快报 | rpoB突变与结核分枝杆菌中不同水平的利福平和利福布汀耐药相关

作者：李马超、王晓月、肖彤洋、林世强、刘海灿、钱城、许达、李桂莲、赵秀芹、刘志广、赵丽丽、万康林

作者单位：传染病预防控制国家重点实验室、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所（李马超、王晓月、刘海灿、许达、李桂莲、赵秀芹、刘志广、赵丽丽、万康林）；中山大学附属第五医院（肖彤洋）；福建农林大学生命科学学院（林世强）；北京市疾病预防控制中心（钱城）

通信作者：赵丽丽和万康林

注 王晓月和肖彤洋与李马超对本研究具有同等贡献，为并列第一作者

rpoB Mutations are Associated with Variable Levels of Rifampin and Rifabutin Resistance in Mycobacterium tuberculosis.

Li MC, Wang XY, Xiao TY, Lin SQ, Liu HC, Qian C, Xu D, Li GL, Zhao XQ, Liu ZG, Zhao LL, Wan KL.

Infect Drug Resist，2022，15：6853-6861.

doi: 10.2147/IDR.S386863.

PMID: 36465812. 

近期，Infection and Drug Resistance杂志刊登了中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中山大学附属第五医院、福建农林大学和北京市疾病预防控制中心等单位合作开展的研究成果rpoB Mutations are Associated with Variable Levels of Rifampin and Rifabutin Resistance in Mycobacterium tuberculosis (https://doi.org/10.2147/IDR.S386863）。研究显示，S450L、H445D、H445Y和H445R突变与利福平和利福布汀耐药相关。其中，S450L、H445D和H445Y突变与高水平的利福平和利福布汀最低抑菌浓度（MIC）相关；而H445R突变仅与高水平利福平MIC相关；D435V和L452P突变仅与利福平相关，与利福布汀耐药无关；Q432K和Q432L突变与高水平利福布汀MIC相关。一些与利福霉素耐药性无统计学关联的点突变，如V170F，仅发生在低水平耐利福平、高水平耐利福布汀的分离株中。此外，尽管对利福平和利福布汀的交叉耐药性很常见，但已鉴定出21株利福平耐药/利福布汀敏感菌株。本研究凸显了利福霉素耐药的复杂性。rpoB基因多态性的鉴定将有助于那些因治疗方案调整而获益的耐利福平结核病的诊断。中国疾病预防控制中心传染病预防控制所的李马超副研究员、王晓月和中山大学附属第五医院的肖彤洋为文章的第一作者，赵丽丽研究员和万康林研究员为论文的通信作者。

研究背景

结核病在全球范围内仍然是一个主要的公共卫生威胁。耐药结核病，特别是耐利福平结核病(RR-TB)的惊人增长是控制结核病蔓延的主要挑战。2021年，全世界估计有45万例RR-TB。RR-TB的治疗需要长期使用效率较低、毒性更大的药物组合。

利福平是结核病治疗的主要药物之一，是检测耐多药结核病(MDR-TB)的标志；利福平与利福布汀同属于利福霉素家族，这两种药物的作用靶点由rpoB基因编码。利福布汀被推荐用于HIV合并结核感染患者的抗结核治疗，因为在接受抗逆转录病毒治疗中，利福布汀比利福平更不容易发生药物间的相互作用。然而，关于利福布汀成功治疗耐多药结核病患者的报告非常有限，即使是在体外对利福布汀敏感分离株的患者中也是如此。一个可能的原因在于，由于利福霉素之间潜在的交叉耐药性，利福布汀治疗耐多药结核病的临床疗效尚未得到充分的证实。

位于结核分枝杆菌rpoB基因上利福平耐药决定区的某些突变与利福平和 利福布汀的交叉耐药有关。一些突变，如S450L、H445Y和H445D，在利福平和利福布汀交叉耐药株中较为常见。尽管对利福平和利福布汀的交叉耐药现象很常见，但一些携带特定rpoB突变的利福平耐药菌株在体外实验中可能仍然对利福布汀敏感。因此，利福布汀在临床上仍然具备治疗利福平耐药结核病的潜能。

有研究发现，具有某些特异性rpoB突变的菌株对利福平耐药而对利福布汀敏感。研究同时也指出了利福布汀在这些具有rpoB多态性病例中的潜在用途及与表型药物敏感性试验（简称“药敏试验”）数据的相关性。然而，目前的研究大多集中在rpoB基因上利福平耐药决定区的突变分析。此外，在对利福霉素类药物敏感的菌株中也检测到一些rpoB突变。因此，深入研究rpoB突变特征及其与不同利福霉素类药物耐药水平之间的相关性，可对临床上治疗耐利福平结核病、甚至耐多药结核病产生一定的帮助。

材料方法

本研究对分离自中国9个省份的177株结核分枝杆菌临床株，采用体外96孔微孔板法测定其对利福平和利福布汀的最小抑菌浓度（MIC），结核分枝杆菌(ATCC27294)作为质量控制。

收集L-J斜面上的所有菌株，95 ℃加热灭活20 min，离心收集含基因组DNA的上清液作为模板。扩增每株分离株的整个rpoB基因，扩增产物经过采用ABI 3730XL DNA分析仪进行测序，测序结果使用BioEdit（v7.05.3）软件与H37Rv参考基因组 (GenBank登录号NC_000962) 进行比对。

采用SAS 9.3 (SAS Institute, Cary, USA) 软件进行数据的统计分析。采用回归多因素模型评价rpoB全基因突变对利福平和利福布汀等两种药物MIC变化的影响，以P＜0.05为差异有统计学意义。

研究结果

1.MIC结果：177株分离株中，106株 (59.9%) 对利福平和利福布汀耐药，21株 (11.9%) 对利福平耐药而对利福布汀敏感，50株 (28.2%) 对利福平和利福布汀敏感。将所有耐利福平菌株分为低水平耐药组 (MIC为1～64 µg/ml) 和高水平耐药组 (MIC≥128 µg/ml)。127株耐利福平菌株中，低水平耐药组为38株 (29.9%)，高水平耐药组89株 (70.1%)。相应的全部耐利福布汀菌株中，63株 (59.4%) 被划分为高水平组 (MIC≥8 µg/ml)、43株 (40.6%) 被划分为低水平组 (MIC为1～4 µg/ml) 组。

2.rpoB基因突变：DNA测序结果显示，120株分离株的rpoB基因中有至少1个非同义突变，其中96株 (80.0%) 为单突变，24株 (20.0%) 为多突变。值得注意的是，有2株分离株同时携带错义突变和缺失突变 (表1)。在所有的突变中，在19个不同位点上检测到38种突变模式，包括利福平耐药决定区内存在的28种突变模式、利福平耐药决定区外存在的10种突变模式。450、445和435密码子突变频率最高，分别为46.7% (56/120)、27.5% (33/120)和17.5% (21/120)。在密码子45、170、400、429、430、431、432、441、446、452、460、488、491、759和1056位点也出现了突变，总突变频率仅为28.3% (34/120)。在这34株分离株中，21株 (61.8%，21/34) 合并了435、445或450位突变。值得注意的是，位于利福平耐药决定区外的一个单突变V170F发生在一个同时耐利福平和利福布汀的分离株中。在rpoB中还发现了2个新的缺失，D435del (核苷酸1303～1305缺失) 和F433-D435del (核苷酸1296～1304缺失)。

表1     rpoB   突变的分布以及利福平和利福布汀MIC值

3.rpoB突变与耐药表型的相关性：大多数rpoB突变发生在耐利福平和耐利福布汀的分离株中。仅检测到1株利福平敏感株 (MIC为0.5 µg/ml) 和19株利福布汀敏感株 (MIC≤0.5 µg/ml) 携带rpoB突变 (表1)。

由于20.0%的rpoB突变株中含有1个以上的突变，通过多元回归评价突变与耐药性之间的相关性（表2）。分析结果显示，S450L、H445D、H445Y和H445R与利福平和利福布汀的耐药均显著相关 (P值均<0.05)；其中对于利福平来说，OR值分别为226.69、45.99、37.39和15.89；对于利福布汀，OR值分别为425.87、86.16、70.06和17.98 (表2)。值得注意的是，D435V (OR=37.39) 和L452P (OR=11.59) 突变仅与利福平耐药相关 (P值均<0.05)，而与利福布汀耐药无关；Q432K(OR=13.75)、Q432L (OR=13.75) 和L430P (OR=15.99) 突变仅与利福布汀耐药相关 (P值均<0.05)，而与利福平耐药无关；除利福平耐药决定区内的突变外，其他突变均与耐药性无关。此外，仍有8株利福平耐药株和5株利福布汀耐药株在rpoB基因中未发现突变。

表2 rpoB突变与耐药性之间的logistic回归多变量模型分析

4.rpoB突变与高水平MIC的关系：高MIC的分离株更易发生S450L、H445D和H445Y突变 (表1)。在发生这3种突变的分离株中，利福平高MIC的分离株中3种突变的发生比例分别为90.7% (49/54)、100.0% (11/11) 和8/9，而利福布汀高MIC的分离株中3种突变发生的比例分别为64.8 (35/54)、6/11和7/9。多因素分析显示，这3种突变与高水平的MIC均显著相关 (P值均<0.01)，其中对利福平的OR值分别为50.39、75.53、40.80，对利福布汀中的OR值分别为17.35、11.12、31.43 (表3)。此外，H445R突变 (OR=26.09) 与利福平高MIC显著相关 (P<0.01)，但与利福布汀高MIC无关。然而，Q432K (OR=20.46) 和Q432L (OR=20.46) 突变与利福布汀高MIC显著相关 (P<0.05)，而与利福平高MIC无关。

29株发生rpoB突变的利福平高MIC分离株，同时被划分为利福布汀低MIC组。而同时具有利福平低MIC、利福布汀高MIC分离株只有6株，其中4株的利福平MIC为64 µg/ml，非常接近利福平高MIC的折点值 (128 µg/ml)。有趣的是，V170F突变仅出现在两株利福布汀高MIC、利福平低MIC的分离株中。

图3  rpoB突变与高水平MIC间的logistic回归多变量模型分析

研究意义

快速准确地判定结核分枝杆菌的耐药性对于早期选择合理的抗结核治疗方案至关重要。尽管已存在多种分子诊断技术，如GeneXpert MTB/RIF(Cepheid Inc.,Sunnyvale,CA,USA)和MTBDRplus(HAIN Lifescience GmbH,Nehren,Germany)可直接从标本中快速识别结核分枝杆菌耐药，但这些分子诊断技术可能会错过靶区外突变的分离株，并且无法确定耐药水平。此外，以往的研究表明，根据表型药敏试验，部分携带rpoB突变的分离株对利福平敏感。rpoB突变的利福布汀易感菌株也存在类似问题，提示了利福布汀在治疗方案中的应用潜能。因此，了解rpoB突变与不同利福平和利福布汀耐药水平之间的关系至关重要。

虽然对利福平和利福布汀的交叉耐药现象很常见，但本研究中仍然发现21株分离株存在利福平和利福布汀之间耐药性不一致。以往的研究表明，对利福平耐药而对利福布汀敏感的菌株比例在13%～28%之间。本研究中，耐利福平/利福布汀敏感菌株的比例为16.5%(21/127)。在对携带这部分菌株的患者进行治疗过程中，用利福布汀替代利福平可能会产生较佳的效果。

已有研究证实，rpoB编码的RNA聚合酶β亚基是利福霉素类药物作用的靶点，该蛋白的某些氨基酸变化可导致利福霉素耐药性的发生。本研究中，93.7%(119/127)的利福平耐药株和95.3%(101/106)的利福布汀耐药株至少存在1个rpoB突变。总体而言，rpoB中有19个不同的密码子发生了导致氨基酸替换的突变，其中11个密码子位于利福平耐药决定区内，8个位于利福平耐药决定区外。有趣的是，几乎所有利福平耐药决定区外的突变都伴随着利福平耐药决定区内的突变。研究结果显示，利用利福平耐药决定区的DNA测序可快速预测利福平和利福布汀耐药性。与已经发表的研究结果类似，在本研究中也发现1株耐药分离株在利福平耐药决定区外发生单突变V170F。这说明了利福平和利福布汀耐药性发生的复杂性，并指出了研究利福平耐药决定区以外突变发生情况的必要性，特别是在患者治疗效果未达到预期的情况下。

本研究也揭示了与利福平和利福布汀相关的突变发生。统计分析表明，在38个不同的rpoB基因多态性中，S450L、H445D、H445Y和H445R与利福平和利福布汀耐药性均显著相关。Miotto等和Whitfield等也将这4种突变归类为利福平耐药和利福布汀耐药相关突变。

D435V和L452P突变仅与利福平耐药显著相关，而与利福布汀耐药不相关，这与之前的数据一致。携带这两种突变的分离株可能对利福布汀敏感，受益于含有利福布汀的治疗方案。此外，Q432K、Q432L和L430P仅对利福布汀有显著耐药性。虽然Whitfield等将L430P突变归类为利福布汀敏感突变，但在4株利福布汀耐药菌株中均发现该突变。其中，3株分离株均伴有另一种rpoB突变。有趣的是，一株具有双突变的菌株(L430P/H445N)被Whitfield归类为利福布汀敏感株，但药敏试验结果显示其MIC≥16µg/ml。因此，这种rpoB双突变模式对利福布汀耐药性的实际影响需进一步研究。

研究还发现450L、H445D和H445Y突变与高水平的利福平/利福布汀MIC密切相关，与以前的研究结果类似。此外，H445R突变与利福平高MIC相关，而Q432K和Q432L突变与利福布汀MIC水平升高相关。因此，本研究中增加了突变与利福霉素耐药水平之间相关性的重要数据。值得注意的是，V170F突变仅发生在2个利福布汀高MIC而利福平低MIC的分离株中。该突变在rpoB和利福布汀相互关系中的作用尚不清楚，需要进一步的研究。

本研究采用目前世界卫生组织推荐的临床临界点(0.5µg/ml)判定菌株的敏感性。然而，本研究中发现1株具备D435Y突变的利福平敏感株(MIC为0.5µg/ml)，该突变株在一些利福平敏感株中也曾发现。值得注意的是，当使用CLSI推荐的临床临界点(0.5µg/ml)用于利福布汀敏感性检测时，19株被判定为敏感的分离株中也发现了rpoB突变，其中9例的MIC为0.5µg/ml。尽管在这些菌株中出现的大多数突变被归类为利福布汀敏感突变，但一些研究认为，目前以0.5µg/ml作为判断折点可能过高。此外，还发现了一些缺乏rpoB突变的利福平/利福布汀耐药菌株，表明这些菌株的耐药可能归因于其他机制，如外排泵活性增强或细胞壁通透性降低等。

本研究也存在一些局限性。本研究中携带利福平耐药决定区以外突变的菌株数量较少，导致数据不足以进行进一步的分析。此外，我们只分析了整个rpoB基因的突变，其他基因的变化或其他机制在本研究中无法确定。

综上所述，本研究分析了结核分枝杆菌临床分离株中多种rpoB突变及其与利福平、利福布汀耐药水平的相关性。揭示了SNP特异性的利福霉素表型耐药差异将有可能优化利福布汀用于利福平耐药患者的治疗。但仍需要临床研究来验证利福布汀是否能有效地应用于这些患者以改善治疗结果。

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供稿：李马超

编辑：孟莉

审校：范永德

发布日期：2023-03-03