Nature | 背靠背，揭示METTL1-WDR4催化tRNA甲基化修饰的工作机制

RNAs的特异性、调节性的修饰，对于基因的正常表达起到重要作用1,2。其中，tRNA富含多种化学修饰，这些修饰会影响tRNA的功能以及结构稳定性3。7-甲基鸟苷（7-Methylguanosine, m7G）是tRNA第46位（m7G46）非常保守的修饰之一，m7G46可以提高tRNA的热稳定性，延缓其降解4。m7G46在哺乳动物细胞中由METTL1-WDR4复合物催化修饰，并且METTL1-WDR4功能的失调会导致脑发育畸形以及多种癌症5。因此，理解METTL1-WDR4如何相互作用以及如何催化tRNA的m7G具有非常重要的生理和病理学意义。

2023年1月4日，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的Yunsun Nam, 在Nature发表题为Structures and mechanisms of tRNA methylation by METTL1-WDR4的科研论文，文章中作者利用了晶体学和冷冻电镜技术，解析了多个复合物的结构，从而深入阐释了METTL1-WDR4甲基化修饰tRNA的工作机理。同期另一位来自波士顿儿童医院的Richard Gregory，也在Nature上发表题为Structural basis of regulated m7G tRNA modification by METTL1-WDR4的科研论文。由于两篇论文发表的METTL1-WDR4结构以及文章结论的相似性，本文主要Yunsun Nam的文章分析为主。

图1. METTL1-WDR4复合物的整体结构

作者首先利用晶体学的手段，解析了METTL1-WDR4复合物的结构，分辨率在2.45 Å（图1a,b）。通过结构分析作者发现，METTL1-WDR4之间主要依靠极性氨基酸之间的氢键相互作用进行结合（图1c,d），将相互作用界面的极性氨基酸进行突变（如METTL1的K143A），会大大降低METTL1-WDR4的催化活性（图1e）。作者尝试利用晶体学的手段解析METTL1-WDR4与底物S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）和S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine, SAH）的结构，但整个复合物无法结晶，最后作者只拿到了METTL1与SAM和SAH的结构，分辨率分别在2.25 Å和1.93 Å。图1f展示了METTL1与SAH的相互作用界面，将相互作用界面上的一些关键氨基酸进行突变，严重影响了METTL1的催化活性（图1g）。

图2. METTL1-WDR4-tRNA复合物三种不同状态的结构

作者接下来利用冷冻电镜的手段，解析了METTL1-WDR4-tRNA apo的结构（图2a），与SAM结合的结构（图2b），以及与SAH结合的结构（图2c），分辨率分别在3.72 Å、4.05 Å和3.53 Å。三个状态的结构整体上非常相似，但在SAH结合的结构中，tRNA的T-arm以及METTL1的catalytic loop，发生了一定的构象变化（图2d,e），并且METTL1的N端能够观察到更多的氨基酸序列（图2c）。

图3. METTL1-WDR4识别tRNA的结构机理

将结构进行比对作者发现，在SAH结合下，METTL1-WDR4与tRNA的结合界面更为广泛（图3a）。与核酸结合蛋白相互作用界面一致，METTL1-WDR4在与tRNA结合的界面主要为碱性氨基酸（图3b）。在三个结构中，蛋白质与RNA的结合涉及到tRNA核心的“肘部”区域，即D-loop和T-loop的交汇处（图3c）。图3d和e分别展示了WDR4以及METTL1与tRNA的相互作用界面，并对相互作用界面的一些关键位点进行突变，会影响整个复合物的甲基化tRNA的催化活性。值得注意的是，tRNA与METTL1-WDR4的结合主要依赖于外骨架的磷酸基团，而并不涉及到内部的碱基基团，这可能意味着，METTL1-WDR4识别不同序列的tRNA主要依赖其三维结构。

图4. tRNA与METTL1-WDR4活化位点的细节展示

前面提到，在SAH结合下，METTL1-WDR4与tRNA的结合界面更为广泛。在apo状态下，tRNA与METTL1的界面之间存在缝隙（图4a），而在结合了SAH的情况下，两者的结合更为紧密（图4b），并且甲基化位点G46伸入到METTL1的催化中心。将两种状态的tRNA结构进行对比（图4c），可以发现tRNA在anticodon arm处发生较大的构象变化。METTL1的R24伸入到tRNA中与A9和A21形成pi-pi相互作用来稳定这种构象变化（图4d,g）。而tRNA的G46附近，多个带负电的氨基酸，对于其甲基化修饰至关重要（图4e,g,h）。作者测量了，SAH与G46之间的距离为5.1 Å，意味着整个构象可能处于催化前的状态。最后，作者比较了不同的tRNA的甲基化活性，当tRNA的可变区包含有RGGUY的序列时，整体的甲基化效率较高（图4i）。

图5. METTL1的N端协调SAH与RNA的结合和蛋白质的构象变化

将Apo的结构与SAH结合的结构进行比对（图5a,b），可以看出在SAH结合的情况下，METTL1的N端密度更明显，可以在模型中搭建更多的氨基酸。结构显示，METTL1的N端插入在SAH和tRNA之间的隧道中（图5c），并且与周围存在大量的相互作用（图5d,e）。突变实验以及先前的生化实验都表明，METTL1的N端氨基酸的变化，会影响整个复合物的甲基化活性（图4g, 5f）。之前的研究表明，METTL1的S27是一个磷酸化位点，而在作者的结构中，S27位于SAH和tRNA之间（图5g），从空间上看，磷酸化后的S27可能会与tRNA形成位阻，为此作者通过S27E这个突变来模拟磷酸化修饰，结果显示会降低METTL1-WDR4的甲基化活性（图5h）。

图6. METTL1-WDR4甲基化修饰tRNA的工作模型

最后，作者提出了METTL1-WDR4甲基化修饰tRNA的工作模型。METTL1-WDR4复合物为tRNA的结合提供了对接位点。METTL1-WDR4与tRNA结合可以在没有辅助因子的情况下发生，METTL1也可以在没有tRNA的情况下与SAM或SAH结合。在apo状态下, catalytic loop与tRNA结合变得更加有序。WDR4的C端螺旋接近tRNA但保持灵活，而METTL1的N端则是无序的。当tRNA和SAH都被结合时，METTL1更加靠近tRNA——catalytic loop 向tRNA靠近，METTL1的N端变得有序，夹在RNA和SAH之间。而WDR4的C端螺旋附着在METTL1的N端，以稳定结合在一起的tRNA。同样的N端也支持tRNA的扭曲，以释放G46，从而实现甲基化反应的发生。

参考文献

1. Frye, M., Harada, B. T., Behm, M. & He, C. RNA modifications modulate gene expression during development. Science 361, 1346–1349 (2018).

2.Wiener, D. & Schwartz, S. The epitranscriptome beyond m6A. Nat. Rev. Genet. 22, 119–131 (2021).

3.Pan, T. Modifications and functional genomics of human transfer RNA. Cell Res. 28, 395–404 (2018).

4.Alexandrov, A., Martzen, M. R. & Phizicky, E. M. Two proteins that form a complex are required for 7-methylguanosine modification of yeast tRNA. RNA 8, 1253–1266 (2002).

5. Filonava, L., Torres, A. G. & Ribas de Pouplana, L. A novel cause for primordial dwarfism revealed: defective tRNA modification. Genome Biol. 16, 216 (2015).

供稿 | 李张强

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲