反硝化过程中将N2O转化为N2的核心nosZ基因(图5)和消耗N2O的细菌Niastella属(图4)与不同的残留农药呈正相关。这些结果表明，根据化合物的不同，农药也可能通过影响微生物的特定功能群来减轻有害土壤过程，例如硝化作用和N2O排放。土壤的氮循环之所以敏感，究竟是因为只有少数分类群能够实现这些功能，还是因为酶对化学扰动天生敏感，这一点仍有待澄清。目前还不清楚农药残留是直接影响转化氮的微生物，还是转移土壤中的氮库并产生间接影响。然而，我们可以强化最近的前瞻性风险评估结果，即土壤氮循环似乎对农药残留特别敏感，因此可以作为评估农药胁迫的微生物指标。

即使考虑到种植系统之间的差异，例如传统和有机农业之间的差异，农药残留与微生物组特征之间的关系也很明显。这强调了我们的结果超出了种植系统的影响。值得注意的是，种植制度和管理指标对土壤微生物组的影响并不像最近在田间试验中报道的那样明显。田间试验中的农业管理比较了同一土壤类型的明确定义和对比处理，而我们的农场研究包括许多不同的农场，每个农场在各种土壤气候条件下都有一套独特的管理实践。不明确的管理和不同的环境条件可能导致种植系统之间的差异不太明显。与许多研究一致，我们的分析还证实了土壤、地理和气候特征等环境决定因素是解释景观尺度土壤微生物组特征的最重要因素。在我们的统计模型中，通过首先考虑由环境决定因素解释的变化，我们仍然能够专注于农业管理的影响。

我们的统计分析揭示了特定农药残留与微生物组特征之间的明确关联。我们必须提到的是，我们发现研究土壤中最常见的农药残留与微生物组特征的关联最强(表S1)。还不清楚农药残留在其生物利用度方面有何不同，从而显著影响暴露。在这种情况下，同样重要的是要注意，统计推断的影响不是基于孤立的残留农药，而是基于复杂的混合物，因为每个样品中发现多达32种不同的残留物。由于这些原因，无法从这种环境中得出关于单个残留物的生态毒性的结论。

此外，本研究缺乏有关不同领域农药施用方案的详细信息。因此，此处统计推断的潜在影响要么是先前的长期影响，即在施用后立即高暴露，要么是对电流的响应，但由于剩余残留物而导致的低暴露。因此，希望在未来的研究中包含有关农药施用方案的此类关键信息，以突出不同暴露途径的重要性。诸如本研究之类的生态风险评估只能表明生态毒理学问题。因此，这些观察结果需要通过前瞻性风险评估中的对照实验来补充，以确认所谓关系的因果关系。

结论

本研究报道了农药残留对土壤微生物群落多样性和功能的影响。有趣的是，统计分析表明农药残留对土壤微生物组的影响超过了种植系统的影响。这些结果表明，农药残留对耕地的广泛和长期污染可能会损害细菌多样性，尤其是固氮细菌(肥沃土壤的关键特性)。我们的结果补充了之前的研究，表明农药残留对有益的土壤真菌和蚯蚓有不利影响。目前的工作进一步表明，许多微生物类群，特别是真菌，对农药残留有积极反应，这可能是由于生物降解过程，表明农药对土壤微生物组影响的复杂性。

目前，农药的监管评估仅测试单一微生物指标土壤氮矿化的即时反应。本研究表明，需要通过增加微生物指标的数量和评估农药混合物的长期影响来扩大评估过程中的努力。这些工作应侧重于对土壤有益的生物(例如生物固氮或土壤真菌吸收养分)。改进的风险评估也与发展可持续农业生态系统的需求有关，这种生态系统更多地依赖自然过程并旨在减少合成投入。