科研丨Gut Microbes: 对长期阿莫西林治疗的不同反应: 微生物组的长期恢复力与肠道耐药基因组的长期扰动

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

抗生素对微生物组的附带影响已引起越来越多的关注。然而，长期抗生素暴露对肠道微生物组产生的生态后果(包括抗生素耐药性)仍知之甚少。本研究调查了阿莫西林对人体肠道微生物组和耐药基因组的长期暴露影响。作为挪威慢性腰痛多中心临床试验(AIM研究)的一部分，收集了20名接受3个月阿莫西林或安慰剂治疗的患者的粪便样本。在基线、治疗的最后一天和停用抗生素后9个月收集粪便样本。使用全鸟枪法和功能宏基因组测序数据表征微生物和耐药基因组组成的丰度和多样性。虽然随着时间的推移安慰剂受试者的微生物组谱是稳定的，但阿莫西林治疗后可观察到多样性和整体微生物组组成的明显变化。特别是与健康相关的短链脂肪酸生产物种的比例显著下降。但这些变化是短暂的，在治疗后9个月微生物组整体恢复。另一方面，长期暴露于阿莫西林与抗微生物药物耐药基因总负载和抗微生物药物耐药基因多样性的增加相关，即使在治疗后9个月仍有持续变化。此外，β-内酰胺类耐药性是受影响最大的抗生素类别，表明对阿莫西林的靶向反应，尽管基因水平的变化因人而异。总体而言，本研究结果表明长期暴露于阿莫西林对粪便耐药基因组的影响比对微生物组组成的影响更明显和持久。这些信息与设计合理的抗生素治疗用药指南有关。  

论文ID

原名：Differential response to prolonged amoxicillin treatment: long-term resilience of the microbiome versus long-lasting perturbations in the gut resistome

译名：对长期阿莫西林治疗的不同反应: 微生物组的长期恢复力与肠道耐药基因组的长期扰动

期刊：Gut Microbes

IF：9.434

发表时间：2022.12

通讯作者：Fernanda Cristina Petersen

通讯作者单位：挪威奥斯陆大学

DOI号：10.1080/19490976.2022.2157200

实验设计

结果

1 长期阿莫西林治疗对人类肠道微生物组多样性和组成的有害短期改变

为检测对长期阿莫西林暴露的治疗后以及长期分类学反应，从粪便样本中提取总DNA并在Illumina平台上测序，得到~200 Gb的原始测序数据。从60份粪便样本中总共获得了~15亿个原始序列，每个样本的reads数量在1130万到4160万(M)之间，平均为25.1 M。总体而言，49.5%(共7.2亿)高质量有效序列被分类为细菌。在大多数样本中，拟杆菌门(平均65.31%；SD 15.75%)和厚壁菌门(平均29.53%; SD 13.94%)是最丰富的门，其次是放线菌门(平均2.94%; SD 3.57%)和变形菌门(平均1.72%; SD 4.22%)。这四个门在样本中的相对丰度总和为99.5%。在属水平上，微生物组组成主要以拟杆菌属(Bacteroides)为主(平均39.06%; SD 17.68%)，普雷沃氏菌属(Prevotella)(平均11.04%; SD 22.40%)和Alistipes(平均7.87%; SD 6.37%)是第二和第三丰富属。Parabacteroides、Eubacterium、Blautia、Roseburia和Faecalibacterium是所有时间点在所有患者中发现的其他最常见的属。总共鉴定出118个差异细菌属(范围：每个患者41-71个)，所有患者均有16个共同的属。

抗生素暴露后，个体总体微生物谱没有显著差异，观察到的大多数变化因个体而异(图1a)。在治疗组中观察到了对阿莫西林的共同反应。阿莫西林给药后，Ruminococcus、Oscillibacter和Lachnospira的相对丰度显著降低，而在大多数个体中拟杆菌属和Lachnoclostridium的比例显著增加。在较高的分类水平上，我们还观察到阿莫西林处理后两个细菌科(即Bacteroidaceae和Oscillospiraceae)的比例发生了变化。相比之下，在安慰剂组的任何时间点之间，整体肠道微生物组组成中没有发现属和更高分类水平的实质性变化，这表明在没有抗生素干扰的情况下肠道微生物组相对稳定。尽管存在差异，但基于肠道微生物组组成的相似性，采用Dirichlet多项混合(DMM)模型进行肠型分析，将所有粪便样本分为拟杆菌属和普雷沃氏菌属优势属。

表1 患者的人口统计学资料。

图1 所有患者暴露前(基线)、3个月后和停止治疗9个月后(即12个月)的细菌群落组成。

(a)条形图显示阿莫西林(上)和安慰剂暴露(下)受试者中前30个最丰富的细菌属的相对丰度。丰度较低的属被合并到“其他”类别中。(b)热图展示至少两个样本中在群落中占比>1%的细菌物种的相对丰度。(c)线性判别分析(LDA)结合效应大小(LEfSe)算法鉴定阿莫西林组基线和3个月之间丰度差异显著的细菌类群的LDA评分直方图，LDA评分(log10)的临界值大于2.0。基线富集的细菌分类群用LDA阳性评分(绿色)表示，停止治疗(3个月)后立即富集的分类群用阴性评分(红色)表示。  

在肠道微生物组中检测到的优势种通常与属于Bacteroides、Faecalibacterium、Prevotella、Ruminococcus、Eubacterium、Roseburia、 Alistipes、Coprococcus和Parabacteroides的15种物种中的其中1种相关(图1b)。Faecalibacterium prausnitzii、Bacteroides vulgatus、Bacteroides uniformis、Alistipes putredinis和Parabacteroides distasonis是大多数患者中最常见和最丰富的物种。同时，一些粪便样本中主要存在一些其他细菌种类，如Prevotella copri、Bacteroides dorei和Bacteroides stercoris。这些发现与先前的研究一致，表明存在整体核心肠道微生物组。但每个个体物种水平上微生物组组成的变化都是独特的，并且暴露于抗生素后未观察到优势种的明显改变。  

随后我们使用丰富度(Chao1)和均匀度(Shannon)描述α多样性的变化。与安慰剂组相比，阿莫西林在治疗停止(3个月)后立即导致物种丰富度显著降低(LME：adjP=1.94e-05)，而均匀度并未显著降低(adj P=0.20)。9个月后，物种丰富度恢复到基线水平(图2a)。相反，安慰剂组在所有时间点都没有观察到Chao1和Shannon多样性指数的显著变化，揭示了随时间推移α多样性的整体稳定性。

采用主成分分析(PCA)纵坐标与欧氏距离进行β多样性分析，评估微生物群落组成和结构的总体变化。PCA图显示，停止阿莫西林干预(3个月)后微生物组组成立即发生显著变化(PERMANOVA：R2=0.070; P=0.007)(图2b)。但在治疗后9个月，微生物的变化不明显(PERMANOVA：R2=0.02; P=0.25)。此外，PERMANOVA分析表明个体间微生物组谱的差异大于抗生素的影响，因为来自同一个体的样本往往聚集在一起(PERMANOVA：R2=0.79; P=0.0001;nperm=999)。在安慰剂组的任何时间点都没有观察到整体细菌群落组成的显著变化。

使用Jaccard距离量化每个个体内基线和其他两个时间点样本之间的微生物组成变化，以确定阿莫西林干预后的变化程度。观察到阿莫西林组基线和3个月样本间的平均组成差异明显大于安慰剂组(0.33 vs. 0.24，P=0.042，Wilcoxon秩和检验)(图2c)，尽管在12个月时阿莫西林组组成与安慰剂组没有显著差异(0.28 vs 0.27，P=0.73，Wilcoxon秩和检验)。

本文还研究了肠道微生物组对阿莫西林治疗的反应是否比个体化反应更常见。在这种情况下，由于抗生素施加的选择性压力，我们预计在阿莫西林治疗后个体的微生物组谱将变得更加相似。但分析结果表明，在阿莫西林治疗后通过Jaccard距离测量的个体之间微生物组组成的平均差异立即显著增加(基线时为0.57，3个月时为0.61，P=0.047，Wilcoxon秩和检验)，但在停用阿莫西林9个月后，微生物组谱收敛到基线水平(图2d)。随着时间的推移，安慰剂组的微生物组差异没有显著增加。总的来说，由于长期的阿莫西林暴露，微生物组的整体组成多样化，并且这种影响持续时间较短。

最后，我们探讨了治疗对个体微生物分类群的影响。与上述丰富度和组成变化的结果一致，低丰度物种之间存在显著差异。在物种水平上，与基线(LEfSe)相比，众所周知的短链脂肪酸(包括丁酸盐)生产菌在暴露于阿莫西林后立即显著减少，如Roseburia inulinivorans、Ruminococcus torques、Lachnospira pectinoschiza、Ruminococcus lactaris、Veillonella atypica和Blautia obeum。最近发现的“健康肠道”标志细菌(即Oscillibacter sp. 57_20)在停止治疗后丰度差异性降低。这些物种中的大多数属于厚壁菌门和梭菌纲(Veillonella atypica除外)，是正常肠道微生物组的一部分。它们在维持人体肠道内稳态、炎症和氧化应激方面起着至关重要的作用。但在处理后9个月，除Lachnospira pectinoschiza外，其余物种几乎恢复到基线丰度水平。相比之下，与整体肠道健康不良相关的两个物种(即Clostridium bolteae和Clostridium bolteae CAG 59)在大多数暴露于阿莫西林的个体中增加，并在12个月采样时间点恢复到基线水平(图1c)。然而，我们还观察到安慰剂组中一些患者(12人中有4人)的C. bolteae CAG 59比例增加，而C. bolteae没有。总体而言，安慰剂组的微生物组组成保持稳定，因为没有其他微生物类群随着时间的推移而显著增加或减少。

图2. 阿莫西林对粪便微生物群多样性和组成的影响。

(a)小提琴图分别使用Chao1(丰富度;左)和Shannon指数(均匀度;右)测量并比较阿莫西林组和安慰剂组的物种α多样性。***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。(b)基于中心对数比(clr)变换物种丰度矩阵的主成分分析。每个点代表单个样本的细菌微生物组。不同的符号表示不同的治疗组；颜色表示不同治疗组的不同时间点。椭圆表示95%置信区间(CI)。(c)基线与其他时间点(即3个月和12个月)之间微生物组组成的差异。(d) β-多样性箱线图显示每个治疗组内同一时间点个体间微生物组谱Jaccard差异的分布。每个点是同一时间点组内两个样本间的比较。统计显著性：配对Wilcoxon检验：*P<0.05、**P<0.01 和***P<0.001。  

2 长期阿莫西林治疗后肠道耐药基因组丰度和多样性的长期变化

使用鸟枪法宏基因组数据，在所有研究受试者的粪便微生物组中检测到147个通过5种耐药机制对15类抗生素产生耐药性的独特ARGs。四环素(平均64.59%; SD 18.47%)、β-内酰胺类(平均14.10%; SD 13.45%)、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素(MLS)(平均12.48%; SD 13.40%)、氨基糖苷类(平均1.78%; SD 6.35%)和多药耐药(平均2.36%;SD 6.35%)是样本中最丰富的ARGs类别，其中tetQ、tetW、tetO、cfxA、mef(En2)和ermF基因构成了这些类别中的大部分排列(图3a)。在基线时，阿莫西林组中总AMR丰度低于安慰剂组。值得注意的是，阿莫西林治疗后总AMR丰度随着时间的推移而显著增加，这表明抗生素治疗可能富集微生物组的AMR决定簇(图3b)。在3个月的时间点，这种丰度的增加与耐药基因组中ARGs的α多样性均匀度(Shannon)的增加相对应(LME：adj P=0.02)，在治疗后9个月仍显著升高(LME：adj P=0.01)。阿莫西林暴露后ARG丰富度(Chao1)也出现类似增加，但趋势没有统计学意义。相比之下，随着时间的推移，安慰剂组的总ARG丰度和α多样性指标没有显著差异(图4a)。

图3. 阿莫西林暴露后β-内酰胺类和总AMR基因丰度增加。

(a)箱线图显示所有样品中抗生素耐药基因(ARG)类别的相对丰度，按治疗组和时间点分层。(b)小提琴图显示每个样品(以点表示)的总AMR基因丰度水平，按治疗组和时间点分层。图顶部的黑色水平线连接各治疗组内具有统计学意义的不同时间点(adj P值：***P<0.001，**P<0.01; *P<0.05)。

图4. 阿莫西林对粪便ARG多样性和组成的影响。

(a)小提琴图显示分别使用Chao1(丰富度;左)和Shannon(均匀度;右)指数测量并比较阿莫西林组和安慰剂组随时间点变化的ARG α多样性。使用LME混合效应模型和Tukey HSD事后检验计算校正后的P值。***P<0.001，**P<0.01；*P<0.05。(b)使用基于clr变换的ARG计数丰度矩阵的主成分分析(PCA)分析β多样性。每个点代表单个样品，图形表示治疗组，根据不同的时间点和组别着色。椭圆表示95%置信区间(CI)。(c)比较基线和其他时间点(即3个月和12个月)阿莫西林组(红色)和安慰剂组(蓝色)样品之间通过Bray-Curtis差异测量的ARG β多样性。(d)治疗组内同一时间点患者间耐药基因组(ARGs) Bray-Curtis距离的分布。通过配对Wilcoxon检验检验两组时间点之间的统计学差异，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

与微生物组类似，β多样性PCA图也表明不同个体之间的变异(个体间变异)是影响耐药基因组组成的最主要因素(PERMANOVA：R2=0.82，P =0.0001; nperm=999)。此外，耐药基因组的个体间变异性甚至高于微生物组组成，在有限数量的参与者中存在大多数ARGs。同时在安慰剂组和治疗组中均未观察到明显的耐药基因组谱随时间变化的模式(图4b)。然而，当考虑到个体间的显著差异时，使用Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析显示，在阿莫西林暴露3个月(PERMANOVA: Bray:R2=0.072; P=0.046; strata=Patient)和12个月(PERMANOVA: Bray:R2=0.074; P=0.01; strata=Patient)后，整体耐药基因组组成发生了显著变化。此外，在阿莫西林暴露后观察到的组成差异(Bray)更高且持续时间更长，在12个月时与安慰剂组相比仍具有统计学意义(图4c;Wilcoxon秩和检验)，揭示了抗生素治疗后耐药基因组组成的持续多样化。还发现阿莫西林暴露与通过ARGs个体化选择的长期耐药基因组多样化有关，因为个体之间耐药基因组的组成差异随着时间的推移显著增加(图4d)。当考虑ARGs是否存在而不是丰度时，在阿莫西林治疗组中观察到类似的耐药基因组差异。相比之下，基于Jaccard距离，安慰剂组的耐药基因组组成在3个月时显著收敛。随着时间的推移，安慰剂治疗的个体中没有检测到基于Bray-Curtis距离的耐药基因组组成的显著差异或收敛。因此，在耐药基因组谱中观察到的这些长期变化可能是由药物特异性选择引起，而不是由微生物组谱中的短期变化所引起。

对肠道耐药基因组AMR决定因素的进一步调查揭示了ARG类别水平上对阿莫西林治疗的共同靶向反应。与治疗直接对应的类别(即β-内酰胺类)在阿莫西林组中的丰度显著增加。即使在治疗结束9个月后，这种效应仍然存在(图5a)。此外，与阿莫西林治疗后的基线相比，多重耐药类的平均相对丰度增加了四倍以上(log2 FC>2)，而在阿莫西林组和安慰剂组中观察到其他几种ARG类别的相对丰度随时间的推移增加了3倍。因此，这写变化与抗生素治疗无关。在基因水平上，阿莫西林干预后β-内酰胺酶ARGs丰度或出现的个体间差异很大(图5b)。抗生素最一致的效果是，在8名阿莫西林暴露的受试者中，5名受试者在3个月时cfxA β内酰胺酶及其基因变异(cfxA2、cfxA3、cfxA4和cfxA6)的丰度增加了三倍。在治疗后9个月这些基因的丰度仍高于基线水平。这些cfxA β-内酰胺酶家族耐药基因常见于多种细菌属中(包括拟杆菌属)，并与青霉素和头孢菌素耐药性有关。值得注意的是，阿莫西林患者中拟杆菌属物种的相对丰度显著增加，表明拟杆菌可能携带cfxA基因。类似地，另一种临床相关的β-内酰胺酶ARG(即编码头孢菌素耐药性的cepA)在患者摄入抗生素后立即富集，当其含量高于基线检测水平时(8名患者中的4名)。此外，我们在三名患者中发现抗生素使用后ampC型β-内酰胺酶ARGs(ampC、ampC1和ampH)的丰度或诱导增加。它们的相对丰度模式与大肠杆菌一致，已知大肠杆菌是携带这些ARGs的微生物宿主。此外，我们在一名受试者(P17)中检测到几种TEM β-内酰胺酶ARGs(TEM-70、TEM-168、TEM-105、TEM-171、TEM-183、TEM-205)，这些ARGs最初无法检测到，并且在抗生素暴露后(3个月)立即选择更高的丰度，在抗生素停药后恢复到较低水平。这些TEM-基因可能是临床相关的ARGs，因为它们对常用抗生素(包括青霉素和头孢菌素)具有耐药性，并且已知它们是具有超广耐药谱(ESBLs)的β-内酰胺酶的前体。此外，P18患者在3个月时观察到另一种具有临床意义的金属β-内酰胺酶ARG(ccrA)(编码对超级抗生素(即碳青霉烯类)的耐药性)的丰度增加了五倍(图5b)。

最后，Procrustes分析显示，安慰剂组和阿莫西林组的耐药基因组组成(ARG水平)与微生物组(物种水平)显著相关，表明微生物群落组成决定了人类肠道中的ARG分布。但安慰剂组的总体相关性更强。更重要的是，与阿莫西林组的治疗后样本相比，基线具有更紧密的相关性，这支持了其他因素(如抗生素暴露)可能独立于微生物组影响耐药基因组变化的假设(图5c)。

图5. 阿莫西林对β-内酰胺类ARGs丰度的影响以及微生物组与耐药基因组组成之间的关联。

(a)小提琴图显示β-内酰胺类ARGs的相对丰度，按治疗组和时间点分层。使用单因素方差分析评估丰度变化，***P<0.001，**P<0.01;*P<0.05。(b)热图显示了在阿莫西林暴露患者中鉴定的β-内酰胺类ARGs的对数转化RPKM相对丰度。x轴显示按受试者分层的不同时间点的所有样本。(c)使用Hellinger转化和PCoA排序对阿莫西林组(左)和安慰剂组(右)的耐药基因组组成(填充三角形)和物种组成(填充圆圈)进行Procrustes分析。根据两组的采样时间点对点进行着色。连接两点的线的长度表示同一样品中微生物组和耐药基因组组成之间的差异程度或距离。

3 人类肠道菌群中抗生素耐药库的功能表征

为了从功能上研究耐药基因组，包括肠道微生物组中传统AMR数据库未检测到的ARGs多样性，我们在鸟枪法宏基因组学基础上用功能宏基因组补充分析。构建的功能文库共包含~14.7 Gb宏基因组DNA，文库大小分别为6 Gb(基线)，4.4 Gb(3个月)和4.3 Gb(12个月)，平均插入片段大小为1.5 kb。在筛选的14种抗生素中发现8种有耐药性。重要的是，被测试的包括美罗培南、多粘菌素和替加环素的超级抗生素中，我们并未发现任何耐药转化株。这些抗生素被认为是抵御多药耐药微生物(MDROs)感染的最后一道防线。此外，由抗生素处理的成年个体粪便构建的文库均未检索到环丙沙星、头孢西丁或庆大霉素耐药性。在42个选择中，24个产生了具有抗生素耐药的大肠杆菌转化株，其中19个成功测序。平均而言，我们组装了3082个长度大于500 bp的contigs，在这些contigs中预测了4083个ORFs。在使用多个AMR数据库对ORFs进行分层注释后，总共有1089个完整序列被分配到抗生素耐药性功能中，代表599个独特序列。这些功能性发现的ARGs包括多种β-内酰胺酶类(主要是A类，无C类)、转录调节因子、多药外排泵、转运蛋白、乙酰基转移酶、转氨酶、耐药性调节剂、氨基糖苷类修饰酶和四环素耐药蛋白等。大多数功能性ARGs(89.31%)是通过Resfams-full数据库注释的，该数据库包含额外的可导致抗生素耐药性的特定AMR基因的HMM谱，例如乙酰基转移酶、AraC转录调节因子和ATP结合盒(ABC)外排泵。

这些功能选择的ARGs与CARD和AMRFinder-Protein数据库的平均同一性为35.8%(中位数33%)，与NCBI非冗余蛋白质条目的平均同一性为98.1%(中位数为100%)(图6a)。这表明虽然我们选择的大多数功能鉴定的ARGs与先前测序的蛋白质相似，但这些ARGs在目前的AMR数据库中非常罕见。有趣的是，在涵盖不同栖息地和环境的大规模研究中，我们还发现几个功能鉴定的基因已经在NCBI数据库中被注释为ARGs，但没有用类似的方法(基于HMM)进行功能表征。这些功能ARGs的预测微生物宿主主要是拟杆菌目的共生细菌(图6b)。在人类肠道微生物组中检测出这些可作为ARGs潜在宿主的共生拟杆菌并不奇怪，这与目前对拟杆菌目作为ARGs的贩运者和多产宿主的认知一致。此外，我们将未培养的细菌确定为这些ARGs(11个ORFs)的最大潜在宿主之一，这表明即使未详细表征的未培养生物也可以成为肠道微生物组中ARGs的重要来源。

图6. 使用大肠杆菌作为替代宿主的功能宏基因组筛选表明阿莫西林暴露患者中富集的肠道耐药基因组。

(a)所有功能鉴定的ARGs及其在CARD/AMRFinder中的热门序列以及与NCBI非冗余蛋白质数据库中热门序列的氨基酸同一性。(b)基于NCBI非冗余蛋白质数据库中的最大同一性BLAST序列，水平条形图显示了功能选择ARGs的前20个最常见预测宿主。(c)推定的新ARG对产生A类β-内酰胺酶的大肠杆菌pZE21转化株和无插入物的大肠杆菌pZE21的最低抑菌浓度(MICs)。(d)功能选择的ARG与可移动遗传元件的共线性。  

随后我们研究了阿莫西林摄入量对功能性ARGs流行率的影响。为避免测序宏基因组中ARGs丰度水平的假阳性和过度膨胀，我们仅将使用Resfams-core数据库识别的ARGs映射到鸟枪法数据。我们注意到与鸟枪法宏基因组学类似的模式，即接受治疗的受试者肠道微生物组中功能性ARGs的丰度存在高度的个体间差异。在治疗组和安慰剂组中均有发现这些ARGs。阿莫西林治疗后功能性β-内酰胺酶类的丰度略有增加，但与鸟枪法宏基因组数据不同，这些变化没有统计学意义。而安慰剂组没有发现这种趋势。

本研究还在抗生素治疗患者的肠道微生物组中发现了至少13种假定的新型ARGs。在已知的AMR序列数据库中未检测到其中8个ARGs的同源序列。基于AMR(CARD，AMRFinder)和NCBI非冗余蛋白质数据库注释的假定新型ARGs列表见表2。通过其在大肠杆菌中的表达，我们实验性地进一步验证了一种假定的A类β-内酰胺酶抗性蛋白，该蛋白与丝氨酸水解酶的氨基酸同源性为100%，与已知β-内酰胺酶耐药基因(CARB-11)具有38%的同一性。结果表明，这种新型ARGs对羧苄青霉素具有耐药性，与对照组相比，其最小抑菌浓度(MIC)增加了400倍以上。对于阿莫西林，我们发现MIC值增加了约108倍(650 μg/ml)。它还显示出对其他青霉素(如青霉素G和哌拉西林)的敏感性降低了16至30倍。这些都是A类羧苄青霉素水解β-内酰胺酶(CARB型)的典型特征(图6c)。

为突出肠道微生物组内ARG水平转移的潜力，我们探索了组装contigs中移动遗传元件的存在(与ARGs同步)。总contigs中4.43%编码了假定的移动遗传元件。在所有抗β-内酰胺类抗生素的选择中都观察到这一结果，常见于青霉素、阿莫西林和哌拉西林的选择中，但在头孢他啶选择中也有少量。但抗生素的治疗确实出现了差异。在我们的功能宏基因组数据中，抗生素治疗后选择的假定MGEs负荷明显高于基线选择(成对Wilcoxon检验)。有趣的是，这些治疗后选择具有最多的假定MGE相关注释，尽管测序序列和输入文库较低。与AMR基因共定位的MGEs由于其易于传播而受到广泛关注。我们回收了一种功能鉴定的A类β-内酰胺酶类ARG，与青霉素(阿莫西林、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸)和头孢菌素(头孢他啶)中选择的质粒元件共定位。这种具有超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)典型特征的ARGs可以在耐药性传播中发挥关键作用(图6d)。这些结果都强调了功能宏基因组学作为一种不依赖培养和序列无偏的方法进行耐药基因组表征的有效性。

表 2. 假定的新型功能性ARGs。

讨论

本研究探讨了长期阿莫西林暴露对人体肠道微生物组和耐药基因组的生态副作用。我们发现，在相对健康的人群中长期使用阿莫西林治疗对微生物组组成有更明显但短暂的影响。这与其对耐药基因组的影响形成鲜明对比，在治疗停止后耐药基因组的变化持续很长时间。抗生素耐药基因的富集主要针对β-内酰胺类抗生素，包括与超广谱(ESBL)和抗碳青霉烯类药物作用相关的β-内酰胺酶基因的富集。

据报道，短期阿莫西林干预对肠道微生物组平衡的扰动对微生物组组成的影响轻微或没有显著影响。本研究结果表明，与短疗程相比，长期使用阿莫西林会产生严重的副作用。我们发现阿莫西林对微生物组具有共同且可重复的影响，在丰度较低的物种中观察到最显著的变化。其中包括已知的短链脂肪酸(特别是丁酸盐)生产菌，在抗生素治疗结束后显著减少。相反，具有β-内酰胺类耐药性的细菌属拟杆菌属在阿莫西林治疗后系统性增加。此外，我们验证了先前的研究结果，即β-内酰胺或抗生素诱导生态失调的潜在标志物(即L. bolteae)在阿莫西林治疗后显著富集。在治疗过程中，我们还观察到近期发现的健康相关物种的消耗，即Oscillibacter sp. 57_20。对微生物组组成的影响是短暂的，因为微生物组在阿莫西林治疗后9个月恢复到治疗前的水平，这可以通过群落恢复力来解释。尽管这种微生物紊乱是短暂的，但它也可能产生与健康相关的负面后果，例如对复发性艰难梭菌感染的易感性增加，这对已经存在微生物组失调(患病)的患者可能更不利。

此外，本研究还强调阿莫西林暴露导致基线和治疗后样本之间的微生物组差异在短期内显著增加。这种多样化背后的可能原因是患者基线微生物组组成的巨大差异，这可能导致抗生素扰动的不同水平严重程度和脆弱性。个体间变异对微生物组应答的影响在耐药基因组中尤为明显，耐药基因组对阿莫西林反应的个体间变异高于微生物组。这种差异可能反映了大多数ARGs具有个体特异性，而微生物分类群在患者中更为保守。与本研究结果一致，评估短期抗生素治疗的耐药基因组研究也报告了对抗生素干预的个体化反应。值得注意的是，未服用阿莫西林的患者微生物组和耐药基因组多样性和组成随时间推移没有显著变化，从而证实了健康成人肠道微生物组的稳定性、恢复力和稳健性。

全宏基因组测序与功能宏基因组的互补能够更广泛地表征宏基因组中的耐药性决定因素。功能宏基因组学不仅提供了微生物群落中存在的ARGs的功能信息，还能够发现新型ARGs。该技术利用异源宿主(例如大肠杆菌)，通过文库克隆进行基因表达，这是一个允许从未培养的细菌中鉴定ARGs的强大优势。我们发现功能鉴定的ARGs的最大潜在宿主之一包括一种未培养的细菌，以及众所周知的优势(通过鸟枪法宏基因组学鉴定)拟杆菌属和普雷沃氏菌属物种。尽管我们在功能筛选中没有发现对超级抗生素的耐药性，但全宏基因组测序检测到了一些抗生素，突出了两种方法的互补性。我们还在阿莫西林治疗患者的肠道微生物组中发现了几种假定的新型ARGs(1个经过功能验证)，其中大多数是在治疗后文库中被检测到。最后功能宏基因组数据中检测到MGEs介导ARGs(共定位)的传播，强调了人类肠道微生物组中可移动耐药基因组存在的可能性。有趣的是，大多数假定的MGE相关注释都出现在治疗后样本中，这表明长期阿莫西林治疗可能具有额外的附带效应。

小治疗组规模限制了我们结论的普遍性，并且难以在人群水平上辨别显著关系，这主要是由于我们数据中的高个体间变异性以及对抗生素的个性化反应。尽管如此，我们通过在治疗前和治疗后的比较中使用个体作为对照，严格控制了这种变异性。此外，在抗生素给药前和给药期间，额外的采样时间点可以更好地了解人类肠道微生物组随时间变化的动态和自然变化。功能宏基因组学用于补充全宏基因组分析的耐药基因组信息。虽然它提供了基于表型表征的宝贵信息，但由于抗生素的明确类别和用于革兰氏阳性表达的有效克隆系统的缺乏，这种方法的应用范围仍然有限。此外，与ARGs共定位的移动遗传元件的分离在技术上受到限制，因为功能选择中的DNA片段(插入片段)较小，因此关于功能性ARGs遗传背景的信息很少。尽管如此，功能宏基因组学是唯一能够鉴定全新ARGs的高通量宏基因组学方法。未来的多中心纵向测序研究将增加采样密度，并辅以使用多宿主系统的功能性宏基因组学分析，将有可能为抗生素管理实践的相关性提供坚实证据。然而调查长期使用抗生素对人类影响的大型队列前瞻性研究需要对益处和风险进行特殊的伦理考虑，只有在极少数情况下才有理由这样做。这些考虑强调了高通量微生物组和耐药基因组分析的关键相关性，这些分析来自我们对相对健康个体的随机试验的独特数据，尽管样本量有限。

综上所述，本研究的结果证明人类成人肠道微生物组和耐药基因组对长期阿莫西林治疗的反应不同。停止使用抗生素后很长一段时间内，AMR丰度和多样性的持续增加以及β-内酰胺类耐药基因的富集(包括通过全宏基因组测序检测到的超级抗生素的耐药基因)突出了与长期抗生素暴露相关的风险。从潜在的获益出发，需要考虑这种风险。目前研究中包括慢性腰痛和Modic变化的患者是挪威一项多中心研究的一部分，该研究显示长期使用阿莫西林对自我报告的残疾、疼痛强度或生活质量指标无显著影响。因此，本研究为反对使用抗生素治疗慢性腰痛和Modic变化的一般建议增加了额外的支持，并强调了将这些风险与其他长期抗生素治疗无益处或益处很小的情况联系起来的重要性。