【论肿道麻】靶向端粒：端粒维持机制与特异性癌症治疗的研究进展

癌细胞通过激活端粒维持机制(TMM)以实现无限复制，以端粒为靶点是治疗绝大多数癌症的新思路。2022年7月Jixuan Gao等人于《Nature Reviews Cancer》杂志发表了一篇关于靶向端粒癌症治疗的综述“Targeting telomeres: advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies”，该综述讨论了端粒酶和端粒替代延长（ALT）维持端粒的机制差异、目前用于检测每种机制的方法、这些方法在临床诊断中的应用以及端粒酶和端粒替代延长途径相关的肿瘤治疗策略的最新进展，并介绍了利用现有治疗药物和新途径对肿瘤治疗以及根据TMM来针对不同癌症类型进行干预的新途径。

端粒酶

端粒酶通过延伸线性染色体的3′端以补充在每一轮细胞分裂过程中丢失的端粒重复序列。人类端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的催化成分，端粒酶活性是通过hTERT实现的。端粒酶在生殖细胞和大部分干细胞中具有活性，但在分化的体细胞中通过hTERT的沉默表达而受到抑制。hTERT的异色基因组环境促进了hTERT的分子紧密性抑制，由于hTERT是依靠部分分子序列维持端粒长度，因此这种抑制对端粒长度保持至关重要。癌细胞通过多种途径重新表达hTERT，从而激活端粒酶，而hTERT启动子突变可以通过招募转录因子EST家族来替代天然的hTERT沉默，这是最常见的泛癌驱动点突变之一。

端粒替代延长（ALT）  

端粒替代延长途径是一种依赖同源定向修复（HDR）延长端粒的非端粒酶依赖性TMM。因此，ALT阳性细胞具有在没有端粒酶的情况下维持端粒的能力。ALT机制的激活涉及端粒向可重组状态的转变，这涉及端粒染色质的改变和复制应激能力的提高。α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X连锁（ATRX）或死亡结构域相关蛋白6（DAXX）的缺失触发染色质失活，这被认为是ALT活性诱导所必需的（图1）。然而，ALT阳性癌症中ATRX或DAXX突变的低发病率表明染色质失活可能有助于但不是ALT诱导活性的必要条件。其他研究表明，核小体重塑、ZNF827复合物和组蛋白-赖氨酸N-乙基转移酶SETDB1所致的染色质致密化的增加也可以刺激和增加ALT活性。总之，这些研究表明了ALT启动、ALT传播和维持对端粒染色质环境的要求。

图1. 染色质重塑产生ALT允许状态  

当DNA中的损伤阻碍复制叉的进展导致叉停滞时，可能会形成复制应激。广泛的末端重复序列及其形成二级结构的倾向，如G4s、RNA-DNA杂交体、t-环和D-环，可使端粒复制困难。由于端粒染色质的异常和蛋白质结合的改变，使得ALT途径的细胞中的端粒（ALT端粒）表现出DNA的加剧损伤和复制应激。复制应激反应蛋白SWI/SNF相关基质的相关肌动蛋白依赖性染色质亚家族A样蛋白1调节因子（SMARCAL1），以及范可尼贫血蛋白范可尼贫血互补组M（FANCM）和FANCD2，在管理ALT端粒的复制应激水平方面发挥着重要作用（图2）。

图2. 利用ALT对端粒复制应力进行消解

这些蛋白质重塑复制叉，触发叉回归和复制的重新启动。如果未进行修复，停滞的前叉可能会恶化为DNA双股断裂（DSB）最终促进DNA修复因子的招募和延长端粒的HDR机制的参与。ALT端粒同时参与了多种修复途径，具有不同的要求、时间动力学和结果。  

ALT途径产生了几种生物标志物，可用于临床前研究中识别ALT活性。广泛同源重组（HR）后ALT阳性细胞表现出了不同的端粒长度和端粒姐妹染色质交换数量的增加。ALT阳性细胞的端粒合成主要发生在早幼粒细胞白血病（PML）核小体的亚型中，称为ALT相关早幼粒白血病小体（APBs）（图3）。APB是由液-液相分离形成的核病灶，有助于端粒的结合和聚集。APB是ALT途径的细胞所特有的，由PML和Sp100蛋白外壳以及庇护素成分、参与DNA复制和修复的蛋白质和端粒DNA组成，通过非共价小泛素样修饰物（SUMO）-单相互作用基序（SIM）相互作用结合。ALT活性涉及断裂诱导复制，可产生大量的染色体外端粒重复序列（ECTR）。对于ALT阳性细胞，四种主要ALT标志物中需包含至少两种（异质端粒长度、端粒姐妹染色质交换、APB和ECTR）。

图3. ALT在端粒上参与多种DNA修复途径

端粒酶靶向的治疗策略

端粒酶靶向的治疗策略是通过改变端粒长度来抑制细胞增殖能力的一种有效的癌症治疗手段。然而，局限性包括端粒酶抑制后的滞后期（端粒在观察到任何细胞毒性作用之前缩短到临界长度）以及对高度增殖的组织细胞（如依赖端粒酶再生的造血干细胞和表皮干细胞）的潜在毒性。目前，该领域研究已不单单局限于抑制端粒延长。

1.抗hTR的寡核苷酸

端粒合成可被抑制hTR功能的寡核苷酸阻断。这些寡核苷酸目标作用于hTR的模板区。当两者结合是可以有效地抑制端粒重复加成的催化作用。虽然这些寡核苷酸可以有效地诱导端粒缩短，但仅在体外实验中观察到这一效果。脂质基团的添加可以提高寡核苷酸的细胞渗透性和生物利用度，竞争性结合hTR序列模板以抑制端粒酶活性，已在不同肿瘤模型中显示出体内和体外疗效，并已证明其对骨髓纤维化和低风险骨髓增生异常综合征具有临床疗效。进入II期临床试验后，FDA将其指定为复发性或难治性骨髓纤维化治疗药物。但该药物对于人类其他癌症类型的抑制作用还有待于观察。对于更具有特异性和有效性的端粒酶抑制剂的研究仍在继续。  

2.核苷类似物

核苷类似物通过端粒酶与端粒末端共价结合，由于缺乏3′-OH功能团，从而阻止进一步核苷酸的添加。由于结构相似，许多先前用于抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）逆转录酶的类似物也被发现可抑制hTERT催化位点。已在端粒酶阳性癌症中研究的核苷类似物包括叠氮胸苷（AZT，FDA批准用于治疗HIV）、6-thio-dG和5-MeCITP。

AZT进入细胞后被磷酸化为AZT-三磷酸，其结合到DNA中以阻断转录延伸。 AZT首先被发现可导致单细胞纤毛虫四膜虫和人类淋巴细胞的端粒逐渐缩短和生长停滞。 在癌症中，AZT对端粒缩短和细胞死亡的影响主要发生在病毒诱导的恶性肿瘤中，如人类T细胞白血病病毒I型（HTLV1）诱导的成人T细胞白血病、获得性免疫缺陷综合征相关的卡波西肉瘤和爱泼斯坦-巴尔病毒相关的淋巴瘤。 在临床上，接受AZT治疗的HTLV1诱导的白血病患者表现出与端粒酶活性降低相对应的癌症消退。 6-Thio-dG是端粒酶的竞争性抑制剂，通过诱导端粒缩短和端粒功能障碍，抑制A549肺癌和弥漫性固有桥脑胶质瘤异种移植物的生长，并被进一步证明可以跨越血脑屏障从而成为治疗脑肿瘤的药物。 核苷类似物也可以在不掺入端粒DNA的情况下对端粒酶产生抑制作用。 5-MeCITP是一种含有甲氧基的吲哚核苷酸类似物，该甲氧基保留在端粒酶的催化位点，以阻止端粒酶进一步延长端粒。 与AZT不同，5-MeCITP对端粒酶以外的聚合酶具有抑制作用，从而提高其毒性，但其脱靶效应较少。 因此，尽管5-MeCITP对端粒酶阳性的癌细胞显示出选择性毒性，但其效力不如AZT。

3.hTERT小分子抑制剂

BIBR1532和MST-312是目前最有前景的hTERT小分子抑制剂。BIBR1532是从体外筛选中发现的，并发现其对端粒酶具有选择性。BIBR1532在非催化位点与hTERT结合，从而非竞争性抑制端粒酶活性。非竞争性抑制剂不需要与内源性底物相竞争因此效果更好。其不阻断最初的端粒延伸事件，而是与端粒酶拇指结构域的疏水口袋相互作用，以阻断端粒重复添加所需的进一步易位。BIBR1532对癌细胞的端粒延长有抑制作用，其细胞毒性作用似乎是由端粒结构的直接损伤引起的。在临床前研究中，BIBR1532已对包括乳腺癌、纤维肉瘤、子宫内膜癌和白血病等多种癌细胞具有有效作用，其还具有使耐药癌细胞对化疗敏感的倾向。  

另一种hTERT小分子抑制剂MST-312可以通过阻断hTERT基因的转录而发挥作用。MST-312可治疗各种癌症类型的细胞，包括乳腺癌、肺癌和结肠癌，其作用机制为诱导hTERT表达下调、端粒酶活性降低和端粒缩短，从而导致细胞周期停滞和凋亡。

4.针对hTERT的免疫治疗  

端粒酶可以通过刺激针对表面hTERT的免疫反应的疫苗进行治疗靶向。癌细胞可以加工内源性hTERT，并通过主要组织相容性复合体（MHC）I和II分子在细胞表面呈现hTERT肽。hTERT疫苗通常包含一些酶的肽链，这些肽被注射到真皮中，树突状细胞将抗原呈递给淋巴结中的CD4+T辅助细胞1（TH1）。这些hTERT特异性TH1细胞迁移到肿瘤中，刺激CD8+T细胞对抗表达hTERT的癌细胞，或通过释放细胞因子、FAS或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）凋亡诱导直接杀死癌细胞。  

GV1001是一种基于跨越hTERT活性位点的氨基酸肽的早期疫苗，已被证明可显著延长具有CD8+T细胞应答的胰腺癌患者的生存期。UV1刺激广泛的CD4+和CD8+T产生针对hTERT的细胞应答。当与细胞因子-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）联合应用于晚期前列腺癌患者时，绝大多数患者在研究的9个月内病情稳定。另外FDA现已批准UV1与抗PD1疗法联合用于治疗晚期恶性黑色素瘤。INVAC1是一种基于DNA的疫苗，由编码与泛素融合的hTERT灭活形式的质粒组成。当其表达时，hTERT被蛋白酶体降解，使其抗原被呈递，并刺激免疫应答。在INVAC1的I期临床试验发现，该疫苗耐受性良好，可触发hTERT特异性CD4+和CD8+T细胞反应，并可阻止58%复发或难治性实体瘤患者的癌症进展。  

5.G4稳定配体

G4配体最初被认为通过抑制端粒酶与端粒DNA的结合而成为端粒酶活性的负调节因子。与这一理论相一致，通过POT1解开端粒G4s对于正常的端粒酶加工和防止端粒酶停滞是必要的。目前，已经开发了许多G4稳定配体，包括端粒抑素、TMPyP4、RHPS4和吡咯他汀，这些配体在抑制端粒酶结合和加工的能力上有很大差异。

图4. 端粒酶介导的端粒延长及抑制这一过程的治疗方法

针对ALT途径的治疗策略

由于ALT中的相关因素对正常的DNA复制和修复也至关重要，因此许多ALT阳性癌症的药物治疗都集中在寻找药物靶点上，这些靶点一旦被抑制，就会对ALT阳性癌症产生选择性毒性。许多研究还观察到ALT激活可以作为长期抗端粒酶治疗后的耐药机制，这意味着端粒酶阳性肿瘤患者在复发后可能需要ALT靶向治疗。目前尚不清楚这种耐药机制是来源于端粒酶抑制导致ALT的激活，还是来源于使用ALT的癌细胞亚群的选择性扩增。目前针对ALT存在以下几种治疗途径：

1.调整疗法途径

PARP1是ADP核糖转移酶PARP家族的成员，是DNA损伤的最早反应者之一，作为单链断裂和DSBs的传感器和修复蛋白。PARP1消耗NAD+将ADP核糖链添加到自身以及受损部位的组蛋白上，这些组蛋白作为招募DNA修复蛋白的平台。PARP抑制剂在HR缺乏型癌症中具有特别的效用，例如BRCA1或BRCA2突变的乳腺癌和卵巢癌。在这些癌症类型中，PARP抑制剂将PARP结合并捕获到DNA上，阻断复制叉进展并导致DNA损伤。临床前研究表明，在ALT阳性的癌细胞中，PARP抑制剂导致TRF2与端粒分离，从而刺激不适当的非同源末端连接修复,这导致小鼠致死性端粒融合，并导致ALT阳性颅内星形细胞瘤的凋亡和生长受损。几种PARP抑制剂目前已被FDA批准用于治疗HR缺陷型乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和转移性前列腺癌。

2.复制应激调节剂

ALT阳性细胞具有特征性的高水平端粒特异性复制应激，使ALT介导的HDR途径永久化。ALT阳性细胞的端粒复制应激水平得到了很好的平衡，以实现端粒长度和细胞生存能力的维持。靶向阻止复制应激的蛋白质或复制应激反应途径的成分有可能造成端粒DNA损伤，并对ALT阳性癌症类型提供选择性毒性。这种方法的主要优点是对端粒应激诱导的快速细胞毒性反应，可最大限度地减少适应性反应和耐药机制的出现。  

3.潜在的新治疗靶点

ALT机制的特征导致了ALT过程中涉及因素数量的增加。这些因素中有部分因素是无用的，而抑制其他因素会严重损害ALT的机制或触发使用ALT的细胞死亡。因此，在这种情况下，靶点发现包括区分多余因素和真正的治疗靶点，以及评估靶点的成药性。虽然目前发现的一些途径还没有可靠的抑制剂，但可以作为未来ALT癌症靶向治疗研究的新方向。

结论和展望

在过去几十年中，端粒酶抑制剂一直是人们关注和投资的焦点，而ALT阳性癌症一直被忽视。现在形势正在发生变化，ALT迅速成为公认的特定的临床分类，具有潜在的治疗针对性。据估计，ALT活跃于10-15%的癌症中，其在骨软组织肉瘤和中枢神经系统肿瘤的某些亚型中的患病率达到50%以上。由于ALT阳性的癌症类型通常具有侵袭性，对当前的治疗方案具有抵抗性，因此迫切需要能够诊断并有效治疗这一重要癌症群体的办法。

本文讨论了适用于ALT临床诊断的检测技术，并整理了端粒酶介导的和ALT介导的端粒延长途径阻断剂作为癌症治疗药物的研究进展。尽管已经开发了许多有前途的端粒酶抑制剂，包括高活性hTERT疫苗和伊美司他，随着对ALT机制的理解日益加深，针对于ALT途径的抑制剂在治疗ALT阳性癌症中的作用越来越得到认可。目前，主要挑战是在细胞以及动物模型和临床实践中全面检测现有新方法疗效和TMM选择毒性。总之，未来将根据TMM状态识别和治疗不同肿瘤类型，而ALT靶向疗法为精准治疗相当比例的肿瘤类型提供了新思路。

编译：黄思铭；曹书梅

审校：张军；缪长虹

参考文献：

Gao J, Pickett HA. Targeting telomeres: advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies.Nat Rev Cancer. 2022;22(9):515-532. doi:10.1038/s41568-022-00490-1  

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