酵母表面展示技术筛选高亲和力TCR

前 言  

1988年Dr. Michael Steinmetz 在Nature中报道了将TCR基因从一个T细胞转移到另一个T细胞，使第二个T细胞具有相同的抗原特异性。这是目前TCR基因治疗的起源。用于TCR抗体药物和细胞治疗的TCR需要经过工程化改造才有能获得理想的特异性肿瘤杀伤效果和安全性。

TCR工程改造

工程化改造的主要目标有两方面。

第一，保障TCR α链和β链的正确配对。

由于TCR的异二聚体构成方式会导致T细胞自身TCR与外源转入的TCR存在α链和β链的错误配对。TCR发生错配不仅会降低功能性外源TCR在T细胞表面的水平，也可能会产生攻击自身抗原的风险。目前的解决策略（图4）可以使用siRNA下调T细胞自身TCR的表达，或者通过基因编辑技术敲除自身TCR；增加二硫键；TCR α链和β链恒定结构域的murinization；或在TCR αβ中使用TCR γδ结构域来改善TCR配对结合。

图1 通过TCR的改造以防止误配并最大限度地提高表面表达。[1]

第二，增加TCRs与pMHC的亲和力。

体内天然的TCRs虽然表现出与抗体相似的遗传和序列多样性，但TCRs的结合亲和力比抗体要低几个数量级。抗体通常以nM或pM范围内的KD值结合它们的同源抗原。而TCRs以低（微摩尔）的亲和力与peptide-MHC复合物（p-MHC）结合。这是由于T细胞在胸腺发育和成熟过程中没有体细胞突变和亲和力成熟的过程，并且TCR与同源抗原结合过强的T细胞被阴性选择消除，而结合过弱的T细胞则经细胞凋亡消除。这种编辑机制显著降低自身免疫性疾病的风险，但也限制了天然免疫系统识别TAA的能力，因为在大多数情况下，这些肽来源于在肿瘤中重新表达或过表达的自身蛋白。一般而言，TCR对作为“自身”抗原的癌症相关抗原的结合亲和力比TCR对非自身和微生物抗原的结合亲和力低约10倍左右。

T细胞的活化取决于TCR–pMHC的结合动力学，而TCR–pMHC的结合动力学又受肿瘤细胞或APC细胞膜上抗原密度的影响。尽管TCR亲和力与T细胞活性之间的相关性存在一些分歧，但选择高亲和力TCR或通过定向进化微调TCR的亲和力都是改善TCR-T抗肿瘤反应的技术手段。噬菌体展示系统或酵母表面展示系统已成功应用于TCR的亲和力成熟，定向进化后的TCR可实现皮摩尔范围内的亲和力[2,3]。

图2 增强肿瘤特异性TCR-T细胞的功能。Cells 2020, 9, 1720; doi:10.3390/cells9071720

通过TCR体外亲和力成熟过程，如酵母表面展示技术或替换TCR互补性决定区中的关键氨基酸，可以提高TCR-pMHC相互作用的亲和力，从而发挥TCR工程T细胞的抗肿瘤功能。与噬菌体展示方法相比，使用酵母表面展示TCR定向进化的一个主要优点是它能够直接评估在酵母细胞上表达的TCR或突变体的结合亲和力，而不需要经过大量的蛋白质表达和纯化步骤。下面详细介绍David M. Kranz团队是如何通过酵母表面展示技术来筛选高亲和力的TCR。

基于scFv形式的TCR设计

为了避免TCR的α链和β链的错配，并方便在酵母表面进行表达，通常使用多肽（即GSADDAKKDAAKKDGKS）连接TCR的α链和β链可变区，以scFv的形式展示（scTCR)在酵母表面。scFv的方向可以从Vβ-L-Vα或Vα-L-Vβ方向构建，pCT302载体含有一个半乳糖启动子和一个上游的HA标签，可以作为表达的检测探针使用。在C端的c-myc标签用来检测全长融合体的表达（图3）。

图3 酵母表面展示scTCR片段示意图[4]

从易错突变库中选择稳定的scTCRs克隆隆

由于scTCR片段缺乏稳定的恒定结构域，scTCR通常需要进行突变以产生稳定的形式，从而在酵母表面表达。通常情况下，产生的突变发生在α和β可变结构域的界面上，或暴露的可变区域。作者发现高度稳定的人Vα2区会加强scTCR在酵母表面的稳定，或将Vα2的49位氨基酸替换为丝氨酸替代，也可提高scTCR在酵母表面的稳定性。

1. 通过易错PCR获得scTCR随机突变片段，这种方法产生的错误率为0.5%。

2. 将突变后的scTCR片段与酶切后的pCT302载体以4：1的比例同时电转到EBY100酵母，并计算库容大小。

3. 通过引物PCR和电泳确定scTCR插入片段是否正确（对于典型的scTCRs，Splice4L和T7之间的区域大约为1.2Kb）。

4. 诱导表达后的酵母用构象特异性的抗原（可识别Vβ和/或Vα链上的表位）染色，结合使用C-myc特异性抗体来选择表达全长scTCR的构建体，通过MACS和FACS分选出稳定表达全长的scTCR突变体的酵母克隆。

图4 scTCR稳定表达酵母克隆获得流程图[4]

酵母表面展示scTCRs突变体和亲和力筛选

TCR亲和力提高的策略包括，通过定点突变的TCRs的亲和力成熟，以及通过使用单密码子库和深度测序对所产生的高亲和力TCRs的亲和力进行调控。 在获得稳定表达的scTCR突变体后，可以对CDR环进行定点突变，产生scTCR CDR定点突变库，通过MACS和FACS筛选出与pep-MHC结合亲和力更好的TCR。野生型TCR对p-MHC的亲和力很低（KD值在1-100μM的范围内），但通过酵母表面展示突变库结合FACS筛选，可以产生具有超过1000倍的结合亲和力的TCRs。

1 定点突变用于TCR的亲和力成熟

在TCR的Vα和Vβ中各有三个与p-MHC结合的互补性决定区（CDRs）。为了增加scFv与p-MHC配体的亲和力，可以在接触肽段的TCR的CDR环中产生定点突变库，以筛选出更高亲和力的突变体。并且这些CDR环识别的抗原位置是保守的，如来自TCR的种系编码区的区域（即特别是CDR2）识别定位在MHC螺旋上，而来自体细胞重排基因段的连接处的区域（即CDR3）主要识别定位多肽。由于CDR3环主要是识别肽段的，所以亲和力成熟的重点应放在CDR3环上。

2 通过SOE PCR对scFvs进行定点突变

对于稳定的scTCRs的亲和力成熟，通过重叠延伸（SOE）PCR对CDR环进行定点突变（图5）。在CDR环的选定位置上含有简并密码子的引物用于扩增scTCR突变片段。使用NNS或NNK核苷酸组成的简并密码子，其中N是任何核苷酸（A、T、C或G），S是G或C，K是G或T。

图5 通过重叠延伸(SOE)PCR定点CDR库的示意图[4]

通过SOE PCR可以对CDR环中最多5个密码子进行定点突变。针对每个文库，设计两种引物与标准化的Splize4L和T7一起使用：第一种是反向引物，用于和Splice4L正向引物一起扩增scFv的N-末端，直到简并密码子之前的重叠区域（即Pre-SOE #1）。第二种是正向引物，用于扩增基因的C-末端区域。这条引物包括第一条引物中使用的重叠序列的互补碱基，然后与T7反向引物一起使用。在扩增Pre-SOEs #1和#2之后，通过用Splice4L和T7引物扩增两个Pre-SOEs可以形成SOE产物，重叠区允许Pre-SOEs相互扩增，产生完整的scFv构建（图5）。

3 制备scTCR定点突变文库

3.1 将pCT302载体和SOE PCR产物同时电穿孔转入EBY100酵母细胞中，构建酵母表面展示scTCR定点突变文库。

3.2 计算库容大小。

3.3通过引物PCR和电泳确定scTCR插入片段是否正确。

3.4 诱导表达后的酵母细胞，通过抗HA和抗c-myc标签抗体染色，在流式细胞仪检测初始文库scTCR的展示水平。

4 p-MHC的选择

用于筛选的可溶性p-MHC配体有多种形式，包括p-MHC单体、免疫球蛋白连接的二聚体和链霉菌素连接的四聚体（图6）。多聚体的p-MHC配体，如基于免疫球蛋白的二聚体和基于链霉菌素的四聚体，能够通过亲和力效应，增加对弱scTCR：p-MHC相互作用的检测。对于筛选具有较高结合亲和力的scTCR，最好使用单体p-MHC，因为多价p-MHC试剂不易区分亲和力在中低纳摩尔范围内的平均荧光强度的变化。

图6 用于筛选scTCR的p-MHC配体形式[4]

5 筛选具有更好亲和力的scTCRs

首先，使用识别Vα或Vβ链构象表位的生物素化抗原和抗c-myc抗体做一轮MACS分选，排除库中的错误折叠和截断的scTCR克隆，富集表达全长的scTCR的酵母克隆。

之后，在文库筛选阶段，一般使用较高浓度的p-MHC进行1-2次MACS分选，经过1-2次MACS分选后，阳性群落被大量富集。下一步通过FACS进行更精细化的分选，即用低浓度的p-MHC进行分选，一般总共进行3-7次分选，最终分离出具有低纳摩尔亲和力的scTCRs。

图7 选择高亲和力scFv片段的方法实例示意图 [4]