qPCR实验过程中的注意事项和解决方法

■ RNA浓度和纯度

RNA 具有连续的吸光谱，其在 260 nm 处具有最高吸收峰；蛋白在 280 nm 处有最大吸收峰；230 nm 处的吸光度可反映乙醇、GTC、GuHCl、EDTA 等的含量。因此，在 RNA 的质检参数中，260、280 和 230 nm 下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质及有机溶剂等的值。一般情况下，RNA 纯度检测时我们大都只看其在 OD260/OD280 比例中的数值范围，少量的蛋白、盐或基因组等污染我们是可以接受的。  

■ RNA完整度评估

mRNA 约占总 RNA 的 3%，rRNA 约占总 RNA 的 80% 以上。一般可通过凝胶电泳对 RNA (主要是 rRNA) 的完整性进行评估。那如何通过 RNA 的胶图分析这各种污染 “Bug” 呢？

以真核生物举例：完整的总 RNA 电泳后会产生 28S、18S、5.8S 的 rRNA 条带，28S 与 18S 的条带强度大致比例应为 2:1 (图 3a)。电泳条带 5.8S rRNA 出现则表示有轻微降解。RNA 本身就 “矫情”，得 “富养”~，因此在一般实验中，5.8S 条带出现很正常，但如果只有这一种条带且有明显弥散现象 (图 3b)，后续逆转录的话还是建议 “及时止损” 吧！  

若在 28S 以上出现多余的条带，还贼亮，gDNA 污染，无疑了 (图 3b)！若在点样孔中还有明亮亮的 “钉子户”，大概率的蛋白污染，可以“定罪了”。  

真核生物胶图的目的条带为 23S、16S 和 5S，质检方法参照以上即可。

图 3. RNA 凝胶电泳图。 a. 高质量 RNA；b. gDNA 残留；c. 蛋白残留；d. RNA 降解。

qPCR 这些操作你可长点心吧  

图 3. 标准扩增曲线 (a) 和溶解曲线 (b)

信息来源：Super lab

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题图 | veer.com

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