CAR或TCR mRNA-纳米颗粒-T细胞的重复输注消退疾病

CAR-T或TCR-T望而却步？特异性CAR或TCR mRNA-纳米颗粒-T细胞的重复输注可消退疾病

工程嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)有助于创造疾病特异性T细胞用于靶向治疗，但体外制造工程T细胞的成本和严谨性可能令人望而却步，因此在体内编程T细胞可能是一个可行的替代方案。在这里报告了一种可注射的纳米载体，其递送体外转录(IVT)的CAR或TCR mRNA，用于瞬时重新编程T细胞以识别疾病相关抗原。在人白血病、前列腺癌和乙肝诱导的肝细胞癌小鼠模型中，重复输注这些聚合物纳米载体可以诱导足够的宿主T细胞表达肿瘤特异性CAR或病毒特异性TCR，从而导致疾病消退，其水平类似于体外工程淋巴细胞的推注。考虑到它们易于制造、分销和管理，这些纳米载体和相关平台可能成为多种疾病的治疗方法。

过继T细胞疗法是一种从患者或捐赠者身上获取的T细胞经过基因改造以靶向癌症或感染性病原体进行治疗的一种有效方法，得到了大量临床试验的支持并显示出令人印象深刻的结果。然而，为每个患者制造定制的T细胞产品的复杂性和高昂的成本，而不是以标准化形式批量制备药物，使其难以与小分子药物或单抗等一线治疗方案竞争。目前，大多数CAR-T和TCR-T细胞是通过繁琐的过程制造的，包括：(i)白细胞分离，从通过两根静脉导管连接到分离机并持续数小时的患者身上提取T细胞。这对患者来说是不舒服的，会产生大量的金钱成本，最终可能限制大规模采用自体T细胞；(ii)T细胞的激活和转导；(iii)在添加细胞因子的组织培养液中大约2周的时间内扩增转导的T细胞；(iv)在给药前清洗和浓缩T细胞，对于在中心设施生产并运输到远程治疗中心的T细胞产品，细胞必须冷冻保存；(v)每批CAR-T产品都需要进行质量控制放行测定。整个过程必须在符合GMP的环境控制条件下进行，维护和运行成本很高。因为每种CAR-T产品都是由待治疗患者的起始材料(T细胞)制成的，所以没有规模经济。

体外转录(IVT)mRNA已成为一类颠覆性的新药，可用于在体内直接编码与治疗相关的蛋白质。合成的mRNA分子可以快速设计和操作，并相对经济高效地批量生产。在过去的几十年里，科学家们已经学会了如何从药理学和免疫学上优化mRNA，使其更像药物一样用于临床应用。

在这里，探索将mRNA作为一种可注射药物，基因重编程循环中的T淋巴细胞以瞬时表达疾病特异性受体，从而绕过从患者身上提取和培养淋巴细胞的需要(图1)。为了保护治疗负载并精确地将其靶向T细胞，研制了可生物降解的聚合物纳米载体。首先在体外证明了单个纳米颗粒应用可以用CD19特异性1928z CAR（FDA批准用于治疗B细胞淋巴瘤）或针对HBV核心抗原的HBcore18-27 TCR（目前处于治疗HBV相关肝细胞癌患者的I期研究； NCT03634683）常规地转染>70%的培养T细胞。纳米颗粒转染的T细胞在其表面瞬时表达这些CAR转基因或TCR转基因，平均持续7天。使用淋巴瘤、前列腺癌和HBV诱导的肝细胞癌的原位异种移植小鼠模型证明，当定期给药时，编码CAR或TCR的mRNA颗粒可以从基因上重新编程循环中的T细胞，以诱导与体外病毒转导的传统过继转移T细胞类似的疗效。

图1 如何使用聚合物纳米颗粒携带的IVT mRNA原位重新编程T细胞以表达疾病特异性CARs或TCRs的示意图。这些颗粒表面覆盖有靶向细胞毒性T细胞的配体，因此一旦它们被注入患者的循环，就可以将它们携带的转基因转移到淋巴细胞中，并瞬时对细胞进行编程以表达其疾病特异性CAR或TCR在其表面上。

目前，通过基因转移将CAR或TCR插入淋巴细胞中是在患者体外的专门制造车间中进行的，但将细胞往返于洁净室的过程和基因转移程序本身都是劳动强度大、成本高、耗时宝贵的过程。如果工程T细胞疗法达到其扩展到各种癌症类型的不同人群的承诺，经济和制造方面的挑战可能会增加。

这里证明了mRNA纳米药物可以通过现成药物的便利性实现有效的、无副作用的细胞治疗的能力。就像传统药物一样，有了这种新的治疗方式，只要医疗需要，患者就可以很容易地重新给药。

CAR或TCR基因mRNA纳米载体转染T细胞

为了将编码疾病特异性受体基因的IVT mRNA递送到人淋巴细胞中，这里使用了一种可生物降解的聚β-氨基酯(PBAE)聚合物制剂作为载体基质（图2a）。在研究中使用的将mRNA浓缩成纳米颗粒的PBAE-447聚合物最初是由约翰霍普金斯大学的Jordan Green实验室开发的。在过去的十年里，广泛描述了PBAE的关键特性。PBAEs通过在较低的pH值下进行质子化来实现内体逃逸，由于缓冲导致渗透压积聚，从而导致内体破坏。用于核酸递送的PBAEs的高通量组合文库筛选表明，叔胺的存在改善了低pH下的缓冲能力并促进了内体逃逸。PBAEs主链结构中的酯键在水溶液中发生水解，使PBAEs的毒性低于其他不可降解的阳离子聚合物，如被广泛研究作为核酸递送载体的PEI。阳离子PBAE通过静电相互作用与阴离子核酸自组装成纳米络合物(图2b)。通过将抗CD8抗体偶联到聚谷氨酸(PGA)上，形成静电吸附到颗粒上的偶联物，使颗粒具有细胞靶向性。由此得到的mRNA纳米载体可以被冷冻干燥以便长期储存。使用前，颗粒在加入无菌水后几秒钟内水合，以恢复其原始浓度。使用粒子跟踪分析(NanoSight NS300, Malven Panalytical)来表征十个独立批次生产的颗粒（图2c）。结果表明，PbAE/PGA-anti-CD8纳米颗粒的平均粒径为106.9±7.2nm。ζ电位为4±2，用Qubit RNA HS试剂盒检测的mRNA包封率为90.9±6.2%，在所用的纳米粒配方PBAE：mRNA=60:1时。

图2 淋巴细胞编程纳米颗粒的设计与制造。a：实验中使用的T细胞靶向IVT mRNA纳米载体的示意图。为了创造一种可以简单地通过接触来修饰原代T淋巴细胞(非病毒感染方法难以实现的) 的试剂，设计了由4种功能成分组成的聚合物纳米颗粒：(i)表面锚定的靶向配体，它选择性地将纳米颗粒与T细胞结合并启动快速受体诱导的内吞作用使其内化。实验中使用了anti-CD8抗体；(ii)带负电荷的涂层，它通过减少纳米颗粒的表面电荷来屏蔽纳米颗粒，以最大限度地减少脱靶结合。由于它已经被广泛用于药物输送平台，选择了聚谷氨酸(PGA)来实现这一点；(iii)载体基质，它当核酸在内吞体内时凝聚并防止核酸被酶降解，但一旦颗粒被输送到细胞质中就会释放它们从而使编码的蛋白质能够翻译。为此，使用了可生物降解的聚(β-氨基酯)(PBAE)聚合物配方，其在水条件下的半衰期在1-7h之间；(iv)包裹在载体中并产生疾病特异性CAR或TCR瞬时表达的核酸(IVT mRNA)。b：描述如何制造纳米颗粒。c：粒径分布，使用NanoSight NS300仪器测量。

首先确定在人淋巴细胞培养中加入靶向IVT mRNA纳米载体是否可以对细胞进行稳定的转染。为了在临床相关系统中测试该技术，在纳米颗粒上加载了编码白血病特异性1928z CAR的IVT mRNA（图3a-e）。CD19靶向受体是当今研究最多的CAR-T细胞产品。第二个例子，这里提供了编码高亲和力HBV特异性TCR的IVT mRNA(图3f-j)。T细胞治疗慢性乙型肝炎是恢复抗病毒免疫、治愈感染的一种新方法。针对HBV核心抗原的HBcore18-27 TCR是从一名已解决HBV感染的HLA-A02.01供体中分离出来的。对于1928z CAR和HBcore18-27 TCR构建体，首先使用实时定量PCR和流式细胞术来测量其在单个纳米颗粒转染后在人T细胞中的表达水平。这里发现，转基因表达在纳米颗粒暴露后24h达到峰值，随后逐渐下降（图3a,f）。值得注意的是，只有用T细胞特异性（抗CD8或抗CD3）抗体功能化的纳米颗粒才能有效地递送转基因，而同型对照功能化的纳米颗粒产生的基因表达接近背景水平(图S1)。这转化为CAR或TCR表面的高水平表达，在第2天达到最大值（75%±11%的T细胞表达1928z CAR，图3b,c；平均89±4%的T细胞表达HBcore18-27 TCR，图3g,h）。正如预期的那样，受体的表达是短暂的，培养8d后，CAR和TCR的受体表达分别下降到28±6%和26±9%。接下来，使用病毒方法比较了纳米颗粒转染的T细胞和用这些受体设计的T细胞的功能(杀伤和细胞因子产生)。为了证明肿瘤抗原的特异性，将转导了与肿瘤无关的CAR基因(P28z，靶向前列腺特异性膜抗原)或TCR基因(MSLN-TCR，间皮素特异性)的T细胞作为对照组。使用实时IncuCyte®活细胞分析，无法测量IVT mRNA转导的T细胞选择性裂解抗原阳性靶细胞的能力的显著差异(1928z CAR的Raji淋巴瘤细胞和HBcAg的HepG2肝癌细胞稳定转导HBcAg用于HBcore18-27 TCR)（图3d,i）。此外，在纳米颗粒转染组和病毒转导组的T细胞中也检测到了类似水平的T细胞分泌的效应细胞因子(图3e,j)。

图3 IVT mRNA纳米载体通过CAR或TCR转基因有效地转染人T细胞。分离的人CD8+T细胞被包裹抗TCR/CD3和共刺激CD28受体的抗体的beads刺激。24小时后，去除beads，并将含有编码白血病特异性1928zCAR(a-e)或HBcore18-27 TCR(f-j)的mRNA CD8靶向纳米颗粒(NPs)以3μg mRNA/10^6个细胞的浓度混合到细胞悬液中。a：qPCR检测暴露于1928z CAR NPs的T细胞随时间变化的相对1928z CAR mRNA表达。b：细胞流式细胞术检测与携带1928z编码mRNA的NPs孵育后不同时间点T细胞。c：体外基因转移效率汇总图。d：体外比较纳米颗粒和逆转录病毒转染组T细胞对Raji淋巴瘤细胞的杀伤活性。T细胞与Raji肿瘤细胞按5:1比例共培养。使用IncuCyte活细胞分析系统来定量1928z-CAR或对照(P28z-CAR)转染的T细胞随时间的变化对Raji NucLight红细胞的免疫细胞杀伤。e：ELISA法检测IL-2(24h)、TNF-α和IFN-γ(48h)的分泌。f-j的HBcore18-27 TCR mRNA同理。

图S1 CD3靶向的mRNA纳米颗粒选择性转染人T细胞。

纳米颗粒重编程宿主T细胞识别白血病

接下来，研究了以淋巴细胞为靶点的IVT mRNA NPs是否可以重编程循环中的T细胞，数量足够大，从而以与传统方法相似的效果实现肿瘤消退。作为第一个体内测试系统，将表达萤火虫荧光素酶的1×10^6 CD19+Raji细胞接种到免疫缺陷的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠以此来建立白血病模型。5天后，小鼠被重组为10×10^6 CD3+人T细胞，并接受每周6次输注加载了编码1928z CAR的基因(50μg/剂量)的纳米颗粒，以产生白血病特异性或加载编码GFP的mRNA的对照颗粒(图4a)。根据用IVT mRNA纳米颗粒体外测量CAR表面表达的动力学，选择每周一次的纳米颗粒给药方案，该纳米颗粒显示相关受体表达长达8天(图3b,c)。为了比较纳米颗粒输注与传统过继T细胞疗法的疗效，还用编码1928z CAR的慢病毒体外转导5×10^6 T细胞给另一组小鼠治疗。该量相当于目前临床研究中使用的较高剂量的CAR-T细胞，在临床研究中，患者接受了每公斤体重高达1.2×10^7 CAR-T细胞的治疗。在另一种给药方案中，将慢病毒转导的CAR-T细胞过继转移与全身注射携带对照GFP mRNA的纳米颗粒相结合，以确定纳米颗粒介导的转染是否损害T细胞的抗肿瘤功能。对照组小鼠要么不接受治疗，要么输注未转导的人效应性T细胞。肿瘤生长通过生物发光成像进行连续量化并监测存活率的差异。发现体外工程1928z CAR-T细胞的过继转移显著提高了存活率。10只小鼠中有6只肿瘤被根除，其余小鼠肿瘤消退，平均32天存活率提高(图4b,c)。通过传统的过继T细胞疗法获得的这种治疗益处类似于在体内将相同的CAR编程到淋巴细胞中的IVT mRNA纳米颗粒的治疗，这实现了10只小鼠中的7只肿瘤被根除，并使复发动物的平均生存时间37天(图4c)。第一次给药后2天外周血的流式细胞仪分析显示，携带1928z的纳米颗粒有效重编程循环T细胞以识别白血病细胞(平均10%±4.3%的CAR+CD8+，图4d,e)。正如预期的那样，这些CAR瞬时表达长达1周(第7天CAR+CD8+T细胞占0.8±0.4%)。值得注意的是，重复剂量的纳米颗粒与第一次注射一样有效，平均实现了10.7±3.6%的基因转移到宿主T细胞(图4e)。这表明，尽管IVT mRNA具有瞬时性，但它可以作为在宿主淋巴细胞中实现持续的原位CAR表达平台。

图4 纳米颗粒编程CAR淋巴细胞可以导致白血病消退，其疗效类似于过继T细胞疗法。a：时间线和纳米颗粒(NP)给药方案。b：全身注射到NSG小鼠体内表达萤火虫荧光素酶的Raji淋巴瘤细胞的顺序生物成像。c：动物在治疗后的存活率，描绘为Kaplan-Meier曲线。d：注射携带编码1928z CAR的IVT mRNA的纳米颗粒前后的外周T细胞的流式细胞术。e：显示重复输注1928z CAR NPs后CAR转染的CD8+T细胞百分比。每一条线代表一只动物。每个时间点的平均转染率(±SD)显示在顶部。

完全免疫功能正常宿主的治疗反应

为了研究排他性靶向如何将纳米颗粒的相互作用限制在循环中的T细胞，以及它如何影响它们的命运，使用了完全免疫活性的Ai14报告鼠。在这个转基因模型中，所有细胞都含有loxP侧翼的终止盒，阻止CAG启动子驱动的tdTomato蛋白的转录。只有成功地转导了编码Cre重组酶(Cre)的mRNA的细胞才会切除loxP侧翼的终止盒，从而导致永久的tdTomato转录和随后强烈扩增的tdTomato表达。首先在注射CD3靶向(或同型对照功能化)携带Cre mRNA的纳米颗粒后测量了Ai14小鼠中整个器官的荧光。非靶向颗粒介导的基因表达在肝脏中最高，而淋巴细胞靶向纳米载体诱导的基因转移主要在脾、淋巴结和胸腺(图5a,b)。对脾进行的详细的流式细胞术分析(图5c)显示CD3靶向纳米颗粒优先转染T细胞(8.1±1.9%)，而不影响活性。其他CD45+亚型如巨噬细胞(3.2±1.5%)、B细胞(1.1±0.9%)、中性粒细胞(0.3±0.2%)和DC细胞(1.9±0.8%)的dtTomato信号水平较低。

图5 免疫功能正常小鼠的有效T细胞靶向。B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai reporter)小鼠每天静脉注射3剂载有15μg mRNA编码核定位信号(NLS)-Cre的纳米颗粒。使用全长抗CD3 MuIgG2a或IgG2a 同种型对照将纳米颗粒靶向小鼠T细胞。两种抗体都设计为LALAPG变体，以消除Fc受体结合和补体激活。最后一次注射后48h，收集器官并使用荧光IVIS成像测量全器官dtTomato荧光。脾脏和血液的单细胞悬液用针对各种免疫细胞亚型的抗体标记并通过流式细胞术进行分析。a：在荧光IVIS成像下器官中的代表性dtTomato表达。b：对每个器官的荧光信号进行量化。c：显示脾中免疫CD45+dtTomato+细胞类型的平均±SD百分比。检测巨噬细胞(CD45+、CD11b+、MHCII+、CD11c−、Ly6C−/Low、Ly6G−)、B细胞(CD45+、B220+)、T细胞[CD4+T细胞(CD45+、TCRβ+、CD4+、CD8-)、CD8+T细胞(CD45+、TCRβ+、CD4−、CD8+)、中性粒细胞(CD45+、CD11b+、MHCII+、CD11c−、Ly6G+)和DC细胞(CD45+、CD11c+、CD11b−、MHCII+)。

基于这些分布研究，接下来测试了测量的mRNA纳米颗粒重定向T细胞的数量是否足以减少完全免疫功能宿主中已建立的癌症。为此，将表达荧光素酶的Eμ-ALL01白血病细胞注入白化C57BL/6小鼠（在免疫功能正常小鼠中建立B细胞急性淋巴细胞白血病模型），并使用生物发光成像来量化治疗组之间肿瘤进展的差异(图6a)。小鼠要么接受CD3靶向纳米颗粒递送编码全鼠1928z CAR的mRNA，要么接受GFP对照(方法见图S2)。第三组未接受治疗。发现，只有输注编码1928z CAR的纳米载体才能有效地控制白血病的进展(图6b,c)，与GFP对照组相比，治疗三周后肿瘤负荷平均减少了26倍。

图6 免疫功能正常小鼠的抗白血病反应。a：时间线和给药方案。b：纳米颗粒注射后Eµ-ALL01荧光素酶信号强度图。每条线代表一只动物，每个点反映其整个动物的光子计数。c：全身注射表达萤火虫荧光素酶的Eμ-ALL01白血病细胞在白化C57BL/6小鼠体内的顺序生物成像。显示了来自每组(n=10)的5只有代表性的小鼠。

图S2 抗CD3小鼠IgG2a LALA-PG和非结合子对照。

实体瘤的治疗反应

为了正式这项技术不仅与血液系统恶性肿瘤的治疗相关，还与实体肿瘤的治疗相关，接下来研究了旨在将前列腺癌特异性CAR基因导入循环宿主T细胞以诱导小鼠前列腺癌消退的纳米颗粒的能力。与白血病细胞不同，白血病细胞表达高水平的CD19抗原且很容易被循环中的淋巴细胞访问，而实体恶性肿瘤是异质性的，受到保护。这意味着部分肿瘤细胞将逃避靶向CAR的识别，并将被免疫抑制防御系统包围，这可能会导致T细胞功能失调。事实上，使用140例前列腺癌转移的全基因组/转录分析来确定前列腺癌病变在患者中表现出三种关键细胞表面蛋白[前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)]的异质性表达(图7a)。为了概括人类疾病，将LNCaP C42前列腺癌细胞原位移植到NSG小鼠的前列腺背叶(图7c)，该细胞表现出这些关键细胞表面蛋白的异质性表达(图7b)。为了通过生物发光成像来连续监测肿瘤负荷，用萤火虫荧光素酶(Fluc)对肿瘤细胞进行基因标记。原位移植后，所有小鼠在三周内可重复地出现病变(图7c，右图)，用人10×10^6 CD3+人T细胞重建，并随机分配到不同的治疗组或对照组(图7d)。首先测试了全身注射10^6个体外转导的针对肿瘤抗原ROR1的CAR+T细胞对荷瘤小鼠的治疗效果。发现尽管抗ROR1 CAR-T细胞没有达到肿瘤清除，但接受治疗的小鼠的存活率增加了一倍多(69天vs未治疗对照组为32天；图7d)。为了确定“现成”纳米制剂是否可以达到类似的治疗效果，每周向小鼠全身注射ROR1 CAR转基因纳米颗粒(50μg mRNA/剂量；图7e)。与未经治疗的对照组相比，颗粒诱导CAR编程平均延长了40天的生存期，这与传统过继T细胞疗法获得的生存益处相似(图7d,f)。T细胞的适当定位和持久性是抗实体瘤活性的先决条件，因此接下来评估了随着时间的推移，ROR1 CAR-T细胞渗入前列腺癌的频率。对T细胞转移后4天、7天和11天切除的LNCaP C42前列腺癌的流式细胞仪分析显示，静脉输注T细胞到肿瘤部位(平均892±295 CAR+T细胞/mg肿瘤组织)，但不能生长(在第4天到第11天之间只有1.04倍的总体扩张；图7g,h)。此外，原位编程的CAR-T细胞有效地渗透到肿瘤中(平均648±240 CAR+T细胞/mg肿瘤组织)，并在下调受体之前保持高水平的CAR转基因(平均91±7 CAR+T细胞/mg肿瘤组织，图7h)。在同一天静脉注射ROR1 CAR编码mRNA纳米颗粒的加强剂量后，肿瘤病变再次被新鲜重新编程的外周T细胞浸润(第11天平均1066±225 CAR+T细胞/mg肿瘤；图7h)，这概括了在白血病研究中已经观察到的mRNA纳米颗粒诱导T细胞重编程的振荡动力学(图4e)。

为了确定过继转移的T细胞和输注的mRNA纳米载体未能完全清除疾病的原因，用流式细胞术对复发的前列腺癌的抗原表型进行了鉴定。癌症中最常见的逃避策略之一是减少靶抗原的表达，因为CARs产生选择性压力。在临床前和临床研究中，当过继转移的仅针对单一抗原的T细胞用于治疗异种肿瘤(如转移性前列腺癌)时，这种现象都被报道为失败的原因。发现与在不同水平表达ROR1肿瘤抗原的未治疗的LNCaP C42前列腺癌相比，两个治疗组 (过继转移的T细胞或纳米颗粒编程的T细胞) CAR靶向肿瘤最终产生了ROR1低/阴性免疫逃逸变体(图7i)。

图7 编码前列腺癌特异性CAR的IVT-mRNA纳米载体可以提高已有疾病的小鼠的存活率。c：移植后3周，对LNCaP C42前列腺癌进行活体生物发光成像。右图为前列腺背叶肿瘤的代表性照片(白色箭头)。d：表达萤火虫荧光素酶的LNCaP C42前列腺癌细胞原位移植到NGS小鼠前列腺内的顺序生物成像。e：时间线和纳米颗粒给药方案。f：动物在治疗后的存活率，描绘为Kaplan-Meier曲线。g：治疗开始后第11天，用多色流式细胞术检测前列腺癌患者术后恢复的细胞。过继转移或原位编程的ROR1 CAR+T细胞通过CD45和受体中掺入的c-myc标记的阳性标记进行鉴定。h：治疗开始后第4天、第7天和第11天分离的肿瘤中定位于ROR1-CAR+T细胞的绝对数。活细胞总数(台盼蓝阴性)乘以ROR1-CAR和CD45阳性的百分比。i：流式细胞术定量检测经CAR-T细胞或ROR1 4-1BBz CAR NP治疗后的LNCaP C42前列腺肿瘤细胞上ROR1抗原的表达。

HBV特异性T细胞的原位编程

编码IVT mRNA的CARs的基因转移只能将T细胞靶向位于细胞表面的抗原，因此细胞内的许多肿瘤抗原或病毒抗原无法到达这些受体。这里已经在体外证明了淋巴细胞靶向的IVT mRNA纳米颗粒可以用工程化的TCR重新编程T细胞，这些TCR识别HLA背景下的细胞内HBV核心抗原(HBcAg )(图3f–j)。鉴于全球有超过3亿人慢性感染HBV病毒，其中大量患者发展为肝硬化和肝癌，为每位患者量身定制T细胞产品显然不可行。作为实施IVT mRNA技术治疗该疾病的第一步，建立了HBV诱导的肝细胞癌(HCC)的小鼠异种移植肿瘤模型。剖腹手术后在肝内注射用HBcAg和荧光素酶稳定转导的100万个HepG2细胞。所有小鼠在7天内可重复地出现多灶性病变(图8a)，此时它们用未刺激的10×10^6 CD3+人HLA-A*02:01 T细胞重建，并接受每周两次输注载有编码HBcore18-27 TCR的mRNA(50μg/剂量)的纳米颗粒，以产生HCC特异性或载有编码GFP的mRNA的对照颗粒。第三组小鼠用单剂量的10×10^6 CD3 T细胞(HLA-A*02:01)处理，该细胞用编码HBcore18-27 TCR的逆转录病毒载体进行体外转导，对照组小鼠不接受任何处理。第二次纳米颗粒给药后4天(第18天)，分离肝脏以使用生物发光成像直接量化肿瘤负荷，单细胞悬液用HBV C18-27 MHC I Pentamer标记以量化表达HBcore18-27 TCR-T细胞的百分比。发现纳米颗粒注射编程了足够的HBcore抗原特异性T细胞以诱导疾病消退，并且与体外工程化淋巴细胞相比，可以实现类似的治疗效果(与未治疗对照相比，光子计数分别减少了13倍和18.9倍，图8b,c)。解剖肝脏的流式细胞术证实，与原位编程纳米颗粒相比，用体外工程化T细胞处理的动物中HBcore18-27 TCR-T细胞的密度相等(图8d,e)。

图8 使用载有TCR转基因的纳米颗粒对HBV特异性T细胞进行原位编程。a：建立了HBV诱导的HCC小鼠异种移植瘤模型。用HBcAg和荧光素酶稳定转导的HepG2细胞通过外科手术注射到用人T细胞重建的NSG小鼠的肝脏中。植入后三周，通过体内生物发光成像观察HepG2肿瘤，并将其分配到纳米颗粒组(每周6次50μg编码HBcore18-17 TCR mRNA的剂量)或T细胞治疗组(用编码HBcore18-17 TCR的慢病毒体外转导5×10^6 T细胞)。b，c：治疗开始6周后生物发光肝脏信号的定量。d：治疗开始后18天从肝脏中回收细胞的多色流式细胞术。通过CD45、CD8和MHC Pentamer的阳性标记来鉴定过继转移或原位编程的HBcore18-27 TCR+ T细胞。绝对数显示在e中，活细胞(台盼蓝阴性)的总细胞计数乘以HBcore18–27 TCR+、CD8+和CD45+的百分比。

总之，结果表明，重复输注T细胞靶向聚合物纳米载体可以将肿瘤特异性CAR或病毒特异性TCR转基因递送到足够数量的宿主T细胞中，以类似于体外工程淋巴细胞团注的水平诱导疾病消退。

T细胞编程纳米颗粒具有生物相容性

纳米药物的系统给药有可能引起患者的输注反应，这种不良反应通常会延迟或停止临床转化。这些反应可以表现为发烧、寒战、僵硬、皮疹、胸背痛或呼吸困难，在极少数情况下，它们可能是致命的。在药物开发过程中及早识别输注反应的风险有助于在产品进入临床试验后缓解潜在的安全担忧，节省开发人员的时间和金钱，并使患者免于潜在的危险并发症。

这里使用了NCL开发的检测级联方案，该方案可以指示输注反应。具体来说，分析了纳米颗粒对补体激活的影响(NCL方法ITA-5.2)，其溶血特性(ITA-1)，以及其对T细胞氧化应激的影响(ITA-32)。为了研究纳米颗粒浓度在临床相关中的这些影响，首先计算了理论血浆浓度(TPC)，这是有效的小鼠剂量(实验中:50μg mRNA/剂量),缩放到等效的人剂量(=2.03μg mRNA/mL血液；图9a)。为了评估T细胞靶向的mRNA纳米颗粒对红细胞的影响，在暴露于不同浓度的颗粒后，通过分光光度法测量血红蛋白的释放来进行溶血试验。通过阴性(PBS)和阳性(Triton-X)质控品测试溶血试验的性能。发现在TPC颗粒的溶血率低于2%(平均为1.21±0.26%，而PBS对照中为0.7±0.11%；图9b)，其被定义为非溶血性。纳米颗粒也没有诱导补体iC3b或Bb的活化，而C4d在TPC浓度下略高于2倍测定阈值(平均2.3±0.13%，而PBS对照中为1±0.003%；图9c)。最后，测量了线粒体氧化应激作为纳米颗粒诱导损伤的关键决定因素，因为活性氧(ROS)的过度产生会对细胞器和DNA造成损害，最终导致细胞死亡。此外，ROS过量产生的另一个后果是激活刺激促炎和纤维化细胞因子表达的细胞信号通路。与PBS对照相比，T细胞编程纳米颗粒仅诱导非常温和的氧化应激增加(平均3.6±0.2倍)(图9d)。

图9 可能的输注反应的体外分析。a：理论血浆浓度的计算。b：T细胞靶向mRNA纳米颗粒的溶血活性。c：用酶免疫分析法定量测定补体活化。相对于阴性PBS对照的2倍变化被定义为测定阈值(虚线)。d：NP转染后淋巴细胞线粒体氧化应激反应的研究。

在T细胞编程mRNA纳米颗粒可能引起输注反应的体外评估的指导下，对啮齿动物进行了全面的毒性评估。大鼠是预测基于核酸的分子疗法对人类健康毒性结果的首选啮齿动物物种，因为它的代谢生理(特别是肾脏和肝脏功能)比小鼠的更接近人类。SD大鼠(6-8周龄)被注射一剂携带100μg mRNA的纳米颗粒，这相当于小鼠体内50μg mRNA的大鼠剂量，基于体表面积剂量的标准化。这些实验是使用1928z CAR纳米颗粒进行的。1928z CAR识别人类CD19，但不与大鼠CD19交叉反应，以确保测量的参数的变化可以归因于纳米颗粒，而不是它们的重新编程活动。对照组注入25mM醋酸钠缓冲液(载体对照组)，或不注射。48h后处死动物，采血测定临床生化指标，并进行大体解剖。下列组织由委员会认证的病理学家进行评估：肺、肝、心、脑、肾、脾、骨髓和十二指肠。没有可归因于纳米颗粒药物治疗的组织学病变(图10a)。注意到的少数病变是轻微到轻度的，被认为是偶然的，与研究无关。所有组都有5只大鼠中的2只在肝脏中的炎性浸润物最少。这些微小的浸润物被认为是背景性病变，与治疗无关。同样，所有组都有肾盂慢性炎症程度轻微到轻度的个体。病变的慢性性与急性治疗效果不一致，因此被认为是偶然的。与对照组相比，纳米颗粒治疗组动物的全血计数血小板数值略低(分别为407±115K/μL和290.4±56.3K/μL；图10b)。与对照组相比，纳米颗粒组的动物也有轻微的低血糖(分别为平均45.4±26mg/dL和78.3±69.8mg/dL；图10c)。纳米颗粒处理组大鼠的所有其他血清化学指标(包括肝功能和肾功能)与对照组相当，表明没有发生全身毒性。血清IL-6水平适度上升至平均16.5pg/ml±5.9pg/ml(图10d)，根据先前的报道，可被认为是安全的。

图10 输注纳米载体与急性全身毒性无关。雌性SD大鼠静脉注射编码1928z CAR的CD8靶向IVT mRNA，48h后由委员会认证的病理学家以盲法方式进行全面的组织病理学评价和血清化学分析。a：从对照或纳米颗粒处理的动物中分离出来的各种器官的代表性的H&E染色切片。b：血细胞计数。c：血清化学。d：血清TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的检测。

总结

虽然CAR和TCR修饰的T细胞已经对少数血癌起到了转变，但很明显，它们目前的临床应用只代表了这项技术可能提供的可能性的一小部分。从理论上讲，治疗性T细胞可以治疗带有靶向抗原的恶性肿瘤和慢性感染，正如大量临床前报告所证明的那样。然而，目前在体外产生疾病特异性T细胞的方法很复杂，不能支持对大量患者群体的治疗，因为必须为每个患者产生一个新的淋巴细胞簇。为了使患者更容易获得T细胞产品，该领域已转向同种异体技术，以提供更大的规模和更低的成本。几家临床阶段的T细胞公司已经开始测试CAR-T细胞，这些细胞是由健康的无血缘关系的捐赠者而不是患者制造的“现成”产品。虽然这种方法可以治疗由于患者淋巴细胞计数低或T细胞质量差而无法制造自体T细胞的癌症患者，但它需要几个额外的细胞工程步骤来防止供体细胞攻击宿主，反过来也防止患者自己的T细胞排斥输注产品。这通常是通过多重基因编辑从T细胞产物中去除天然的TCR和HLA分子来完成的。但这些额外的操作增加了制造过程的复杂性、时间和成本，同时降低了细胞产量和活力。为了防止排斥反应，接受通用CAR-T细胞的患者首先通过淋巴耗尽化疗严重抑制免疫，这需要时间并使患者面临额外的毒性。因此，体外工程同种异体细胞产品不太可能大幅增加接受T细胞治疗的患者数量，特别是那些需要迅速干预使内源性免疫系统保持完好的传染病患者。

之前描述了一种可注射的基于DNA的纳米试剂，它可以用白血病特异性CAR转基因来编程循环T细胞。为了克服质粒DNA固有的低基因转移，质粒DNA必须进入细胞核才能转录成mRNA，在纳米颗粒上装载了编码CAR的转座子/转座酶系统，该系统随机插入到靶细胞的基因组中。虽然这项研究提供了概念证明，即使用可注射纳米试剂对CAR-T细胞进行原位编程是可能的，但将这种DNA纳米药物转化到临床将是具有挑战性的，原因如下：①不可预测的遗传毒性和表达动力学。这些纳米颗粒稳定地将其治疗性CAR转基因整合到靶细胞中，导致各种细胞类型的永久基因组改变和不可预测的遗传毒性。此外，一旦将纳米颗粒注入患者体内，医生就无法控制体内CAR表达的动力学；②每个纳米颗粒相关CAR基因的拷贝数较低。可以装载到这些DNA纳米颗粒中的CAR基因的数量受到载体骨架和启动子序列的大小以及稳定整合转座酶表达载体的要求的限制。这在很大程度上限制了原位基因转移的效率，特别是当试图递送编码TCRα和β链的大型转基因时；③需要丰富的肿瘤抗原来将原位转染的CAR-T细胞的小群体扩大到治疗相关的数量。这一扩增期需要时间，这对患有快速进展性疾病或明确的实体肿瘤的患者来说是一个不利因素。

在这里，探索了使用IVT mRNA来快速和特异性地将抗原识别能力编程到循环T细胞中作为治疗癌症和传染病的策略。与DNA纳米载体相比，合成的mRNA分子不需要进入细胞核直接翻译为治疗靶蛋白，确保了高转染率和快速治疗效果。它们的剪裁大小(该研究中实际的CAR编码或TCR编码序列+276个碱基的5‘UTR和polyA区)导致了每个纳米颗粒的高拷贝数。此外，由于递送的mRNA在细胞质中发挥其功能，因此避免了不受控制的插入突变和启动子依赖。这里证明，简单注射设计合理的mRNA纳米载体可以选择性地将CAR基因或TCR基因导入宿主T细胞，并对其进行编程，使其数量足以导致疾病消退，其有效性类似于过继方法。几项正在进行的临床试验正在测试在癌症患者中重复输注体外工程的mRNA CAR-T细胞(NCT01355965，NCT01897415，NCT02277522和NCT02624258)，并且第一个数据表明细胞输注后瞬时的CAR表达足以引发抗肿瘤反应。

IVT mRNA迅速成为一种新的过继T细胞治疗工具的三个重要原因是其固有的安全性、高效的重组蛋白翻译以及控制治疗的药代动力学特性的能力，类似于传统的小分子药物。事实上，在多次给药后在小鼠体内测量的表达CAR的T细胞的动力学类似于具有明确半衰期的药物的轮廓(图4e)。这与工程T细胞过继转移后相当不可预测的T细胞动力学形成鲜明对比，在这种情况下，血液中细胞浓度上升到最高，然后在几天到几个月的可变时间内下降。虽然原位编程获得了控制疗法的药代动力学特性并定期对宿主淋巴细胞的新鲜群体进行重新编程的能力，从而潜在地绕过了T细胞疗法广泛应用的一些主要障碍(例如，T细胞衰竭和功能障碍，以及长期毒性)，但该技术仍然有一些局限性：(1)它依赖于患者中存在足够数量的功能T细胞。淋巴细胞减少在接受大量化疗药物预治疗的晚期癌症患者中很常见。因此，患者的血液很可能需要在现成的纳米试剂的临床试验之前进行预筛选。(2)药物的药效可被免疫反应所钝化。由于T细胞编程纳米颗粒被定期注射到免疫力完好的患者体内，因此可能会形成抗药抗体。对于这项技术的临床转化，重要的是选择完全人源化的CD8靶向配体，提供具有低免疫风险的CAR/TCR结构，并用假尿苷(或最近描述的N1-甲基-假尿苷)和5-甲基胞嘧啶合成mRNA，以减少先天性免疫反应。

为了将循环中的T细胞原位重定向到常驻肿瘤细胞，几家生物技术制药商已经开发出双特异性抗体，包括BiTEs、DART和diabodies。其中，blinatumomab(一种CD19特异性BiTE)在血液系统恶性肿瘤患者的临床研究中显示出令人鼓舞的结果。然而，BiTEs必须连续输注，这会产生全身毒性。此外，与传统的单抗一样，BiTE在输注后不会进行主动的生物分布或自我扩增。相比之下，这里描述的基于纳米颗粒的基因修饰系统可以产生新生肿瘤特异性T细胞，作为一种“活药”，它主动定位于靶点，数量增加，并连续摧毁癌细胞。人们对CAR-T细胞疗法的兴趣依然浓厚，因此现在是时候推出现成纳米试剂作为一种竞争技术，它可以快速重新编程T细胞，识别和破坏肿瘤，而不需要实验室操作。

在对人类进行临床研究之前，将参照FDA关于纳米药物的规定，扩大与NCL的合作，以确认纳米颗粒在大型动物物种中的安全性。与已在临床上建立的治疗方法(如小分子或抗体)不同，CAR编程纳米颗粒是多组分的三维结构，需要可重复的制造工艺才能可靠地实现预期的物理化学特征、生物学行为和药理学特征。这种纳米药物的安全性和有效性可能会受到许多参数微小变化的影响，需要仔细监测，特别是在靶向非预期部位和潜在毒性的情况下。此外，与传统药物相比，纳米药物需要额外的开发和监管考虑。

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