作者解读丨内蒙古农大: 补充鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9对肠道菌群和免疫有何影响(国人佳作)

编译：九卿臣，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

益生菌在全球市场呈爆炸式增长，公众对于服用益生菌管理健康的意识日益加强，但由于缺乏基于时间序列多组学数据集的系统分析，目前关于食用益生菌是否对非患者有益仍然存在争议。本研究从一所大学招募100名成年人，使用益生菌(Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9，Probio-M9)干预6周，旨在全面评估和了解Probio-M9的有益作用。分别在第0天和第6周采集粪便样品研究肠道微生物和代谢物的变化，采集血液样品研究血清免疫指标的变化，发现尽管益生菌干预对人体免疫、肠道菌群和代谢组的影响有限，但免疫指标和多组学数据之间的关联得到了加强。对肠道微生物遗传变异的进一步分析显示，益生菌的摄入抑制了单核苷酸变异(SNV)的产生。综上所述，本研究结果表明，益生菌产生的影响可能被低估了，它不一定会改变肠道微生物的组成，而是通过加强宿主免疫和共生微生物之间的联系，稳定肠道微生物组的遗传变异来有益宿主健康。

论文ID

原名：Change in the Gut Microbiome and Immunity by Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9

译名：鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9对肠道菌群和免疫的影响

期刊：Microbiology Spectrum

IF：9.043

发表时间：2023.03.13

通讯作者：张和平，张文羿

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1128/spectrum.03609-22

实验设计

本研究招募了100名健康志愿者进行随机、双盲、安慰剂对照的益生菌干预实验，所有参与者被随机分配到安慰剂或益生菌组，确保每一组中男性和女性的数量大致相等。益生菌组的所有志愿者连续6周每天早餐后服用2克Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9(5.0×1010 CFU/d)，而安慰剂组的志愿者每天服用一次相同重量的安慰剂。在基线和干预结束时收集了所有参与者的血液和粪便样本，全血样本用于高级免疫功能测试，检测CBCs和淋巴细胞，其余血液样本检测循环细胞因子。使用QIAGEN DNA Stool Mini-Kit(Qiagen)进行了标准的粪便DNA提取，并在Illumina HiSeq 2500平台对粪便样本进行宏基因组测序，通过从头组装和分箱的方法分析细菌的组成。利用现有的H级UPLC系统和Xevo G2-XS QTOF质谱仪进行色谱分离和检测，完成代谢组学分析。将不同时间点的宏基因组与同一参考SGBs进行比对，以确定服用益生菌导致的单核苷酸变化(SNVs)。  

图1 实验设计图。  

前言

益生菌被定义为活微生物，当给予足够量时对宿主健康有益，是临床上最可行的调节肠道菌群和代谢组的方法之一，并有巨大的潜力成为许多人类疾病的治疗靶点。例如，先前的研究证据表明，通过食用益生菌调节肠道菌群和微生物代谢物有利于缓解慢性疾病、改善超重和肥胖、延迟非酒精性脂肪肝、治疗胃肠道疾病、调节神经系统疾病、减少主观压力、提高免疫力、防止氧化应激和炎症以及预防抗生素诱导的艰难梭菌感染。

然而，关于服用益生菌是否预防疾病和改善非患者生活质量的争论多年来一直在进行。虽然先前的研究支持益生菌可以增强免疫力，减少普通感冒发病率、持续时间和症状，但益生菌对非患者的免疫系统和胃肠症状的影响是有限的。益生菌影响宿主免疫系统的一种方法是通过肠道菌群分解代谢产生微生物代谢。例如，功能宏基因组学研究已经确定了宿主促炎细胞因子与微生物色氨酸和棕榈油酸代谢途径之间的联系。以往的研究表明，肠道菌群和代谢物激活宿主免疫系统，从而增加内分泌肽的表达，促进宿主代谢稳态。此外，对肠道菌群中稳定和可变遗传成分的表征对于进一步理解肠道菌群在人类健康和表型变化中的作用至关重要，这在益生菌中很少被研究。因此，由于以往的研究缺乏对客观免疫指标和时间序列多组学数据的系统分析，仍然需要全面评价肠道菌群的作用、微生物代谢物的变化及其遗传结构的变异在食用益生菌有益效果中的作用。

为了解决上述问题，我们在中国招募了100名成年志愿者，并将他们随机分为两组。然后给予 Probio-M9 (5.0×1010 CFU/d)干预6周，试图探索其如何影响人类肠道菌群、肠道代谢组、宿主免疫反应及其基因组结构的变异。因此，我们使用在试验开始和结束时收集的血液和粪便样本，测量了免疫功能测试、宏基因组测序和代谢组学分析。通过分析本研究的时间序列多组学数据，首先发现益生菌摄入对人体免疫和肠道菌群组成的影响有限，但可以将肠道菌群和代谢组进行关联。接着进一步探索多组学数据与人体免疫之间的关系，发现在益生菌干预期间多组学数据与免疫之间的关系发生了改变，我们通过分析肠道菌群的基因组变异(如单核苷酸变异，SNV)来解释这种改变，并在益生菌干预期间发现了肠道菌群中被抑制的SNV。本研究强调了食用益生菌对人类免疫和肠道菌群间的联系以及SNV的产生方面被低估的影响。具体来说，我们发现Probio-M9在加强免疫和肠道菌群的关联以及稳定非患者肠道菌群的基因组成方面具有突出的表现。

结果

1 参与者

为了定量探究益生菌的影响，我们从内蒙古农业大学招募了100名成年志愿者。受试者的年龄和体重指数(BMI)分别为21-41岁(平均年龄26.13)和18.51-29.98(平均年龄22.10)。所有参与者均可自我报告无疾病，并经免疫功能测试验证无炎症症状。此外，所有参与者都没有饮食限制，并且在校园的同一食堂用餐超过5天。然后，志愿者按性别随机分配到安慰剂组或益生菌组，以确保每组女性和男性的数量相等(安慰剂组20名男性和30名女性，益生菌组21名男性和29名女性)。在干预开始时，两组间的年龄和BMI均无显著性差异(t检验，年龄P=0.133，BMI P=0.068)。在益生菌干预结束时，每组有5人脱组，因此总共有90名参与者(每组45名)被纳入最终分析。最后，在基线和干预结束时采集180份全血样本和180份粪便样本，进行基于全血的高级免疫功能测试，包括全血细胞计数(CBC)、淋巴细胞和循环细胞因子(表S1)、全宏基因组测序(WMS)和代谢组分析(粪便)。

2 益生菌摄入对人体免疫力的影响

为了检测粪便中Probio-M9的存在，我们将其参考基因组加入Kraken2数据库并进行图谱分析。我们发现益生菌组的Probio-M9明显高于安慰剂组(图S1)，表明其对干预组志愿者的有效性。为了探讨益生菌摄入对人体免疫的影响，我们首先比较了两组患者在干预开始和结束时的高级免疫功能测试结果(图2a)。通过使用UMAP对69个免疫指标(表S1)的比较，我们发现两组在基线(Permanova检验，P=0.486)和试验结束(Permanova检验，P=0.858)时没有显著差异。此外，两组间干预期间免疫功能测试结果的变化比较均不显著(Permanova检验，P=0.209，图2b)，这表明在六周的干预中，益生菌对整体人体免疫的影响有限。

然后，我们试图通过进行差异丰度分析来调查69个免疫指标中是否有指标在试验期间发生了改变，例如，我们比较了来自同一个体的两个时间点之间的免疫指标，然后过滤掉随着时间变化的指标。在细胞因子中，与安慰剂组相比，Eotaxin、IL-1α、IL-8、MCP-1和RANTES分别增加了15.48%(P=0.001)、39.61%(P=0.006)、31.06%(P=0.013)、8.94%(P=0.013)和23.95%(P=0.014)，而TNF-β在益生菌干预后降低了38.58%(P=0.001)(图2c)。然而，在CBCs中，我们没有发现益生菌组的任何显著变化。相反，安慰剂组Eos #、Eos %和Mon #降低了18.32%(P=0.008)、11.86%(P=0.015)和5.77%(P=0.041)，P-LCC和P-LCR增加了5.67%(P=0.006)和5.57%(P=0.003)(图2d)。对于淋巴细胞，我们仅发现在益生菌组中与CD3+CD8+有一个显著差异(增加4.45%，P=0.016)(图2e)。总之，尽管有12个免疫指标在益生菌干预期间发生了改变，但这些指标的变化幅度显示免疫力有轻微的变化。

图2 高级免疫功能测试结果的比较。

(a)高级免疫检测结果的UMAP基于69项免疫指标。益生菌组(浅黄色和橙色)和安慰剂组(浅蓝色和绿色)在干预开始或结束时的差异不显著。(b)在干预期间69项免疫指标变化的比较(如UMAP所示)中，未检测到显著信号。绿点表示安慰剂组个体内部指标的变化，橙色表示益生菌组个体内部指标的变化。(c)两组不同时间点差异细胞因子的比较。(d)两组不同时间点差异CBCs的比较；(e)两组不同时间点差异淋巴细胞的比较。显著性水平：P<0.05(*)，P<0.01(**)，P<0.001(***)；NS(不显著)。(原文图1)  

3 肠道菌群和代谢组的微生物多样性不受影响  

先前研究证明α多样性与健康的肠道菌群有关，并在许多疾病中都发现了肠道菌群中β多样性的改变。这使我们能够在益生菌干预基线和结束时比较肠道菌群和代谢组的α和β多样性。

对于α多样性(图3)，益生菌组细菌组成的Shannon指数、真菌组成和微生物功能在经过六周干预(物种水平的分析结果表S2)后保持不变(基线和终点，P=0.640、0.746和0.401)。虽然在干预期间，两组的代谢物Shannon指数都有所下降(安慰剂组和益生菌组基线与终点P=5.684e-14、5.684e-13)，但在试验开始或结束时，两组之间没有显著差异(细菌组成、真菌组成、微生物功能和代谢物的P=0.385、0.542、0.086和0.816)。

图3 α多样性和组内BC差异的比较。

(a)两组在不同时间点的α多样性比较。α多样性分别是通过基于细菌组成、真菌组成、微生物功能和代谢物的Shannon指数来衡量的。(b)比较两组在不同时间点的收敛性(组内BC差异)。蓝色和绿色的盒子表示基线和干预结束时的安慰剂组，而黄色和橙色的盒子表示基线和干预结束时的益生菌组。显著性水平：P<0.05(*)，P<0.01(**)，P<0.001(***)；NS(不显著)。(原文图2)  

对于β多样性，我们通过UMAP进行了可视化比较，发现无论细菌组成(图4a)、真菌组成(图4b)、微生物功能(图4c)或代谢物(图4d)，在基线(P=0.792、0.624、0.501、0.489)或试验结束时(P=0.924、0.868、0.332、0.393)均无显著差异。相反，我们发现时间点对肠道菌群和代谢组的影响比益生菌干预大得多，例如，对于细菌组成、真菌组成、微生物功能和代谢物，时间点的PERMANOVA F值分别为14.61、8.864、12.84、22.02(P=0.001)，而益生菌处理的F值分别为1.042、0.778、1.025、0.887(P>0.05)。为了进一步评估益生菌干预对肠道菌群和代谢组发育的影响，在不同组比较两个时间点之间多组学数据的发育(差异)时，也无显著差异(细菌组成、真菌组成、微生物功能和代谢物的PERMANOVA检验，P=0.559,0.496、0.336、0.609)。综上所述，通过6周的干预，益生菌对肠道菌群和代谢组微生物多样性的影响有限。

图4 在干预期间的β多样性。

多组学数据的UMAP分别基于(a)细菌组成、(b)真菌组成、(c)微生物功能和(d)代谢物的BC差异。时间点或组间(干预)之间的差异由PERMANOVA确定。此外，还比较了两组间(e)细菌组成、(f)真菌组成、(g)微生物功能和(h)代谢物的发育速率，并通过PERMANOVA进行检验。(原文图3)  

4 肠道微生物组和代谢组的紧密收敛  

我们试图调查收敛性(基于Bray-Curtis(BC)的差异)是否受到服用益生菌的影响(图3b)。通过比较益生菌组与安慰剂组的BC组内差异，我们发现：(1)在细菌组成方面，益生菌组内BC差异减少(Wilcoxon符号秩检验，P=0.003)，而安慰剂组无显著变化(P=0.570)；(2)在真菌组成方面，虽然两组BC组内差异均增加，但益生菌组BC组内差异显著低于安慰剂组(Wilcoxon秩和检验，P<0.001)；(3)在微生物功能方面，我们发现两组在基线时BC组内差异相似(P=0.320)，但在干预结束时，益生菌组的BC组内差异显著低于安慰剂组(P=2.0e-04)；(4)对于代谢物，虽然两组BC差异均有所增加，但益生菌组在基线时BC组内差异显著升高(P=0.003)，而在试验结束时未观察到这种显著性。这表明益生菌的干预加强了肠道菌群和肠道代谢组的收敛。

5 益生菌摄入对多组学数据和免疫之间关联的影响

肠道菌群和代谢组的收敛提出了益生菌干预过程中类群和代谢物的变化是否与免疫变化有关的问题。为了解决这一问题，我们首先将个体在多组学数据中的变化与试验期间免疫功能测试结果的变化相关联，然后比较两组之间的显著免疫特征(免疫指标与分类群、功能或代谢物)相关性(由Spearman系数< 0.05定义)，并去除两组中发现的相同相关性。我们发现，91.0%(81.8%)的细菌组成、37.1%(73.8%)的真菌组成、93.5%(96.5%)的微生物功能和90.2%(90.1%)的类群、功能或代谢物数量(比例)与免疫功能测试结果的变化相关(图5，间接影响)，表明益生菌干预在肠道菌群(和代谢组)和免疫之间的发展关系中有很大的影响。此外，对肠道菌群和免疫之间的关联分析显示，与基线相比，试验结束时与免疫测试结果相关的细菌(Wilcoxon秩和检验，P=1.42e-07)和真菌(P=0.046)组成比例更高(数据未显示)。

通常采用差异丰度分析来评估益生菌干预的直接影响和后果。然而，我们发现，由益生菌干预引起的这种直接影响远小于益生菌对肠道菌群和免疫之间关联的间接影响。例如，我们发现两组间差异丰富的类群、功能和代谢物的数量(和比例)仅为18.7%(21.0%，细菌组成)、13.7%(17.6%，真菌组成)、9.3%(0.2%，微生物功能)和30.5%(37.8%，代谢物)(图5，直接影响)，远小于间接影响(图5，间接影响)。这表明，益生菌干预对肠道菌群和代谢组的影响可能被高度低估，因为对多组学数据和免疫之间关联的间接影响超出了常规差异丰度分析的范围。

图5 益生菌干预对肠道菌群和代谢组直接影响和间接影响的比较。

上面的玫瑰图反映了直接影响(例如，益生菌干预诱导的差异丰度类群、功能或代谢物)，而下面的玫瑰图代表间接影响(例如，益生菌干预过程中，其发育与免疫变化显著相关的类群、功能或代谢物)。左面板为受影响特征的数量与所有已识别特征的数量(来自细菌组成、真菌组成、微生物功能和代谢物)之间的比率，右面板为受影响特征的比例。(原文图4)  

6 益生菌的摄入会抑制肠道菌群中SNV的产生

为了进一步了解多组学数据与免疫之间关联改变的机制，我们研究了这种对肠道菌群的间接影响是否通过改变微生物基因组的遗传结构，如微生物基因组中的SNV。首先，使用Bowtie2和SAMtools从每个样本的SGB中识别候选SNV。其次，比较来自同一个体在不同时间点的候选SNV，进一步筛选与时间和干预相关的候选SNV。第三，我们比较了两组之间的时间和干预相关的候选SNV，通过过滤掉与时间相关的SNV，只选择与干预相关的候选SNV(图6a)。我们在益生菌组中发现了11724个独特的SNVs，而安慰剂组包含30903个独特的SNV(表S3)，这表明与安慰剂组相比，益生菌的摄入确实抑制了SNV的产生。

然后，我们将这些独特的SNV与免疫功能测试结果的变化联系起来，以进一步探索益生菌诱导的SNV在肠道菌群和免疫关联中的作用。我们发现，尽管安慰剂组免疫测试结果的变化数量高于益生菌组(2133 vs. 1045)，但益生菌组相关免疫指标的数量更高(46 vs. 56，图6b)。具体来说，只有15个细胞因子(SDF-α、TNF-αMCP-1和IL-10是最相关项)被发现与安慰剂组的629个SNV相关，而益生菌组有365个SNV被发现与27个细胞因子相关(RANTES是最相关项)。本研究还发现了SNV与CBCs在安慰剂组和益生菌组(分别为25和24 CBCs)不同的关联模式，例如，安慰剂组最相关项是血小板分布宽度(PDW)，而巨大未成熟细胞百分比(LIC %)和数量(LIC #)是益生菌组中最相关项。此外，我们在益生菌组(491)中发现了比安慰剂组(393)更多的CBCs相关SNV。两组之间免疫功能测试结果和SNV之间的相关性最显著的差异来自淋巴细胞，例如，安慰剂组的1111个SNV被发现与6个淋巴细胞相关(最相关项是CD3+CD8+和CD3+CD4+)，而益生菌组中只有189个SNV与5个淋巴细胞相关(最相关项是CD3-CD19+和CD3+)。

图6 比较益生菌组和安慰剂组在干预期间产生的SNV。

(a)在安慰剂组和益生菌组中生成SNV的维恩图。交集被认为是时间发展的结果，而不是不同的处理。(b)两组间免疫相关SNV的比较。益生菌组或安慰剂组中独特的SNV与69个免疫指标的变化相关，并通过条形图进行了说明。(原文图5)  

为了在分类结构水平上更好地理解这些独特SNV的生成，我们将这些SNV按其原始物种进行分类，并比较了两组之间前10个SNV丰富物种(表1)。与安慰剂组相比，在益生菌组中发现Agathobacter faecis、Clostridium_Q sp003024715和Gemmiger qucibialis 的SNVs变化最为显著(2022、1818和1432 vs. 60、429和878)。在安慰剂组中，发现Faecalibacterium prausnitzii_G、Roseburia intestinalis、Anaerostipes hadrus、Phascolarctobacterium faecium和Bifidobacterium pseudocatenulatum变化最显著(分别为4385、4045、2781、2090和1561 vs. 112、9、79、1和18)。此外，两组之间的前10个SNV丰富物种存在重叠，如Roseburia sp900552665(1290和1507)、Fusicatenibacter saccharivorans(746和992)、Anaerobutyricum hallii(548和1635)、Blautia_A wexlerae(472和1029)、Blautia_A massiliensis(351和3766)，在两组中都含有相对较高的SNV。值得注意的是，安慰剂组中独特的SNV应该是在不摄入益生菌的情况下产生的，但在益生菌组中被抑制，而益生菌组中独特的SNV是由益生菌干预诱导的，而服用安慰剂无法检测到。综上所述，抑制是益生菌干预对肠道菌群SNV的主要作用，其中Faecalibacterium prausnitzii_G、Blautia_A massiliensis和Roseburia intestinalis是益生菌干预最敏感的物种。

表1 益生菌和安慰剂组中排名前10的SNV丰富物种。  

讨论

2021年，全球益生菌市场规模为581.7亿美元，预计2021年至2030年将以7.50%的复合年增长率增长。然而，由于个体的肠道菌群之间的巨大差异，食用益生菌的好处和可行性在健康个体中仍然具有不确定性，缺乏一个国际公认共识。此外，稳定性对于理解生态失调肠道菌群在人类疾病中的作用至关重要，且微生物遗传变异提供了独立于微生物丰度的额外信息层。但在以往的研究中：(1)主观自我报告量表和问卷主要作为测量方法；(2)高级血液免疫试验和纵向多组学数据很少联合应用提供综合评价；(3)微生物遗传变异很少被评估。因此，迫切需要通过免疫指标、肠道菌群和微生物代谢定量和系统地利用时间序列数据，来了解益生菌对非患者的益处。

功能性免疫系统是宿主对环境病原体、病毒或化学物质有机体健康生存的中心决定因素。虽然与安慰剂相比益生菌干预后人体整体免疫力略有改变，但6个细胞因子如Eotaxin、IL-1α、IL-8、MCP-1、RANTES和TNF-β以及一个淋巴细胞CD3+CD8+ T细胞在正常范围内显著改善，这与之前的研究结果一致，即T淋巴细胞和细胞因子白介素在食用益生菌后被激活。复杂的生态群落通常被认为更稳定且更有弹性，肠道菌群多样性经常被用作人类健康的代表。尽管摄入6周Probio-M9并没有显著影响整个肠道菌群和代谢物，但从多组学的角度来看，它降低了个体的种群异质性。为了更好地理解这些效应对宿主的作用，我们创新性地评估了益生菌的影响，并将它们分为直接影响和间接影响。我们发现益生菌对其他肠道微生物、代谢物和免疫指标的间接影响明显被低估，这是由于Probio-M9调节肠道菌群及其代谢物，并最终影响宿主的免疫系统。

在本研究中，我们发现益生菌干预：(i)对人体免疫或肠道菌群和代谢组的整体结构影响有限，这与以往的研究一致；(ii)可以很大程度上影响多组学数据与免疫之间的相关性，这是常规差异丰度分析无法发现的；(iii)抑制而不是促进肠道菌群中SNV的生成。

据我们所知，当前的研究首次报道了免疫和肠道菌群及代谢组之间被低估的关联变化，以及非患者食用益生菌所抑制的SNV。尽管已经对Probio-M9进行了许多研究(如其分离过程、生化特性、小鼠和小规模人类实验探究其对宿主的有益影响)，但利用从不同时间点收集的多组学数据对Probio-M9进行综合评价，大大弥补了益生菌研究的差距，并显著增加了我们对益生菌有益作用背后机制的理解。然而，本研究也存在一定的局限性，例如，元蛋白质组和元转录组数据没有包括在评估中，这可能导致对益生菌干预诱导的转录和翻译过程的评估和理解缺失。另一方面，血液和粪便样本不包括在干预的中间和冲洗期之后，这可能会提供关于益生菌定植的轨迹和耐药性的细节。

总之，通过证明Probio-M9可以加强免疫和肠道菌群之间的联系，稳定肠道菌群的遗传变异，揭示了食用益生菌被严重低估的影响，为我们全面理解和评估益生菌的功效提供了新视角。