疫苗前沿 | 疫苗佐剂面临哪些难关？Curr Opin Allergy Clin Immunol：解决佐剂作用模式以提高疫苗效力

什么是“佐剂”？   Immunologic adjuvant

免疫佐剂是各种非特异性免疫增强剂化合物的总称。顾名思义，它的作用就是与疫苗结合使用后，非特异性地增强免疫反应的效价、功能、广度和持久性，或改变免疫的反应类型，来增强或改变机体对匹配抗原的特异性免疫应答，但其本身并无抗原性。

1925年，佐剂首次出现在大众视野中，被描述为“与特定抗原结合使用的物质，能够比单独使用该抗原产生更强的免疫力”。免疫佐剂现在广泛地与多种疫苗结合使用，除了可以增强免疫应答外，它还具备降低抗原使用量、高效激活免疫系统、延长效价水平等优点，对提升疫苗诱导机体产生的免疫效果具有重要价值，也是全球疫苗研发中绕不开的焦点材料。

在许多佐剂疫苗获批并应用后，人们发现，佐剂不仅可以增加抗体总滴度，而且可以增强对疫苗抗原具有更高亲和力的功能性抗体的诱导，从而增强免疫反应的持久性，最大限度地减少对反复加强注射的需要。从医疗负担层面来讲，佐剂可以节约使用的抗原剂量，极大地扩大了全球疫苗的供应量。佐剂还可以触发拓展抗体反应，这一优点在应对表现出实质抗原性漂移或变异菌株时令人十分惊喜(图1)。

这些属性突显了佐剂在后疫情时代中的重要性，面临疫苗需求高、全球供应少、抗体效价下降、目前部分获批疫苗对新变种的效力减弱等困境时，佐剂或许是一个突破口。

图1.将佐剂应用于疫苗的原因

缩写：IR，免疫反应；O/W，水包油；HPV，人乳头瘤病毒；HZV，带状疱疹病毒。

蓝色文字标记的是代表性范例

关于佐剂的主要种类和作用，编辑部已经做过详细介绍。我们这次主要来讲讲，免疫佐剂发展至今，还面临着哪些需要解决的难题。

1免疫佐剂的发展

虽然佐剂疫苗成功地增强了对多种传染病的保护性免疫(表1)，但现在广泛认为，目前的佐剂受技术所限，在面对对结核病、人类免疫缺陷病毒（HIV）和疟疾等复杂疾病的病原体时，仍缺乏促生强大和持久的保护性免疫所需的属性。到目前为止，还没有佐剂显示出能够在人类群体中触发针对纯化抗原的终身抗体、CD4+或CD8+T细胞反应，也没有证据表明佐剂激发的CD8+T细胞反应究竟能达到何种水平。

另外，佐剂的限制因素还在于缺乏能够促进广谱中和抗体(Nab)的佐剂，但从某些艾滋病毒感染者分离出来的佐剂，可能是研发针对高突变率病原体的疫苗的成功核心，识别和制造能够促进这种反应的佐剂，将有助于解决疫苗开发中的一个主要瓶颈。显然，发现合适的抗原，实现抗原和佐剂的最佳组合，是取得研发进展的关键。

表1.传染病疫苗的佐剂作用模式

有趣的是，佐剂往往是由它们的功能、而不是它们的材料组成来定义的。佐剂涵盖了从合成小分子和颗粒配方到复杂的天然提取物的各种材料，许多化合物也显示出佐剂特性，然而，很少有化合物真正应用于获批疫苗中。与跟随着科技进步而效率突飞猛进的现代研发过程不同，早期佐剂的发现堪称是“医学史上最缓慢的发明历程”之一。

自不溶性铝盐(明矾)被纳入疫苗以来的近100年间，仅有10种免疫佐剂获得被额外添加入人类传染病疫苗中的许可(表1)。这种延迟可以归因于自身报告及评估记录不充分的风险、明矾之后难以复现的高安全性和高性能化合物，以及人们对佐剂作用机制研究的缺乏。

虽然先天免疫系统对佐剂功能的重要性无需赘述，但人体对非微生物有机佐剂的反应所诱导的促进抗体和T细胞反应的分子和细胞机制，人们的了解也实在有限(表1)。我们需要深入挖掘佐剂参与的天然免疫途径和细胞类型，以及促进持久抗体和细胞免疫反应所需的知识，以充分利用现有佐剂，在未来改进出优良佐剂，发挥出佐剂的真实潜力。

近期，一篇发表在Current Opinion in Immunology杂志的综述，就总结了在阐明佐剂作用模式(MOA)以及促进佐剂理解和发展中的常见困难和潜在解决方案。

2阐明佐剂作用模式的障碍

经验派生的递送系统 

根据佐剂最初感受到的功能，佐剂可大致分为三类：

1 递送系统

如明矾、MF59、佐剂系统03(AS03)、AF03和脂质纳米粒(LNPs)；

2 模式识别受体(PRR)配体

如CpG 1018；

3 组合系统

由递送系统和已建立的PRR配体组成，如佐剂系统01(AS01)、AS04和Aloh im-II。

PRRs诱导的细胞因子反应可塑造适应性免疫反应。根据存在的细胞因子，初始的CD4+T细胞将分化为不同的辅助性T细胞(Th)亚群，这些亚群可以扮演适应性免疫的作用者和调节者的多重角色。例如：

Th1细胞在促进最佳的CD8+T细胞激活和记忆方面发挥关键作用，

滤泡辅助性T细胞(Tfh)在生发中心(GC)的形成和高亲和力抗体的产生、记忆B细胞(MBC)和长寿浆细胞(LLPC)的产生中具有不可撼动的作用。

以小分子免疫增强剂为代表的PRR靶向佐剂，多用于靶向作用于已知可激发先天性免疫反应的特定PRR。相比之下，其他应用于疫苗的递送系统中，多数是基于经验方法开发的。

最初，人们认为联合这些系统可以通过提高对注射抗原的抗体反应、增加抗原摄取，以改善免疫反应。然而，在一步步研究中，人们发现它们还具有促进适应性免疫的风险相关分子模式(DAMP)诱导特性。最新发现的典型是LNPs，这是针对SARS-CoV-2开发的mRNA疫苗中的递送囊泡，它通过一种几乎未知的途径，增强蛋白质和mRNA疫苗的B细胞反应和保护效力(表1)。

可惜的是，追溯和阐明经验性递送系统的MOA是极其困难的，但并非不可能，希望这一障碍能够在日后被攻破。

缺乏体外预测试验

体外和体内数据之间缺乏相关性以及文献记录的不一致等因素，都会阻碍阐明递送系统作用的进程。例如，尽管有几项报告指出，明矾、MF59和AS01可在体外诱导NOD、LRR和NLRP3的激活，但NLRP3在体内的佐剂作用几近于无。在实际情况中，使用卡那单抗（一种抗IL-1β的人类单克隆抗体）后再注射氢氧化铝（明矾）佐剂脑膜炎球菌疫苗的人群，则具有完整的疫苗诱导的抗体反应。此外，明矾在体外并不直接促进树突状细胞(DC)成熟，但它可以在注射部位产生局部免疫刺激环境，其特点是组织损伤和尿酸释放后，通过PRR(s)激活炎症DC。同样的，MF59也并不直接驱动DC激活过程，而是在注射后触发肌肉细胞释放细胞外三磷酸腺苷(ATP)，来促进局部免疫反应。AS01和AS03 也有类似的机制。

这些例子表明，体外单一培养实验过于简单，无法显现注射DAMP诱导佐剂所引发的免疫反应的复杂性。不过凡事无绝对——一种叫“壳聚糖”的阳离子多糖，就通过细胞内DAMPs的内源性释放，促进环状GMP-AMP合成酶（cGAS）、干扰素基因刺激因子（STING）的激活，在骨髓来源的树突状细胞（BMDC）试验中预测其MOA，并通过体内的基因敲除研究得到证实。事实上，BMDC检测准确地预测了疫苗诱导反应所需的壳聚糖的理化特性。因此，如果能够确定注射部位或引流淋巴结处的关键靶细胞，为佐剂定制的体外模型可以为改进佐剂设计提供快速而丰富的手段。当然，壳聚糖似作为一个例外，不应被视为研究规则，未来关于递送系统的MOA研究，也应该摆脱对单一培养试验的过度依赖。

位置和靶细胞可能有所不同 

阐明佐剂MOA的复杂性的道路，可能会因为佐剂涉及触发免疫反应中的多个潜在作用位置和细胞类型而变得艰涩。佐剂的理化性质可以直接促进淋巴结（LNs）中的免疫激活，而非在注射部位中的免疫激活。例如，直径在20-200 nm之间的颗粒，可以通过淋巴管流入LN，随后可以被常驻的抗原提呈细胞（APCs）直接摄取。

相对于迁移性DC，LN驻留的DC在疫苗应答中的作用尚不清楚，但绕过DC从注射部位迁移的要求(根据DC亚群的不同，可能需要16小时至5天)，可能会实现更快的T细胞激活。此外，LNs含有数量更多的DCs，这些DCs更适合于抗原交叉呈递，从而激活CD8+T细胞。

除了DC，更多的LN驻留细胞可以在调节免疫反应中也能发挥关键作用。囊下窦巨噬细胞(SCSMɸs)通过促进滤泡DC上免疫复合体的沉积来促进MF59诱导的抗体应答，AS01诱导的体液和细胞免疫依赖于QS-21诱导的SCSMɸs中caspase-1的激活。此外，自然杀伤力（NK）和CD8+T细胞衍生的干扰素-γ（IFN-γ）对于AS01佐剂疫苗的最佳DC激活和诱导Th1型免疫是必不可少的。

有趣的是，颗粒形式和可溶性形式的甘露聚糖的混合物可以同时靶向外周DC和LN驻留的SCSMɸs。关键在于，这种双重靶向导致增强的佐剂特性，促进诱导具有广泛表位特异性的Nab。据推测，抗原表位的扩散，即识别与初始表位不同的表位的B细胞受体（BCRs）的发展，可能是佐剂与LN驻留B细胞直接作用的结果。

总之，这些观察结果表明，尽管MOA研究困难重重，但广泛靶向周围和/或引流淋巴结的细胞是成功佐剂的一个重要特征，应该在疫苗开发中予以考虑。

复杂的信号级联和佐剂配方的变化

在阐明佐剂疫苗的MOA时的另一个错综复杂之处是，特定的先天免疫反应和信号通路，可能只能解释有着众多反应路径的疫苗诱导免疫中的一条作用路径。例如，明矾诱导的DNA释放促进了T细胞的启动，但在抗体应答中的作用却比较有限，这突出表明了明矾的佐剂作用可能涉及到其他DAMPs（表1）。同样，ATP释放是MF59诱导免疫反应的一个重要因素，但不是唯一因素。

由于信号之间环环相扣的传导机制，且不同研究中使用的试剂缺乏统一性，对DAMPs的应用和研究可谓是“差之毫厘，谬以千里”。众所周知，佐剂配方的变化会对随后的免疫反应产生重大影响，因此临床前研究都倾向于使用与获批疫苗相同的配方。

最近的研究支持这样一个概念：决定佐剂系统效力的是最终疫苗配方的固有特性，而不是单个成分。角鲨烯是水包油乳剂的中心成分，在没有稳定非离子表面活性剂的情况下使用时，没有免疫刺激作用。当可电离脂质被永久性阳离子脂类取代时，LNPs也没有佐剂活性，而根据使用的特定可离子化脂质，LNPs也具有不同的佐剂活性

同样，在脂质体(AS01)中配制的MPL(TLR4配体)和QS-21(皂苷)引起的免疫反应质量，同样的分子配制在水包油乳剂(AS02)中配所引起的免疫反应的质量不同。即使对于TLR9信号等确定的PRR通路，CpG的结构也决定了靶细胞和随后的免疫反应。这些例子突显出，在早期阶段确定佐剂是否能以可批量重复的方式制造，对它进入临床试验究竟有多么重要。

模式识别受体信号特性的影响尚不清楚 

PRR诱导的免疫和非免疫细胞分泌细胞因子是适应性免疫的主要决定因素(图2)。而，AS01和AS03都会触发早期干扰素(IFN)反应，这种反应与增强的CD4+T细胞和抗体反应有关。然而，干扰素的诱导机制可能因佐剂成分的不同而不同(表1)，这提出了PRR途径的特性在适应性反应中的影响几何的问题。对于佐剂，未来应该将目光放在剖析在PRR通路上激发的免疫反应的变化，并探讨是否存在可作为特定免疫反应的最佳选择的特定PRRs/PRRs的组合。

许多观察发现，长时间的有效PRR信号有助于增强免疫反应。已有研究证明，将PRR配体与微粒联系起来已被证明可以延长佐剂的生物利用度和信号传递，并改善适应性反应。作为疫苗的强大助手，佐剂应尽可能诱导强烈和持续的免疫反应，但不能不考虑到，过于强烈的免疫反应可能会导致局部和全身不良反应。人们认为，有针对性地向淋巴结输送佐剂可以帮助避免全身毒性，因此关键淋巴结内的局部和有效的免疫激活可能是解决这类困境的一种方法。

图2.佐剂研究和开发过程中需要解决的关键问题

缩写：PAMP，病原体相关分子模式；Mɸ，巨噬细胞；FRC，成纤维细胞网状细胞；FDC，滤泡DC；NLRs，NOD样受体；RLRs，RIG-I样受体；IL，IL；Ag，抗原。

抗原特性影响免疫反应

抗原抗原的特性对免疫反应的最终结果有深刻的影响，一种抗原具有固有的免疫刺激特性，可以与佐剂协同作用，共同决定先天免疫和获得性免疫的效果和范围。因此，除了单独的佐剂外，获取整个制剂的MOA也很重要。

佐剂诱导的获得性免疫反应可能源于更有效或更持久的抗原传递，而不是先天免疫的激活。与自然急性感染相似的缓释递送系统，延长了抗原暴露时间，提高了抗体反应的水平、质量和持久性。这些发现支持了“累积效应”理论。对于CD8+T细胞反应，初始抗原剂量的大小是关键，而不是暴露的时间。简单来讲，一旦存在促进CD8+T细胞分化的正确的PRR途径、细胞因子和抗原呈递细胞，疫苗中的抗原剂量越多，产生CD8+T细胞就越多。而临床使用的疫苗中的抗原剂量通常采用能够触发抗体反应的最小剂量，这可能会损害CD8+T细胞反应。

物种间差异

在佐剂MOA的研究中，一个无法跨越的鸿沟就是动物和人类免疫系统之间的进化差异。尽管人类与动物模型的免疫系统有着相似之处，但不同之处倒是更多。太多的事例证明，在人类中用佐剂诱导产生CD8+T细胞更具挑战性。尽管许多化合物在动物模型中能得到不错的结果，但真正应用在人类群体中的有效性和安全性实在令人扼腕。

这些差异表明，疫苗开发中需要确认和验证来自人类动物的机械性数据，而且应该尽快开发用于佐剂测试的人体模型。这种差异可能在一定程度上反映出，当前许多实验评估人类的T细胞反应时只关注血液，而忽视了淋巴结或其他外周部位可能存在强大的免疫反应。

细针抽吸(FNA)是一种允许在接种疫苗后对淋巴进行采样的新颖方法，可以纵向表征免疫反应。希望后期能精进以前无法接触到的淋巴结的分析水平，提升对参与佐剂感知和信号传递的细胞和途径的洞察。

系统疫苗学

系统疫苗学彻底改变了人类对疫苗和佐剂的免疫反应的评估。它揭示了I型IFNs在MF59佐剂中的作用的特殊性——虽然MF59诱导的抗体反应在小鼠中似乎与干扰素α/β受体（IFNAR）无关，但I型IFNs与接受MF59佐剂流感疫苗的儿童的抗体反应增强呈正相关。它还阐释多个TLRs以及RLRs在介导黄热病疫苗适应性免疫反应中的作用，表明用佐剂靶向多个PRRs以获得有效的免疫反应的潜在价值。

在流感疫苗接种需求大幅增加的背景下，系统生物学显示早期TLR5的表达是几周后抗体反应的预测因素，从而衍生出“微生物群的鞭毛在流感疫苗接种期间充当内源性佐剂”等假设，以及随后发现微生物群在调节疫苗诱导的免疫反应中具有关键作用。

微生物组可能导致不同年龄、性别和背景的个体对疫苗反应的差异，并突显了疫苗研究中额外的复杂性：佐剂在不同人群中的效价和功能可能不同。这表明，未来的疫苗研究中可能需要针对不同种族、年龄和性别的人提供最适合的佐剂。

研究要点

佐剂可以加入疫苗中，以增强抗原特异性免疫反应的范围、功能、抗体水平和持久性。

从机制上更深入地了解获批疫苗中的佐剂如何调节先天免疫和获得性免疫，有助于推进疫苗研发。

佐剂疫苗研发中面临的挑战，包括佐剂配方的变化、缺乏关于疫苗接种部位、靶细胞和先天信号通路的详细理论。

系统疫苗学提供了一种能使佐剂开发摆脱反复试验并转向合理方法的新思路。

结论  

这篇文献强调了佐剂MOA研究的复杂性，并提出了一系列亟待解决的核心问题，旨在改进现有的佐剂和进一步开发新的佐剂。文中强调了佐剂动力学、抗原剂量和实验模型物种等因素在决定免疫反应的质量和数量方面的影响，并认为临床前试验中一些佐剂系统的失败可能与不理想的抗原特性有关。由于抗原在免疫刺激潜力方面差异很大，且疫苗和佐剂的性质均取决于抗原，所以在机制研究中必须考虑到抗原问题。

文中提到的新兴技术和解决思路，很可能对未来阐明佐剂的MOA、优化当前的佐剂潜力，并指导合理开发新的佐剂，以保护人们免受结核病、艾滋病和疟疾等其他极其危险的病原体的侵害有所帮助。

参考文献  

[1]Lin YANG,Zhe-yan FU,Zheng-bing LV,Jian-hong SHU. Classification and Mechanism of Immune Adjuvant. China Biotechnology, 2019, 39(5): 114-119.

[2]Turley JL, Lavelle EC. Resolving adjuvant mode of action to enhance vaccine efficacy. Curr Opin Immunol. 2022 Aug;77:102229. doi: 10.1016/j.coi.2022.102229. Epub 2022 Jun 29. PMID: 35779364.

撰写 | Vaccine前沿

校稿 | Gddra  

编审 | Hide / Blue sea

编辑  设计 |  Alice

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