攻克轻链错配问题！基于新型bsAb平台开发CD3双抗

对于双抗来说，研发过程中抗体链错配问题往往会导致双特异性抗体（bsAb）产业化效率低、杂质蛋白多。

因此，重链和轻链的正确配对，是当前双抗平台的核心关注点。防止重链错配的Knobs-into-Holes（KiH）专利已经过期，给药企提供了不错的选择，但是对于轻链错配的问题，CrossMab等技术还处于专利保护中，因此相关独家技术仍是各公司力争开发的方向。

利用异源二聚体代替CH1和CL是解决bsAb轻链问题的一类策略，药明生物WuXiBody就利用了TCR的恒定区（TCR的Cα-Cβ结构）置换CH1和CL。此外，还有恒瑞医药的HOT-Ig利用了Titin（肌联蛋白）和Obscurin(遮蔽蛋白)，启愈生物利用了IL15和IL15Ra等。

药明生物专利

本文将介绍Oliver Seifert等人提出的一种相似的设计思路——eIg平台。

eIg平台：利用IgE特殊的CH2

eIg平台利用IgE特殊的CH2（EHD2）进行改造形成异源二聚体（hetEHD2），替换了一侧Fab中的CH1和CL结构，以解决bsAb的轻链问题。

与IgG不同的是，IgE中的CH2（EHD2）通过1-2个二硫键共价连接，而且存在额外的N-糖基化位点。

图. IgE抗体结构（来源：wikimedia）

eIg平台在一条链（EHD2-1）中引入C102S突变（102位半胱氨酸突变为丝氨酸），在第二条链（EHD2-2）中引入C14S突变，破坏两条链间的一个二硫键。EHD2-2上还进行了N39Q突变，去除N-糖基化位点，以便更好地区分糖基化和非糖基化链。

图. hetEHD2结构域的生成。

（a）人IgE重链结构域2（EHD2）和异二聚化结构域（含有EHD2-2和EHD1-2的hetEHD2）序列的对比；（b）hetEHD2的修饰结构。

所获得的两个异源二聚化EHD2（hetEHD2）结构域可分别与可变区VL和VH进行融合，形成Fab样片段（eFab）。然后将这些eFab与天然Fab臂和Fc区域相结合来产生双特异性Ig样分子（eIgs）。

图. 使用hetEHD2生成不同的抗体结构

近日，Oliver Seifert团队基于eIg技术进一步生成了靶向EGFR/CD3双特异性T细胞接合剂（TCE），进一步对该平台的应用潜力进行了验证。

该研究生成了11种不同的双特异性TCE形式，分析了它们在抗原结合，细胞毒性和T细胞活化的活性，旨在确定影响这类双抗的结构因素。

11种结构中，包括了两个二价双特异性分子（1 + 1），一个包含Fc区，一个不含Fc区。所有其他分子都是三价双特异性的（2 + 1），具有两个EGFR的结合位点和一个CD3的结合位点。

图. 不同结构eIg分子（含Fc）的生化表征和结合特性，包括1 + 1 eIg和2 + 1 Fab-eIg变体

体外研究显示，相比于1 + 1双抗，2 + 1双抗与EGFR的二价结合，能引起亲合力（Avidity）驱动的癌细胞结合，从而帮助区分靶点高表达的癌细胞和低表达的正常细胞。

Fc区域的存在与否似乎对生物活性不太重要，因为所有无Fc的TCE在介导靶细胞杀伤方面表现出相似的效力，所有无Fc的TCE在杀死靶细胞方面都非常有效。但无Fc形式半衰期显著降低。

研究还观察到，CD3结合臂的分子组成和位置也影响靶细胞杀伤、细胞因子释放和T细胞增殖。靶抗原与CD3之间的较短距离将增加靶细胞杀伤，因为能够形成紧密的免疫突触。

图. 5种具有潜力的双抗形式

SUMMARY

小结

总体来说，eIg平台使用基因修饰IgE的CH2作为Fab促使异二聚化生成，以解决双特异性Ig样抗体的轻链问题。

eIg平台用到了异源二聚体代替CH1和CL的策略，也用到了二硫键改造技术。相关平台还有凡恩世PACbody 二硫键改造平台等。目前已开发出多种策略用于防止双特异抗体中的轻链设计，除了上述提到的平台外，还有三生国建的CLF2共同轻链平台，爱思迈ExMab电荷改造平台等。

参考资料：

1. The eIg technology to generate Ig-like bispecific antibodies. 网页链接

2. eIg-based bispecific T-cell engagers targeting EGFR: Format matters.网页链接