科研丨Gut Microbes: 类风湿关节炎患者的粪便真菌菌群失调, 但非致病性变化

编译：微科盟梧魚，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

类风湿关节炎(RA)与口腔和肠道微生物群密切相关。真菌细胞壁成分引发小鼠模型炎症性关节炎。然而，关于真菌群落在类风湿关节炎发病机制中的作用知之甚少。为了评估RA与肠道微生物组之间的关系，有必要对RA患者的细菌和真菌群落进行探究。因此，本研究调查了30名健康对照和99名RA患者的粪便细菌和真菌群落的组成和相关性。RA患者Bifidobacterium(双歧杆菌属)和Blautia的相对丰度降低，而Streptococcus(链球菌属)的相对丰度增加。RA患者粪便真菌群落中Candida(念珠菌属)的相对丰度高于健康对照组，而健康对照组中Aspergillus(曲霉菌属)的相对丰度高于RA患者。念珠菌物种特异性基因扩增结果表明，白色念珠菌是念珠菌中数量最多的物种。排序分析和随机森林分类模型支持了细菌和真菌群落结构变化的结果。Aspergillus是健康对照组粪便真菌的核心属，而Saccharomyces spp.在西方人群中占优势。此外，细菌-真菌关联分析表明，RA患者的hub节点已经从真菌转移到细菌。RA患者中真菌失调的发现表明真菌在RA的粪便微生物群落和发病机制中起着关键作用。  

论文ID

原名：Dysbiotic but nonpathogenic shift in the fecal mycobiota of patients with rheumatoid arthritis

译名：类风湿关节炎患者的粪便真菌菌群失调，但非致病性变化

期刊：Gut Microbes

IF：9.434

发表时间：2022.12

通讯作者：Wan-Uk Kim

通讯作者单位：韩国加图立大学医学院

DOI号：10.1080/19490976.2022.2149020

实验设计

结果

1、描述性统计

RA患者和健康对照组(HC)的人口统计学和临床特征见表1。该研究包括99例RA和30例HC。RA组91个样本(91.9%)来自女性，HC组100%来自女性。RA组平均年龄为57.8±10.1岁，HC组平均年龄为46.9±3.5岁。类风湿因子(RF)阳性77例(77/93，82.8%)，抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)阳性75例(75/98，76.5%)。在RA患者中，87例(87.9%)患者使用了常规合成抗风湿药物(csDMARDs)，40例(40.4%)患者使用了生物制剂(其中32例患者同时使用了生物制剂和csDMARDs)。RA患者使用的药物列在表S1中。

表1 研究参与者的特征。

2、粪便微生物群落组成

在粪便细菌群落中观察到HC和RA之间的明显组成差异(图S1)。Bifidobacterium、Streptococcus、Blautia、Lachnospiraceae和一种未知物种在RA组和HC组中均大量存在(图1a)。然而，相对丰度<0.3%的属在RA组中占89.4%，在HC组中占54.2%(图1a)。HC组Bifidobacterium和Blautia丰度高于RA组；RA组Streptococcus丰度高于HC组。这些差异具有统计学意义(Bifidobacterium，P=0.0299；Blautia，P=0.0024；Streptococcus，P=0.0195)(图1b)。

最丰富的真菌门是Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门)和Mucoromycota(图S2)。HC组Basidiomycota与Ascomycota之比高于RA组(HC组为5.28%:65.7%；RA组为4.55%:75.42%)，而HC组的Mucoromycota比例高于RA组(平均相对丰度：HC组为4.35%，RA组为1.74%)。RA组的Saccharomycetes丰度较高(HC，35.2%；RA，59.9%)，而HC组中Aspergillaceae的丰度更高(HC，23.9%；RA，10.0%)(图S2)。在属水平上，Candida、Saccharomyces和Aspergillus是最丰富的真菌(图1c，d)。RA组Candida的相对丰度显著高于HC组(P = 0.00013)，而HC组中Aspergillus的相对丰度显著高于RA组(P=0.00092)(图1d)。此外，在RA组中，Kazachctania、Issatchenkia、Penicillium和Mucor的丰度往往更高，尽管这些发现在统计学上并不显著(图1c，d)。与西方队列研究结果相反，两组之间的Saccharomyces丰度没有差异(图1d；平均相对丰度：HC，12.9%；RA，14.2%；P=0.6204)。因此，RA可能与粪便细菌和真菌群落的组成变化有关。

图1

健康对照组和RA患者粪便微生物群落组成。(a)属水平的细菌群落组成。(b)丰富细菌属的两两比较。(c)属水平真菌群落组成。(d)丰富真菌属的两两比较。丰度<0.5%的分类单元归为“低丰度”。图b和图d中，框和线分别表示相对丰度的四分位极差(Q3-Q1)和中位数。黑点表示潜在的异常值。下须和上须显示属的相对丰度最小和最大。采用双侧Mann-Whitney U检验评估差异显著性。***，P<0.001；**，P<0.01；*，P<0.05；ns，P>0.05(不显著)。HC，健康对照；RA，类风湿关节炎患者。

3、粪便微生物多样性

接下来我们研究了RA对微生物群落多样性的影响。细菌和真菌的alpha多样性指数，包括OTUs指数、Shannon指数和Simpson指数，各组间差异不显著(均P>0.05)(图S3)。在主坐标典范分析(CAP)中，约束排序分析显示细菌和真菌群落明显分为HC组和RA组(图2a)，而无约束主坐标分析并没有根据RA状态显示微生物群落的明显聚类(图S4)。置换方差分析(PERMANOVA)显示RA组的细菌群落(R2=0.01746，P=0.0002)和真菌群落(R2=0.0216，P=0.0001)的组成存在显著差异(表S2)。Bifidobacterium、strecoccus、Aspergillus和Candida的相对丰度在两组间均存在差异(图2b)。虽然RA没有影响粪便微生物群落的丰富度或多样性，但它通过改变粪便细菌和真菌群落的分类组成显著影响了beta多样性。

图2

健康对照组和RA患者粪便细菌和真菌群落排序分析。基于Bray-Curtis距离，通过CAP估计样本间的组成变化。(a)粪便细菌和真菌群落组成的变化。HC样本以蓝色显示；RA样本以深黄色显示。(b)根据丰富属的相对丰度进行排序分析。强度越大，相对丰度越高。图a和图b的左右两侧分别为细菌和真菌群落。

4、RA患者相关的细菌和真菌OTUs

用线性判别分析效应量(LEfSe)分 析了HC组和RA组OTUs的相对丰度。在1338个细菌OTUs和1595个真菌OTUs中，57个细菌OTUs和45个真菌OTUs丰度存在差异(图S5a，S6a)。RA组比HC组多14个细菌OTUs和10个真菌OTUs。RA组富集的OTUs来源于Candida、Meyerozyma、Penicillium、Aurobasidium、Xeromyces、Coprinopsis和Wallemia。此外，与RA组相比，HC组有43个细菌OTUs和35个真菌OTUs。HC组富集的OTUs来源于Aspergillus、Conocybe、Monascus和Schizosaccharomyces。

通过基于机器学习的分类研究了RA相关的OTUs。为此，我们构建了细菌和真菌群落的随机森林分类模型。随机森林模型显示，对HC和RA样本进行分类需要70个细菌OTUs和70个真菌OTUs(图S5b，S6b)。在这些OTUs中，LEfSe还鉴定出了27个细菌OTUs和25个真菌OTUs(图3、S5a、S6a)。RA组中有2种细菌OTUs和4种真菌OTUs更丰富，而HC组中其余OTUs更丰富(图3)。这些结果表明，细菌和真菌OTUs丰度的降低导致了HC组和RA组之间的组成差异。

图3

与类风湿关节炎相关的微生物特征。随机森林模型用于识别解释肠道细菌(A)和真菌(b)群落的OTUs。根据差异丰度分析结果，OTUs被分为“HC-富集”和“RA-富集”(图S5a， S6a)。使用10倍交叉验证方法构建随机森林模型。OTUs根据总丰度沿y轴排列。x轴上的每个标记表示单个HC或RA样本。

5、粪便细菌-真菌的关联

我们构建了一个基于相关性的微生物网络来研究微生物之间的关联。HC组的粪便微生物网络包括701个节点和1419条边(图4a)，而RA组的粪便微生物网络包括801个节点和1679条边(图4b)。在HC组和RA组之间，度和中介中心性没有显著差异(图S7)。HC组真菌节点多于RA组，且hub组成在组间存在差异。Hub节点定义为度、中介中心性和接近中心性均在前1%的节点。据此判断，HC组细菌-真菌跨界网络的hub为真菌OTU F87_Penicillium(图4c)。RA组的hub节点为Lachnospiraceae科中的细菌OTU B3_f_Lachnospiraceae(图4d)。这些数据表明，真菌影响HC患者的微生物群落组成，而与生态失调相关的细菌影响RA患者的微生物群落组成。

图4

粪便菌群的跨界共现网络和hub节点。(a) HC网络图。(b) RA网络图。在a和b中，每个节点对应一个OTU；节点之间的边对应于使用SparCC方法从OTU丰度曲线推断出的正相关(黑色)或负相关(红色)(P<0.05，相关值<−0.3或>0.3)。属于不同微生物界的OTUs用颜色表示(细菌，象牙色；真菌，绿色)，节点大小反映了中心度。(c)微生物HC网络的hub节点。(d)微生物RA网络的hub节点。在c和d中，hub被定义为度、中介中心性和接近中心性都在前1%的节点。虚线表示度、中介中心性和接近中心性的阈值。

6、粪便真菌群落对药物的反应

抗风湿药物的使用改变了微生物群落。例如，依那西普部分缓解了RA患者的细菌失调。肠道细菌群落也可以决定RA患者对氨甲蝶呤(MTX)的反应。我们检查了RA治疗对真菌群落的影响。我们将患者分为三组：csDMARDs组(接受csDMARDs治疗的患者；N=55)，csDMARDs+生物制剂(使用csDMARDs和生物制剂治疗的患者；N=32)和生物制剂(用生物制剂治疗的患者；N=8)。由于使用生物制剂治疗的患者较少，因此将生物制剂组排除在进一步分析之外。与HC组相比，csDMARDs组和csDMARDs+生物制剂组中Candida更为丰富(图5a，b)。然而，在RA患者中，csDMARDs组Candida的相对丰度低于csDMARDs+生物制剂组(图5a)。RA组内Candida丰度差异无统计学意义(图5b)。与csDMARDs+生物制剂组相比，csDMARDs组Aspergillus的相对丰度降低，而Penicillium的相对丰度增加(图5a)。

使用Candida特异性引物对随机抽取的HC组和RA组粪便样本进行聚合酶链式反应(PCR)。白色念珠菌(C. albicans)是RA样本中丰度显著较高的真菌物种。RA组可见200 ~ 300 bp的条带；HC组中没有这样的条带(图S8)。RA组白色念珠菌DNA含量显著高于健康对照组(HC，Ct=30.4±1.33；RA，Ct=23.9±3.08)。csDMARDs+生物制剂组白色念珠菌DNA含量略高于csDMARDs组(csDMARDs，Ct=24.0±3.02；csDMARDs+生物制剂，Ct = 23.7±3.19)(图5c)。

临床因素方面，Candida相对丰度与年龄(Spearman r=0.29153，P=0.000802)、RF水平(Spearman r=0.20217，P=0.021579)、CRP水平(Spearman r=0.2927，P=0.000762)、ESR(Spearman r=0.27676，P=0.000136)、MTX剂量(Spearman r=0.18648，P=0.034349)、总胆固醇水平(Spearman r=0.24822，P=0.004563)呈显著正相关(图5d)。曲霉菌(Aspergillus)相对丰度与上述因子呈显著负相关(RF水平：Spearman r=−0.24993，P=0.004283；ESR：Spearman r=−0.20742，P=0.018344；MTX剂量：Spearman r=−0.22778，P=0.00943；总胆固醇水平：Spearman r=−0.238，P=0.006607)。

图5

药物对Candida丰度的影响。(a)根据用药情况测定粪便菌群组成。(b) Candida相对丰度。字母表示有统计学意义，由Kruskal-Wallis检验和Dunn检验确定。(c)白色念珠菌定量PCR分析结果。字母表示统计学显著性，由方差分析和Tukey显著性差异检验确定。(d)真菌OTUs相对丰度与定量变量的相关性。用Spearman秩相关法估计相关系数。*表示有统计学意义(***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)。红色和蓝色方框分别表示正相关和负相关。

7、真菌生态失调可用于类风湿关节炎的表征

在粪便样本中发现了核心OTUs(或流行OTUs)：129个粪便样本中有85%检测到核心细菌OTUs，而70%的粪便样本中检测到核心真菌OTUs。5个核心细菌OTUs属于Lachnospiraceae，而5个核心真菌OTUs属于Candida、Aspergillus、Issatchenkia、Cladosporium和一个未知的真菌属(图6a)。随后发现了3个重叠的核心真菌OTUs，但没有发现重叠的核心细菌OTU(图6b，c)。在细菌核心OTUs中，B3_f_Lachnospiraceae、B8_f_Lachnospiraceae和B9_f_Lachnospiraceae可以用随机森林模型区分HC组和RA组。然而，LEfSe结果显示，这些OTUs的相对丰度差异不具有统计学意义(图3，S5)。在真菌核心OTUs中，F1_Candida、F4_Aspergillus和F22_Cladosporium可以使用LEfSe和随机森林模型区分HC和RA组(图3，6c，S6)。研究了RA的血清标志物ACPA和RF与粪便真菌群落的关系。Aspergillus和Candida在HC组和RA组之间的丰度不同，与ACPA无关。Aspergillus与RF呈显著负相关，而Candida与RF呈正相关(图5d)。因此，真菌微生物群落的变化，特别是Aspergillus和Candida的变化，可能是RA的一个特征。

图6

粪便菌群中核心OTUs的分析。(a)基于85%的细菌流行率(深蓝色)和70%的真菌流行率(深绿色)确定了核心OTUs。方框颜色表示OTUs的相对丰度。颜色强度越大，相对丰度越高。y轴上的每个标记表示一个单独的样本。(b)细菌和(c)真菌OTUs数量的维恩图，由LEfSe、随机森林模型和核心分析识别。

讨论

肠道或粪便微生物群在几种人类疾病中起着重要作用。我们在类风湿关节炎患者的粪便中发现了一种独特的微生物组成。虽然RA组和HC组的相对细菌丰度不同，但α多样性无显著差异(图1，S1，S3a)。CAP和随机森林分析显示Bifidobacterium和Streptococcus分别是HC组和RA组的代表(图2，S5)。在亚洲人群的粪便样本中也发现了类似的细菌属分布。

真菌影响细菌群落的组成。细菌-真菌跨界网络分析显示，HC组的hub OTU为F87_Penicillium，RA组的hub OTU为B3_f_Lachnospiraceae(图4)。Penicillium产生大量有益的次生代谢产物，具有抗生素、抗真菌、免疫抑制和降低胆固醇的特性。仅通过csDMARDs治疗，RA患者中Penicillium相对丰度的改变得以恢复(图5a)。据报道，Lachnospiraceae在ACPA阳性患者中大量存在。由于75(76.5%)的RA患者是ACPA阳性，我们假设在RA患者中，核心OTU从F87_Penicillium转变为B3_f_Lachnospiraceae。RA组与HC组在真菌群落中的差异比在细菌群落中的差异更明显。F1_Candida和F4_Aspergillus是差异最大的真菌属(图6)。

Aspergillus引起真菌群落发生了显著变化。一个属于Aspergillus (F4_Aspergillus)的OTU是核心真菌OTU(图6a)；HC组比RA组更丰富(图3)。Saccharomyces cerevisiae对人体健康有益。粪便真菌群落的改变主要是在西方队列中研究的。我们发现在HC和RA组之间Aspergillus(而非Saccharomyces)的丰度有显著差异。据报道，酵母菌在食用西方饮食(如面包、啤酒和乳制品)的个体中更常见，而Aspergillus在素食者中更常见。在饮食与韩国相似的日本和中国，健康成年人粪便真菌群落中的Aspergillus比Saccharomyces更丰富。因此，根据蔬菜和发酵大豆食品的膳食比例，Aspergillus是韩国人粪便真菌群落的重要成员。

真菌对类风湿关节炎患者的粪便微生物群落组成有显著影响；Candida是粪便中数量最多的属(图1b，d)。Candida spp.经常在人的胃肠道和粪便中被检测到，在炎症性肠病、囊性纤维化和阴道念珠菌病患者中其数量增加。我们发现，治疗RA的药物会影响真菌群落的组成，因此csDMARDs和生物制剂可以提高C. albicans的丰度(图5c)。这与先前的报道一致，炎症性肠病(IBD)患者接受免疫抑制剂治疗后C. albicans丰度增加。在抗风湿药物和肿瘤坏死因子-α抑制剂治疗过程中，RA患者出现了C. albicans特异性Th17反应受损，导致C. albicans丰度增加。虽然在RA患者和IBD患者中C. albicans丰度的增加并不能排除由疾病引起的生态失调的可能性，但这表明生态失调是由药物引起的。此外，尽管C. albicans的增加可能导致机会性感染，但在RA患者中，念珠菌病的风险很低，因为他们保留了对C. albicans的有效免疫反应。

在本研究中，患者粪便中Aspergillus丰度的降低和Candida丰度的增加表明这种变化是RA所特有的。关于Aspergillus的进一步研究将深入了解其在健康粪便真菌群落中的作用及其对人类健康的影响。本研究的结果表明，真菌群落的变化可以作为RA患者粪便生态失调的指标。

综上所述，本研究调查了类风湿关节炎患者粪便微生物群落中的生态失调和真菌-细菌相互作用。真菌群落的变化表明HC和RA患者之间存在明显的生态失调，而细菌群落的变化则没有。未来的研究应该检查C. albicans丰度的增加是否是由免疫抑制或免疫调节药物引起的。我们的结果是有限的，因为它们包含了基于生物信息学的RA相关变化对粪便微生物群落影响的预测。需要体内实验来证实RA改变了真菌群落。因此，C. albicans和Aspergillus对RA相关免疫途径影响的实验验证研究是必要的。健康韩国人的粪便真菌群落中Aspergillus含量更高，而RA患者的粪便真菌群落中Saccharomyces含量相当。进一步的研究是必要的，以明确本研究的结果不同于西方队列。