科研丨华中大: 共生皮肤微生物胞外囊泡通过重建皮肤稳态来减轻特应性皮炎小鼠模型中的皮肤炎症(国人佳作)

编译：好运的元一夏，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤疾病，与微生物失调有关。共生皮肤微生物在AD中的作用引起了极大的兴趣。胞外囊泡(EVs)是皮肤稳态和病理的重要调节因子。但通过共生皮肤细菌表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)胞外囊泡(SE-EVs)来预防AD发病机制尚不清楚。本文研究了共生皮肤细菌SE-EVs的作用。结果发现，SE-EVs通过脂磷壁酸能显著降低了炎性基因(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和iNOS)的表达，并增加了MC903处理的HaCaT细胞的增殖和迁移。此外，SE-EVs通过TLR2增加了MC903处理的HaCaT细胞中人β-防御素2和3的表达，从而抑制金黄色葡萄球菌的生长。再者，局部应用SE-EVs到MC903诱导的AD样皮炎小鼠上，能显著减少炎性细胞浸润(CD4+ T细胞和Gr1+细胞)、TH2细胞因子基因表达(IL-4、IL-13和TLSP)和IgE水平。有趣的是，SE-EVs诱导IL-17A+ CD8+ T细胞在表皮中积累，这可能代表异种保护。综上所述，本研究结果表明，SE-EVs减少了AD样小鼠的皮炎，可能是治疗AD的潜在生物活性纳米载体。  

论文ID

原名：Extracellular vesicles of commensal skin microbiota alleviate cutaneous inflammation in atopic dermatitis mouse model by reestablishing skin homeostasis

译名：共生皮肤微生物胞外囊泡通过重建皮肤稳态来减轻特应性皮炎小鼠模型中的皮肤炎症

期刊：Journal of Investigative Dermatology

IF：7.59

发表时间：2023.3.11

第一作者：周洪

通讯作者：刘卫

通讯作者单位：华中科技大学生命科学与技术学院

DOI号：10.1016/j.jid.2023.02.023

实验设计

结果

1. SE-EVs的表征

为了研究SE-EVs是否复制了S. epidermidis某些功能，我们收集了稳定期(补充图S1a) SE-EVs并进行了表征。如图1a-c所示，SE-EVs呈完整的、规则的球形结构，具有脂质膜。SE-EVs的粒径、PDI和Zeta电位分别为146.08 ± 1.47 nm、0.165 ± 0.021和-28.17 ± 0.85 mV(图1d和补充表S1)。SDS-PAGE蛋白质分析显示，SE-EVs具有至少八个主要的条带(25-70 kDa)，其中两个富集信号蛋白条带(Mw约43 kDa和55 kDa)(图1e)。

HaCaT细胞的形态学分析(补充图S1b)和HaCaT、HDF、SZ95和L929细胞的CCK-8试验(图1f-i)表明，SE-EVs无毒性。此外，SE-EVs促进了皮肤细胞的增殖(图1f-i)。值得注意的是，脂多糖(LPS)和SA-EVs(补充图S1c和d)诱导RAW264.7细胞和HaCaT细胞表达TNF-α、IL-1β和IL-6，而SE-EVs仅诱导RAW264.7细胞表达这些基因(图1j-l)，而不诱导HaCaT细胞表达(图1m-o)。在这些基因的蛋白水平上也得到了类似的结果(补充图S1e-j)。此外，SE-EVs以时间依赖性的方式在HaCaT细胞中诱导了人β-防御素2(hBD2)和3(hBD3)的表达(图1p和q)。这些结果表明，SE-EVs具有S. epidermidis的某些功能。

考虑到EVs的稳定性对机制研究至关重要，我们研究了在4°C、-20°C、-80°C和冻干条件下存储90天的SE-EVs与未经处理SE-EVs在物理和功能特性的变化。SE-EVs的物理特性，包括粒径、Zeta电位和蛋白质含量，在-20°C和-80°C存储时变化很小(图1r-t和补充图S1k)。尽管稍有降低，但SE-EVs的功能性质，如对HaCaT细胞的增殖促进和β-防御素诱导作用以及对RAW264.7细胞的促炎效应，在-20°C或-80°C存储时保持得最好(补充图S1l-p)。这些结果表明，将SE-EVs存储在-20°C可能是维持其稳定性的首选方法。

图1. SE-EVs的表征。

(a) SE-EVs的TEM图像。(b)在图a中部分放大的TEM图像。(c) DiI标记的SE-EVs的共聚焦图像。(d) DLS测量的SE-EVs尺寸分布图。(e) S. epidermidis、SE-EVs和溶解的SE-EVs的SDS-PAGE蛋白质谱。(f-i) SE-EVs与HaCaT、HDF、SZ95和L929细胞孵育24小时的细胞活性。(j-o) HaCaT细胞和RAW264.7细胞经PBS、SE-EVs、LPS或SA-EVs孵育24小时后，细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平。(p，q) HaCaT细胞经SE-EVs孵育24或48小时后，hBD2和hBD3的mRNA水平。(r-t) SE-EVs在4°C，-20°C，-80°C和冻干储存90天的稳定性，通过评估粒径、zeta电位和蛋白质含量来分析。  

2. SE-EVs减轻MC903诱导的AD样皮炎小鼠的病变形成  

为了研究SE-EVs是否具有类似S. epidermidis减轻AD的能力，我们将SE-EVs局部应用于卡泊三醇(MC903)诱导的AD样皮炎小鼠模型中。SE-EVs被破坏成膜碎片(称为溶解的SE-EVs；图1e和补充图S2a和b)，用以模拟单独的细菌成分。如图2a-h所示，SE-EVs的局部应用显著减少了MC903诱导的AD样皮炎小鼠的角质层增厚、厚度、干燥、红肿、经皮水分流失、瘙痒，以及典型的病理病变特征，包括角质层增生和炎症细胞浸润。然而，局部应用溶解的SE-EVs并未缓解MC903诱导的AD样皮炎小鼠的病变形成(图2a-h)。SE-EVs在2小时内穿透皮肤，而溶解的SE-EVs即使在4小时后也很少穿透皮肤(图2i)。这些结果表明，皮肤穿透是减轻这种小鼠模型皮炎的关键。

图2. SE-EVs缓解小鼠耳朵MC903诱导的AD样病变皮肤。

(a)经PBS(对照组)、MC903、MC903+SE-EVs或MC903+溶解SE-EVs处理14天后，小鼠耳朵的总体外观。(b)不同组在指点时间点耳朵厚度的动态变化。(c) 14天时，不同组小鼠耳部组织切片的H&E染色。(d) 14天时，不同组小鼠耳朵表皮厚度。(e-g)不同组14天小鼠耳朵的干燥度、红度和TEWL。(h) 14天时，不同组小鼠30分钟内抓挠的频率。(i)正常小鼠皮肤经DiI@SE-EVs或溶解的DiI@SE-EVs处理后皮肤穿透的CLSM图像。  

3. SE-EVs通过脂磷壁酸抑制促炎性基因并促进表皮细胞更新来增强表皮屏障功能  

表皮屏障损伤是触发湿疹性炎症的关键步骤。为了研究SE-EVs对表皮屏障功能的影响，我们探索了HaCaT细胞与SE-EVs之间的相互作用。如图3a和b所示，HaCaT细胞对SE-EVs的细胞内摄取量高于溶解的SE-EVs。SE-EVs显著降低了MC903处理的HaCaT细胞中促炎基因(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和iNOS)的表达，而溶解的SE-EVs则没有(图3c-g)。但是，SA-EVs显著加剧了MC903处理的HaCaT细胞中促炎基因的表达(图3c-g)。

接下来，我们探索SE-EVs抑制炎症的机制。如补充图S3a所示，SE-EVs含有脂磷壁酸(LTA)。用抗LTA抗体预处理的SE-EVs没有抑制MC903处理的HaCaT细胞中促炎基因的表达(补充图S3b-f)，表明SE-EVs通过LTA发挥抗炎作用。考虑到AD中S. epidermidis菌株的多样性，我们研究了不同S. epidermidis菌株EVs中LTA含量。如补充图S3a所示，SE-EVs中的LTA含量高于SE-EVs(JWA437)(补充图S3g和h)。此外，SE-EVs的抗炎作用和β-防御素诱导的作用均高于SE-EVs(JWA437)(补充图S3i-l)。这些结果表明SE-EVs是菌株特异性的。

此外，我们探索了SE-EVs是否能促进表皮细胞更新。如图3h-k所示，SE-EVs显著增加了MC903处理的HaCaT细胞的增殖和迁移，而溶解的SE-EVs只能轻微增强MC903处理的HaCaT细胞的增殖和迁移。这些结果表明SE-EVs可以促进表皮细胞更新。

值得注意的是，与SE-EVs处理相比，经木瓜蛋白酶处理SE-EVs，其促进增殖作用会大大减弱，但不会影响MC903处理的HaCaT细胞中促炎基因(TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和iNOS)表达的抑制(补充图S3m-r)。因此，可以看出，这种双重效应是由不同的生物活性分子完成的。

图3. SE-EVs增强皮肤屏障功能。

(a)用DiI@SE-EVs或DiI@Lysed SE-EVs处理HaCaT细胞0、0.5、1、2、4和6小时后，流式细胞仪分析平均荧光强度。(b)用DiI@SE-EVs或DiI@Lysed SE-EVs处理HaCaT细胞2小时的CLSM图像。(c-g)与GAPDH基因的mRNA水平相比，用PBS(对照组)、MC903、MC903+SE-EVs、MC903+解离SE-EVs或SA-EVs处理HaCaT细胞24小时，其TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和iNOS mRNA水平。(h)用PBS(对照组)、MC903、MC903+SE-EVs或MC903+解离SE-EVs处理HaCaT细胞24小时，其EdU增殖情况。(i)用划痕实验评估不同组别处理HaCaT细胞在12和24小时的迁移能力。(j)用ImageJ软件定量分析不同组别HaCaT细胞EdU阳性细胞百分比。(k)用ImageJ软件定量分析不同组别HaCaT细胞在12和24小时的迁移速率。  

4. SE-EVs通过Toll样受体2(TLR2)信号显著诱导的β-防御素表达来抑制皮肤感染  

当受到共生皮肤微生物及其衍生物的刺激时，角质细胞分泌各种AMP，如hBD2和hBD3。因此，我们检测了SE-EVs对MC903处理的HaCaT细胞AMP产生的影响。MC903处理的HaCaT细胞经SE-EVs处理后，hBD2和hBD3的mRNA水平显著增加并具有时间依赖性(图4a和b及补充图S4a和b)。TLR2 mRNA表达也有类似的结果(图4c和补充图S4c)。然而，当MC903处理的HaCaT细胞接受溶解的SE-EVs刺激时，仅hBD3的表达有轻微的增加，而hBD2的表达没有变化(图4a和b)，这与TLR2 mRNA水平的轻微增加相符(图4c)。为了确定SE-EVs通过TLR2配体诱导的β-防御素，我们使用了TLR2特异性抗体。HaCaT细胞经TLR2特异性抗体预处理后，SE-EVs诱导的hBD2和hBD3表达被完全抑制(补充图S4d和e)。TLR2 mRNA表达也有类似的结果(补充图S4f)。考虑到TLR信号主要是由NF-κB激活介导的，我们检测了SE-EVs对HaCaT细胞中hBD2和hBD3诱导的影响。SE-EVs刺激HaCaT细胞可使NF-κB水平增加4倍，而HaCaT细胞经TLR2特异性抗体预处理后再用SE-EVs时孵育，NF-κB激活被抑制(补充图S4g和h)。有趣的是，当SE-EVs被LTA抗体预处理后，hBD2、hBD3和TLR2的表达比单独处理SE-EVs时更高(补充图S3i-k)。当SE-EVs被木瓜蛋白酶预处理后，它们诱导hBD2和hBD3表达的能力被完全抑制(补充图S3l和m)。

由于hBD2和hBD3是抑制皮肤病原体感染的防御因子，我们探索了SE-EVs刺激MC903处理的HaCaT细胞诱导的hBD2和hBD3表达，是否可以抑制皮肤病原体的生长。如补充图S4n所示，SE-EVs本身没有抗菌活性。SE-EVs或溶解的SE-EVs与MC903处理的HaCaT细胞共孵育后，其培养上清液可抑制S. aureus的生长(图4d和补充图S4o-q)。SE-EVs与MC903处理的HaCaT细胞共孵育后其上清液的抗菌效果优于经溶解的SE-EVs处理的培养上清液(图4d)。我们还用菌落形成单位计数法检测了培养上清液中S. aureus的数量(图4e和f)。培养上清液的抗菌效果与SE-EVs刺激MC903处理的HaCaT细胞的时间长短正相关(补充图S4r-t)。

图4. SE-EVs通过TLR2信号通路诱导HaCaT细胞产生hBD2和hBD3以抵抗皮肤感染。

经PBS(对照)、MC903、MC903加SE-EVs或MC903加溶解SE-EVs处理24小时后，HaCaT细胞中的hBD2(a)和(b)hBD3 mRNA水平。(c)不同组中HaCaT细胞中TLR2 mRNA水平。(d)S. aureus在不同组别的HaCaT细胞上清液中培养15小时的生长曲线。(e)将培养15小时的细菌培养液收集，稀释并涂布平板，37°C培养过夜培养后的S. aureus菌落数。(f)不同组培养15小时后，细菌培养液中S. aureus总数。  

5. SE-EVs减轻MC903诱导的AD样皮炎小鼠模型中炎症细胞浸润  

AD病变通常表现出炎症细胞浸润，特别是CD4+细胞，这导致TH2细胞相关基因的上调，从而促进B细胞IgE类转换和抗原特异性IgE分子的分泌。接下来，我们研究了SE-EVs对MC903诱导的AD样皮炎小鼠模型中炎症细胞浸润的影响。与未治疗的AD样皮炎小鼠模型相比，SE-EVs的局部应用显著降低了CD4+ T细胞和Gr1+细胞的丰度(图5a-d)，TH2型细胞因子基因，包括IL-4，IL-13和TLSP(图5e-g)的表达，以及总血清IgE水平(图5h)，。值得注意的是，我们观察到在MC903诱导的AD样皮炎小鼠模型中，经SE-EVs治疗后，CD8+ T细胞的数量增加了2.08倍(图5a和i)。SE-EVs诱导的CD8+ T细胞具有以IL-17A转录为特征mRNA表达谱(图5j)。然而，与小鼠模型相比，应用溶解的SE-EVs到MC903诱导的AD样皮炎小鼠治疗后，却无显著变化。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的数量通过小鼠耳朵的免疫荧光染色定性地显示出来(图5k)。这些结果表明，SE-EVs减弱了MC903诱导的AD样皮炎小鼠中的炎症细胞浸润、TH2型细胞因子基因表达和IgE水平。

图5. SE-EVs缓解MC903诱导的AD样皮炎小鼠的炎症细胞浸润。

(a)用PBS(对照)、MC903、MC903+SE-EVs或MC903+溶解的SE-EVs连续处理14天，小鼠耳朵的CD4+和CD8+ T细胞群体的流式分析图。(b)不同组中Gr1+细胞群体的流式分析图。(c，d)相应的CD4+ T细胞和Gr1+细胞的定量分析。(e-g)不同组中小鼠耳朵在第14天的各种TH2细胞因子基因(IL-4、IL-13和TLSP)的mRNA水平。(h)不同组中小鼠在第14天的总血清IgE水平。(i)相应的CD8+T细胞的定量分析。(j)不同组中小鼠耳朵在第14天IL-17A mRNA水平。(k)用PBS(对照)、MC903、MC903+SE-EVs或MC903+溶解的SE-EVs连续处理14天，小鼠耳朵的免疫荧光图像(蓝色：DAPI，绿色：CD4，红色：CD8)。  

讨论

本研究表明，在MC903处理的HaCaT细胞中，SE-EVs抑制了炎性基因，促进了表皮细胞更新，并诱导了β-防御素。在MC903诱导的皮炎小鼠模型中，SE-EVs减少了炎性细胞浸润，并诱导IL17A+ CD8+T细胞的积累。我们的结果指明了SE-EVs在减少AD样炎症中的作用。

EVs的特性受多种因素的影响，包括培养条件、来源和储存方法。在此，我们从S. epidermidis(ATCC12228)中分离出纳米尺寸的EVs。尽管本研究中的EVs和先前报道的EVs均来自同一菌株，但由于使用的分离方法和培养条件不同，其物理性质(包括大小和蛋白质含量)存在一定差异。然而，EVs的功能特性取决于其亲本细菌。以前的研究已经表明，SA-EVs具有与S. aureus类似加剧AD的能力。本研究表明，SE-EVs很好地复制了S. epidermidis的某些功能，例如不诱导表皮细胞炎症，但诱导非表皮细胞炎症，表明SE-EVs是生物活性纳米载体。此外，我们发现SE-EVs的稳定性对其物理和功能特性有影响，表明适当的储存SE-EVs的方法非常重要，以便进一步研究。然而，EVs具有物种特异性，甚至是菌株特异性，因此EVs的储存可能需要精准方法。

EVs因其增强皮肤渗透和细胞内摄取而作为治疗皮肤病的生物活性纳米载体而受到越来越多的关注。在此，溶解的SE-EVs代表不具备纳米载体系统而含有生物活性成分的膜片段。本研究表明，与溶解的SE-EVs相比，SE-EVs在MC903诱导的AD样皮肤炎小鼠和MC903处理的HaCaT细胞中具有更强的缓解炎症的能力。这一结果得到了以下事实的支持：SE-EVs更易渗透皮肤并被靶细胞更有效地摄取。在先前的研究中，SA-EVs在皮肤渗透和细胞内摄取方面具有类似的特性，但在疗效方面加剧了疾病。此外，由于SE-EVs无法复制，与应用活的S. epidermidis相比，其应用避免了潜在的感染风险，即使它们渗透到皮下层。这些结果表明SE-EVs作为生物活性纳米载体在治疗AD中具有潜力。

表皮屏障损伤和皮肤炎症是AD中相互促进的过程。在本研究中，我们发现SE-EVs既抑制炎症又促进表皮细胞更新。SE-EVs的这种双重作用可能会加快表皮屏障损伤修复的速度。此外，我们证实SE-EVs通过LTA发挥抗炎作用，并且是菌株特异性的。进一步，我们发现用木瓜酶预处理SE-EVs大大减少了促增殖作用，但不影响抗炎作用。然而，SE-EVs中到底是什么促进了表皮细胞更新仍有待确定。

尽管存在皮肤炎症，但AD患者受损皮肤处比其他炎症性皮肤病(如牛皮癣)患者表现出更少的AMPs，如cathelicidins抗菌肽和β-防御素，这导致病变皮肤经常感染。角质形成细胞是健康人类皮肤中产生抗菌肽的主要细胞类型。除了角质形成细胞的传统表达外，抗菌肽还可以由S. epidermidis或其产物诱导产生。在此，我们发现SE-EVs显著增加了HaCaT细胞和MC903处理的HaCaT细胞中hBD2和hBD3的表达，表明SE-EVs可能对正常皮肤和病变皮肤均有益处。我们的数据与先前的研究结果一致，角质形成细胞依赖于TLR2信号通路来产生β-防御素。TLR2是革兰氏阳性菌脂多肽(TLR2/6配体)在角质形成细胞上的主要受体。用木瓜蛋白酶处理SE-EVs，其诱导β-防御素的能力被完全抑制，表明SE-EVs中可能存在脂蛋白，用以激活最初的免疫反应。尽管LTA是TLR2配体，但它不能诱导hBD2和hBD3的表达。用LTA抗体处理SE-EVs后，可以增加β-防御素的诱导，但消除了抗炎症作用，表明SE-EVs是通过不同的信号通路发挥抗菌和抗炎症作用。与S. epidermidis类似，SE-EVs通过NF-κB激活诱导β-防御素。因此，SE-EVs可以通过激活TLR2来增强抗菌反应，从而有助于限制皮肤感染。

研究表明，CD8+ T细胞在AD病变皮肤中的水平会有所增加。应用SE-EVs到MC903处理的AD样皮肤炎小鼠后，皮肤炎症减轻。CD8+ T细胞水平会降低，但我们的结果表明恰恰相反。先前的研究表明，AD样病变中皮肤浸润的CD8+ T细胞是主要产生IFN-γ的细胞，即IFN-γ+CD8+ T细胞。另一项最近的研究表明，S. epidermidis的定植可以诱导IL-17A+CD8+ T细胞进入表皮并抑制侵入性病原体。我们进一步鉴定了皮肤浸润的CD8+ T细胞的表型，表明SE-EVs可诱导MC903处理的AD样皮肤炎小鼠产生共生特异性T细胞反应。考虑到共生特异性T细胞反应与炎症无关，SE-EVs与正常皮肤之间的相互作用值得进一步研究。

综上所述，本研究结果表明，SE-EVs可以通过支持表皮屏障、促进AMP表达和改善TH2淋巴细胞偏向来缓解AD样炎症。值得注意的是，SE-EVs可以通过特定的T细胞反应来调节屏障免疫。最重要的是，这些观察结果可能为减少AD样炎症提供新的见解，通过来自皮肤共生菌的EVs，进一步理解皮肤菌群与宿主之间的相互作用，并提供基于SE-EV的纳米载体药物递送的潜在应用。