【论肿道麻】外泌体生成的机制、调控及在肿瘤治疗中的意义

外泌体是一种细胞间通讯的关键介质，在各种生理和病理过程中发挥着重要作用，尤其对肿瘤的发生、转移、免疫、耐药等多个环节均有重要作用。其生成过程涉及多种机制，而肿瘤细胞则会利用各种策略来调节外泌体的生成、组成和功能，以促进肿瘤进展。

最近，郑州大学第一附属医院张水军教授、杨静华教授及翟文龙教授团队在Molecular cancer上发表了题为《Exosome biogenesis: machinery, regulation, and therapeutic implications in cancer》的综述，全面总结了在外泌体的生成机制及其在肿瘤中的调节机制，强调了靶向外泌体生成是一种很有前途的肿瘤治疗策略。现介绍如下：

背景

外泌体是直径约30–150 nm的细胞外小泡，通过多泡体与质膜融合而分泌。过去10年中，外泌体研究领域发展迅速。外泌体含有多种物质，如蛋白质、脂质和核酸，包括信使RNA、非编码RNA和DNA。外泌体通过细胞之间功能性内容物的交换，在维持稳态和对抗压力方面发挥着重要作用。许多研究表明，外泌体参与多种促肿瘤活动，包括抗凋亡、转移、血管生成、免疫逃避和化疗抵抗。然而，外泌体生成的分子机制，特别是肿瘤细胞如何调控这些机制，尚未得到深入研究。

多泡体是由内吞作用产生的，在此过程中，多种机制介导质膜向内出芽和早期内体的形成。早期内体将各种内容物并入腔内囊泡以产生多泡体。成熟后，多泡体可以通过各种途径与其他细胞器动态通信，例如通过反式高尔基体网络释放和吸收囊泡，并与内质网、线粒体或吞噬体直接接触。最后成熟的多泡体要么与溶酶体融合降解，要么与质膜融合释放腔内囊泡，即所谓的外泌体（图1）。     

图1. 外泌体生成过程   

外泌体生成包括物质分选、多泡体的形成与成熟，多泡体的运输，多泡体与质膜融合四个过程。肿瘤细胞可以利用多种机制来调节外泌体生成，并改变外泌体的组成和功能，从而有利于释放促肿瘤外泌体。本文总结了外泌体生成机制以及其在肿瘤调节方面的最新进展，强调了外泌体生成在肿瘤治疗中的药理学靶向前景。 

多泡体的形成机制

多泡体的形成是外泌体生成的核心。膜出芽和腔内囊泡生成是多泡体形成的关键。最近，人们提出了多种机制来解释界膜的出芽和腔内囊泡的产生（图2），其中包括内体分选复合体（ESCRT）依赖性途径和非依赖性途径。     

图2. 多种机制调节腔内囊泡的形成

ESCRT依赖途径

ESCRT包括ESCRT-0、-I、-II、-Ⅲ亚复合体和ATP酶的VPS4蛋白。ESCRT-0通过其泛素结合域识别单泛素化或多泛素化的蛋白。随后招募ESCRT-I和-II，共同形成鞍形蛋白复合物，这对ESCRT-III组装很重要。VPS4蛋白水解ATP后，ESCRT-III亚基经过顺序聚合，并驱动膜变形和分裂，最终产生腔内囊泡。

ESCRT非依赖途径 

外泌体富含胆固醇、鞘脂、磷脂酰丝氨酸和神经酰胺，这些成分与膜脂筏类似。一些外泌体蛋白，如flotillins蛋白和caveolins蛋白，本身就是脂筏的重要组成部分。脂筏在蛋白质分选、膜曲率和囊泡出芽中发挥多种功能。越来越多的证据表明，脂筏的成分在ESCRT非依赖途径的腔内囊泡形成中具有关键功能。

中性鞘磷脂酶2（nSMase2）-神经酰胺途径是研究最多的ESCRT非依赖途径。nSMase2是将鞘磷脂转化为神经酰胺的关键酶。研究者通过荧光探针技术，使用中性鞘磷脂酶抑制剂，阻断nSMase2，降低nSMase2的表达，证明了nSMase2-神经酰胺途径可控制外泌体对多种物质的分选，如少突胶质细胞中的脂蛋白、神经元细胞中的朊蛋白、以及肿瘤细胞中的几种RNA。然而，nSMase2-神经酰胺途径介导的腔内囊泡形成的确切机制尚未明确阐明。   总之，多种机制介导外泌体的形成，其中大多数机制尚未完全了解。ESCRT依赖或非依赖途径可以在同一多泡体上发挥作用，因此在单个多泡体内可产生富含不同物质的不同腔内囊泡群。因此，依赖ESCRT和非依赖ESCRT的途径不是互斥的，而是在一定程度上存在交叉，取决于细胞类型、物质和细胞环境。 

多泡体的物质分选 

多泡体的物质分选对外泌体分泌功能来说是不可或缺的。除脂质外，外泌体还含有多种蛋白质和核酸，包括mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA和DNA。根据源细胞的状态，外泌体内容物会动态变化并决定外泌体的功能特性。因此，物质的分选并形成外泌体具有高度选择性，并受到严格监管。   蛋白质可以通过多种途径分选为外泌体，许多蛋白质通过直接与ESCRT依赖或ESCRT非依赖途径相互作用而被分选为多泡体，如前所述，一些细胞质蛋白也可以选择性地分选成外泌体。

含有序列特异性RNA结合结构域的RNA结合蛋白（RBP）在RNA的外泌体分选中具有关键功能。许多RNA结合蛋白如hnRNPA2B1、hnRNPK、YBX1、MVP、MEX3C、SYNCRIP、Ago2和FMR1都参与不同细胞模型中miRNA的外泌体分选。lncRNA，hnRNPA2B1和hnRNPA1在lncARSR、LNMAT2和ELNAT1的外泌体负载中也发挥重要作用。然而，许多RNA结合蛋白如hnRNPA2B1和hnRNPK主要位于细胞核内，它们如何被转移到细胞质中并分选成多泡体尚待证实。

DNA分子的外泌体分选存在相互矛盾的结论，Jeppesen等人表明，DNA和组蛋白的细胞外分泌是由外泌体非依赖机制介导的。相反，Takahashi等人和Torralba等人发现gDNA和一些核蛋白被分选成外泌体。在卵巢肿瘤等肿瘤细胞中，含有gDNA和核蛋白的微核与CD63等四次跨膜蛋白相互作用，通过CD63将其分选为外泌体（图1）。

多泡体的成熟和转归    

多泡体是通过电子显微镜观察到的形态来定义的，其特征是含有腔内囊泡。多泡体的成熟是一个复杂的过程，在此过程中，多泡体彼此融合或与其他细胞器通信（图1）。在特定条件下，自噬体与多泡体融合形成自噬内涵体，这是一种特殊的成熟多泡体。类似地，自噬内涵体既可以与溶酶体融合降解，也可以与质膜融合以分泌外泌体。另一种被称为回收内体的特殊多泡体被认为存在于多种肿瘤细胞中。因此，根据其起源、成熟状态或路线，多泡体具有高度异质性。  

通过与溶酶体融合而降解的多泡体被称为降解多泡体；与质膜融合的多泡体是分泌性多泡体。Rab7蛋白的活性被认为是决定多泡体转归的关键（图3）。Arl8b/SKIP/HOPS级联激活GAP TBC1D15，以灭活并从多泡体中去除Rab7蛋白。通过驱动蛋白马达的作用，多泡体随后向正端或细胞外周移动。多泡体的转归受到多种机制的调控，抑制溶酶体功能或自噬可促进外泌体分泌，而无活性Rab7蛋白则有助于多泡体的形成。   

图3. 调控多泡体运输和转归的机制 

多泡体的运输

在分泌型多泡体成熟后，几种机制依次或同时作用控制其顺行转运、对接以及与质膜的融合（图3）。

Rab GTP酶在人类中包含约70个成员，Rab蛋白对于外泌体的生成至关重要，不同的Rab蛋白负责特定细胞类型中不同物质的分选或多泡体的分泌。许多Rab蛋白被认为可以调节外泌体的生成，包括Rab2b、Rab9a、Rab5a、Rab27a和Rab27b，但不包括Rab7、Rab11a和其他Rab。Rab27a/b及其上游调控元件和下游效应器在外泌体生成中起着重要作用（图4）。Rab27a及其效应子Slp4在多泡体与质膜上的对接中发挥作用，Rab27b及其效应子Slac2b介导多泡体从核周区域转移到细胞外周。用抑制剂BHMPS破坏Rab27a和Slp4之间的相互作用，能够减少外泌体分泌，抑制了乳腺肿瘤细胞的生长。

通过对来自小鼠少突胶质细胞的纯化外泌体进行蛋白质组筛选，Hsu等人提出多泡体与质膜的对接是由Rab35蛋白介导，它能够促进外泌体分泌，其功能可被TBC1D10A-C和Rab35的 GTP酶活化蛋白抑制。Rab11及其效应子Munc13-4介导MDA-MB-231细胞中循环内体与多泡体的融合，从而促进多泡体的易位和MT1-MMP的外泌体分泌，这对肿瘤转移至关重要。

图4. 伪足形成、肌动蛋白重组和多泡体分泌之间的关系

伪足形成、肌动蛋白重组和多泡体分泌

伪足是肿瘤细胞上的突起，有助于肿瘤细胞的侵袭和扩散。伪足是多泡体的特异性和关键性对接和分泌位点，破坏伪足的形成可抑制蛋白酶如MT1-MMP的外泌体分泌。反过来，多泡体的分泌也在伪足的形成中起作用。肌动蛋白重组与伪足的形成高度协调，Arp2/3复合物在肌动蛋白重组中起关键作用。通过将Arp2/3连接到肌动蛋白丝上，皮层蛋白介导伪足体内的多泡体对接和外泌体分泌，由Rab27a和Coroni1b协同控制。伪足形成、肌动蛋白重组和多泡体分泌是高度组织化的。然而，是否所有多泡体都是在伪足体内分泌的，或者是否有其他因素决定了膜上外泌体释放的位置，目前尚不清楚。

肿瘤外泌体生成的调控   

外泌体能够促进肿瘤细胞应对压力、产生化学耐药性和逃避免疫监视的能力，进而促进肿瘤细胞生存和转移。此外，外泌体被认为参与肿瘤细胞代谢废物或肿瘤抑制因子的主动外排，以维持细胞稳态。为了实现外泌体的促瘤作用，肿瘤细胞利用各种机制来调节外泌体生成的机制（图5）。更好地理解这些机制将有助于揭示肿瘤治疗的新靶点或方法。  

图5. 介导肿瘤中外泌体生成发生失调的机制

异常表达

外泌体通过在肿瘤细胞中生成机制的异常表达，直接调节其数量、组成和功能，而调控此类机制的分子正是肿瘤基因或肿瘤抑制因子（表1)。对于ESCRT依赖途径， Hrs基因促进SCC61 HNSCC细胞中的伪足形成和细胞侵袭；Hsp90基因在肿瘤中广泛激活，促进Rab22a-NoF1融合蛋白的外泌体分泌，从而促进骨肉瘤细胞和其他几种肿瘤的转移。相反， Vps4A作为肿瘤抑制因子，抑制肝肿瘤细胞的增殖和转移。在Syndecan-Syntenin-Alix依赖途径中，Syntenin、SRC、heparinase和Ral作为肿瘤基因，通过其在外泌体生成中的功能促进肿瘤进展和转移。对于ESCRT非依赖性途径，caveolin-1、flotillins和Rab31在肿瘤中普遍过度表达，并通过其控制外泌体分泌的功能促进肿瘤进展和化疗耐药性。几种RNA结合蛋白，如hnRNPA2B1、hnRNPK、hnRNPA1、MVP和hnRNPH1，通过直接或间接调节多种肿瘤中的外泌体生成，有助于肿瘤进展、转移和免疫抑制。多泡体转运和与质膜融合的机制也可以被肿瘤利用。

表1. 调节外泌体生物发生的基因及其在癌症中的作用

肿瘤微环境

缺氧、细胞外pH降低和高浓度乳酸是肿瘤微环境的共同特征，对肿瘤细胞存活、转移、免疫逃避和化疗耐药至关重要。这些特征调节肿瘤细胞和肿瘤微环境内其他细胞类型中的外泌体生成，从而有利于肿瘤进展。

缺氧调节各种肿瘤中外泌体的分泌、组成和功能。缺氧通过上调Rab27a和减少Rab7、LAMP1/2和NEU-1来增加外泌体释放，从而促进卵巢肿瘤细胞体外和体内的细胞迁移/侵袭和化学耐药性。此外，由缺氧诱导的氧化ATM磷酸化BNIP3和ATP6V1G1，这两者都有助于肿瘤相关成纤维细胞（CAF）中的自噬相关外泌体释放。缺氧诱导因子1（HIF1）被认为有助于外泌体的产生，但其潜在机制仍不清楚。

低pH值可促进含有caveolin-1的外泌体分泌，而caveolin-1与黑色素瘤和HCC的进展有关，此外，细胞外酸化可促进伪足的形成，从而增强外泌体分泌和癌症转移。

肿瘤细胞产生的细胞外乳酸促进肿瘤相关巨噬细胞分泌含有HIF-1α稳定非编码长RNA的外泌体，这些外泌体被乳腺肿瘤细胞吸收以增强有氧糖酵解和凋亡抵抗。敲减TAM中的Rab27可抑制外泌体分泌并消除TAM对肿瘤细胞的影响。细胞外乳酸促进了巨噬细胞HMGB1的乳酸化修饰和外泌体释放。因此，研究乳酸是否以及如何在外泌体分泌和肿瘤进展中具有的更普遍的功能是具有前景的。 

信号通路 

几种信号通路的异常激活通过调节外泌体的产生和组成在肿瘤进展中发挥作用（图6）。  

图6. 信号通路的异常激活调节肿瘤中的外泌体分泌  

Ca2+在由各种刺激引起的细胞质中有助于介导外泌体生成的多种蛋白质的活性和功能，例如ESCRT，Alix-LBPA相互作用，nSMase2，Munc13-4和Syt7（图6A）。

Ras/Raf/MEK/ERK信号通路：RAS是最常发生突变的肿瘤基因之一。结直肠肿瘤细胞中KRAS促进了含有EGFR、SRC家族激酶和整合素的外泌体的分泌，从而促进受体细胞的侵袭性。RAS/RAF/MEK/ERK途径可促进hnRNP H1的转录，后者通过上调前列腺肿瘤细胞中Hrs、ALIX和Rab27a的表达促进外泌体生成。hnRNP H1通过介导A-Raf的选择性剪接来增强Ras信号的激活，这意味着Ras信号和hnRNP H1之间存在正反馈环路（图6B）。RAS信号直接调控多种物质进入外泌体的分选，但KRAS如何促进特定miRNA分泌仍然是未知的。KRAS可在源自结肠肿瘤和胰腺导管腺瘤细胞的外泌体中检测到，氧化应激可通过自噬依赖途径增强其外泌体分泌。异常的RAS信号可以通过外泌体转移到其他细胞，并进一步改变受体细胞中的外泌体生成。

高谷氨酰胺消耗是肿瘤代谢的标志，在肿瘤进展中起着重要作用。钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2介导细胞外谷氨酰胺进入细胞，细胞内谷氨酰胺分解转化为谷氨酸和其他代谢产物。胞内谷氨酸通过胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白系统Xc-输出到细胞外。与受体代谢型谷氨酸受体3结合后，细胞外谷氨酸激活mGlu3以促进Rab27依赖性外泌体释放（图6C）。但谷氨酸信号如何激活Rab27依赖性途径，以及除Rab27之外的其他机制是否参与谷氨酸信号介导的外泌体生成尚不明确。总之，外泌体可以调控肿瘤中的代谢，反过来，肿瘤代谢可以调节外泌体的生成和组成。   STAT3通路在肿瘤中异常激活，是肿瘤治疗的潜在靶点。通过调节外泌体生成，STAT3/PKM2/SNAP23通路的激活有助于肿瘤恶病质的发展。

GPCR不仅可以分泌到外泌体中，还可以调节外泌体的生成。例如，组胺H1受体是被组胺激活的GPCR。H1HR–Gαq–PKC途径的激活使SNAP23磷酸化，并促进HeLa细胞中外泌体的产生。  

突变型p53通过控制外泌体足细胞标记蛋白水平和增加Hsp90α的外泌体分泌，调节肿瘤微环境以增强肿瘤侵袭性。除了在自噬中的功能外，mTOR信号传导也参与外泌体的产生。

microRNA  

几种microRNA通过负调节靶基因的表达，在外泌体生成中发挥作用（表2）。YKT6是miR-134和miR-135b的靶点，miR-134与miR-135b的过度表达减少了非小细胞肺癌中的外泌体释放。通过直接靶向SNAP23，let-7a调节外泌体分泌，并在结直肠肿瘤中作为肿瘤抑制剂发挥作用。然而，这些靶基因在外泌体生成中的确切功能尚不清楚。  

表2. 调节外泌体生物发生的因素

lncRNA 

lncRNA在多泡体的运输中具有重要功能，能够调节靶蛋白的转录或定位（表2）。例如，肿瘤抑制剂lncRNA-APC1与Rab5b mRNA相互作用并降低mRNA稳定性。通过下调Rab5b，lncRNAAPC1抑制促肿瘤外泌体的产生和结直肠肿瘤的进展。lncRNA HOX转录反义RNA作为癌基因促进肝肿瘤细胞外泌体分泌。HOTAIR调节Rab35的表达，并促进VAMP3和SNAP23的共定位，以促进多泡体质膜融合。LINC00511通过调节VAMP7和SNAP23的共定位，诱导了肝肿瘤细胞中伪足的形成，并促进了多泡体与质膜的融合和外泌体的分泌。

转录后修饰

转录后修饰的失调在各种肿瘤的进展中至关重要。除了Syntenin、SNAP23和Ago2的磷酸化外，转录后修饰的失调表现为通过调节外泌体生成机制的关键因素来调节外泌体的数量和组成（表2）。例如，O-GlcNA包合转移酶的下调减少了SNAP-23的O-GlcNAc修饰，从而促进由SNAP-23、VAMP8和Syntaxin-4组成的SNARE复合物的形成，并最终促进卵巢肿瘤细胞中的外泌体生成。此外，GlcNAc修饰可以影响外泌体在其他肿瘤中的功能。

治疗意义 

如前所述，介导外泌体生成的各种机制在肿瘤进展中发生失调。因此，靶向外泌体生成调控是一种很有前途的肿瘤治疗策略。重要的是，药理学上的外泌体靶向生成已被证明在肿瘤治疗中是有益的（表3）。  

表3. 调节肿瘤细胞中外泌体生成的潜在因子

nSMase2-神经酰胺途径对于ESCRT非依赖的外泌体生成至关重要。GW4869是第一个报道的nSMase2非竞争性抑制剂。GW4869可抑制乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和黑色素瘤等肿瘤细胞中程序性死亡配体1（PD-L1）的外泌体分泌，从而提高抗PD-L1疗法的敏感性。肿瘤相关成纤维细胞通过nSMase2-神经酰胺依赖途径分泌含有miR-21、miR-181a、miR-221、miR-222和miR-92a的外泌体。GW4869可以抑制这些外泌体的分泌，然而，GW4869并不适合进一步的临床开发，因为其溶解度和抑制效力低下。

Syntenin作为肿瘤基因，在由Syndecan Syntenin-Alix途径介导的外泌体生成中发挥着核心作用，Leblanc等人筛选了PDZ靶向化合物库，并通过结构优化，开发了一种新型抑制剂SyntOFF。SyntOFF减少了乳腺肿瘤的增殖和转移，并减少了含有c-Src和EpCAM的外泌体的分泌，这些外泌体对肿瘤进展至关重要。PLD2是外泌体生成的Syndecan-Syntenin-Alix途径的调节因子，在几种肿瘤类型中广泛表达。Halopemide是一种非特异性PLD2抑制剂，它可以减少前列腺肿瘤细胞来源的外泌体分泌，并使这些外泌体丧失能力，以刺激成骨细胞的增殖和矿化。由于骨硬化行为是骨转移的特征，有人提出，靶向PLD2可以预防或延缓前列腺肿瘤的骨转移。

胆固醇是几种肿瘤中腔内囊泡形成和外泌体分泌所必需的。他汀类药物是HMG-CoA还原酶的抑制剂，广泛用于高胆固醇的临床治疗。Kulshreshtha等人报道，辛伐他汀减少了几种巨噬细胞和上皮细胞的外泌体分泌。相比之下，阿托伐他汀不影响间充质干细胞分泌的外泌体形态和数量。

Ras信号通路在各种肿瘤中经常发生突变和激活。Ras的法尼基化在其膜定位和信号转导中发挥重要作用。Manumycin A是一种天然抗生素，是一种法尼基转移酶的选择性抑制剂。通过抑制Ras的法尼基化，Manumycin A抑制Ras/Raf/ERK1/2信号传导，并减少去势抗性前列腺肿瘤中外泌体的产生。

总结

当前的临床研究已经揭示了许多外泌体靶向化合物的治疗潜力，但仍需要进一步的研究，评估其临床价值和副作用。外泌体靶向化合物与其他抗肿瘤药物（如抗PD-1/PD-L1或化疗药物）的联合使用是肿瘤治疗的潜在策略，利用外泌体在肿瘤微环境中的功能，作为肿瘤治疗的药物递送系统。迄今为止，多种细胞类型，如中性粒细胞、树突状细胞、间充质干细胞、HEK-293 T细胞，甚至肿瘤细胞，已被用于获得所需的外泌体。但外泌体的低产量仍是其治疗实施的主要障碍。因此，调节外泌体生成机制，精确增加在合适细胞类型中具有所需功能的外泌体产量，将是临床应用中具有广阔前景的重要研究方向。

编译：徐晴，吴星     审校：张军；缪长虹  

参考文献： Han Q F, Li W J, Hu K S, et al. Exosome biogenesis: machinery, regulation, and therapeutic implications in cancer[J]. Molecular Cancer, 2022, 21(1): 1-26.   

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