疫苗前沿 | 柯萨奇B组病毒：引起心肌炎与1型糖尿病的潜在病毒！盘点它的疫苗研发进展

人类是肠道病毒的天然宿主。肠道病毒可引起多种疾病。在目前的分类系统中，肠道病毒根据表型和遗传相似性按顺序编号，并被大致分为四个类型：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和新发现的EV69、EV70和EV71等肠道病毒。能够影响心血管、胃肠、内分泌、神经肌肉和皮肤系统，造成严重危害的柯萨奇病毒，就是我们这次讨论的主角。

什么是柯萨奇B组病毒      

1947年，在美国纽约哈德逊河小镇柯萨奇分离出来的一种肠道病毒，被命名为柯萨奇病毒。柯萨奇病毒可根据器官嗜性、器官损害和抗原反应，分为柯萨奇A组病毒(CVA)和柯萨奇B组病毒(CVB)。

感染CVA后，最常导致手足口病，迅速表现出发热、口腔溃疡等特征症状，也可导致其他多种急性疾病，所以CVA得到的关注也最多。

CVB病毒常躲在心肌炎等慢性疾病的背后，极其容易被忽略。CVB现已分离出6种血清型(CVB1~6)，几乎所有血清型均与心脏、胰腺、脑和胃肠道相关的疾病有关。多个血清型导致的疾病类型有所重合，例如CVB1、CVB3和CVB5通常与心肌炎的病因有关，而CVB1和CVB4可以加速1型糖尿病(T1D)的发展。遗憾的是，目前还没有针对CVB病毒的有效治疗手段。

不同CVB的致病情况

CVB1：主要与1型糖尿病(T1D)有关，也可导致特征性胸肋痛、无菌性脑膜炎和新生儿败血症；

CVB2：常可以从急性心肌炎、无菌性脑膜炎和急性脑膜炎患者中分离出，可导致多器官衰竭和心源性休克；

CVB3：其感染与心肌炎有关，常导致扩张型心肌病(DCM)和心力衰竭；

CVB4：与T1D的发生有关；

CVB5：与手足口病、无菌性脑膜炎、病毒性脑炎、急性迟缓性麻痹、心肌炎和T1D等疾病有关；

CVB6：相关的感染报告数量不多，但有报告称，合并感染CVB6与CVB5的患者常有急性发热病、皮疹、严重急性呼吸道疾病、脑膜炎、心肌炎和/或心包炎症状。

尽管这些感染都是可以通过非药物干预手段进行初步预防，但目前还没有针对CVB的疫苗，早先未研发CVB疫苗的部分原因是，开发针对血清型的疫苗有些不切实际，而不同的CVB血清型可以影响不同的器官，或可以引起症状相似、严重程度不同的疾病，这种复杂性给疫苗研发前的目标血清型选择带来了挑战。

在近期发表于Vaccines杂志的一篇综述中，分析了已经进入试验测试阶段的疫苗的特征，讨论了不同疫苗的优点、缺点或局限性，以及它们在预防感染以及预防感染后诱发心肌炎和T1D方面的作用。

病毒感染与疾病发病机制

Virus Infection and Disease Pathogenesis /

CVB通常经粪便-口腔途径传播，也可经血行传播感染胎儿，一般流行于夏秋季。感染后，病毒在肠道、上呼吸道内皮细胞和淋巴组织内进行复制，并可能引起特征性传染性胸肋痛（又称Bornholms病）和发热症状，还可伴发脑膜炎、心肌炎、肝炎、溶血性贫血和肺炎等严重疾病。鉴于目前还没有针对CVB病毒的特效抗病毒药物治疗手段，因此通过接种疫苗进行CVB感染预防或许能成为有效的手段。

CVB感染靶细胞时，需要与两个主要受体相互作用：衰变加速因子(DAF)，柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)。其他还有硫酸肝素在内的关键受体。在病理学上，病毒和宿主两方因素都决定了受影响器官的组织损伤。CVB可以通过各种方式显著改变细胞蛋白的结构和功能，引起细胞周期停滞和抑制囊泡运输。而宿主感染CVB后，产生的免疫反应则会攻击携带病毒的组织细胞。在两种作用的共同影响下，机体器官受到“无妄之灾”，产生炎症和组织破坏，进而发生慢性疾病。

CVB的亲嗜性靶器官为中枢神经系统，心脏、血管内皮细胞、肝、胰、肺、生殖器官、骨骼肌、皮肤黏膜等，几乎所有六种CVB血清型都主要攻击心脏、胰腺、脑、肺、皮肤、眼睛和睾丸，其次是肌肉、肝脏、咽部、肾脏和关节(图1)。时至今日，虽然尚不清楚不同血清型的CVB是如何导致不同的器官特异性疾病的，但已有许多研究陆续报告了CVB引起心肌炎和胰腺炎/糖尿病的作用机制。

图1.受人类不同血清型的CVBs影响的器官。

影响各种器官的血清型在每个方框中用颜色编码。

红色文字表示比其他血清型（蓝色和绿色）更经常检测到的血清型，黑色文字表示没有这种差异。 

CVB感染与心脏疾病

CVB Infection and Heart Disease/

在多种类型的心脏病中，心肌炎是诱发儿童和青少年心力衰竭的主要原因之一，也是竞技运动员死亡的第三大原因。据估计，全球心肌炎患病率在10.2/100,000至105.6/100,000之间，截至2017年，每年约有180万新发病例。大多数心肌炎患者无明显症状，疾病会自发消失。但高达30%的受影响人群可能发展为长期慢性疾病，导致扩张性心肌炎。

心肌炎的诱因涵盖各种感染性和非感染性因素，最常见的可疑因素就是病毒。北美和欧洲早先分别发现，肠道病毒和腺病毒与病毒性心肌炎有关，最近，越来越多的数据表明，人类疱疹病毒、微小病毒B19其他病毒以及冠状病毒，特别是横行三年之久的SARS-CoV-2病毒，也可能诱发心肌炎。

鉴别心肌炎的病毒诱因的主要挑战，就是在临床中表现为心肌炎/扩张型心肌炎患者中，正确鉴别致病的病毒颗粒，病毒特征可能是确定病毒颗粒种类的关键点。一项对心肌炎/扩张型心肌炎患者的研究显示，近50%的DCM患者中在血清学诊断中发现了CVB反应性抗体，而高达70%的患者可以检测到肠道病毒基因组物质。这表明CVB及其涉及的心脏抗原的自身免疫反应，可能是触发心肌炎/DCM的重要因素。

CVB感染与1型糖尿病

CVB Infection and T1D/

糖尿病已经成为全球的主要健康问题。2021年，全球糖尿病新发病率约为5.37亿，发生在约全球9%的成年人中，预计到2030年将增加到6.43亿，其中1型糖尿病（T1D）的发病率为9.5%。美国疾病控制中心估计，大约有3700万美国人(约占美国人口的11.3%)患有糖尿病，其中近190万20岁以下的儿童和青少年患有T1D。

在可能引发T1D的各种类型的病毒中，CVB1和CVB4两种血清型通常与T1D的发生有关，这两种CVB病毒的血清学研究、病毒恢复机制和病毒对患者基因组的聚合酶链式反应的影响分析均证明了这一点。CVB导致的T1D可见于无T1D家族史群体中；2型糖尿病(T2D)可与T1D共存，1、2型糖尿病共存患者的肠道病毒水平均高于对照组。

诸多研究已经证实，CVB感染是心肌炎/扩张性心肌炎和T1D的高危因素，因此通过接种疫苗进行预防，或许有望会降低这两种疾病的发生率。

CVB疫苗的现状

Current Status of CVB Vaccines/

过去的两个世纪中，减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、病毒和细菌载体疫苗以及核酸疫苗等多种类型的疫苗陆续推出，其中有多种类型已经进入了用于开发针对CVB感染的疫苗试验(图2)。由于CVB3感染可持续在易感小鼠品系中诱导出心肌炎和胰腺炎，故CVB3感染模型已被用于CVB疫苗研发研究中测试疫苗的有效性。所以，我们会着重讨论与CVB3相关的每种疫苗研发的方式特点，随后再详细讲述其他血清型的疫苗研发情况。

图2.在临床前模型中测试的各种CVB的实验性疫苗。

大圈外大写文字所示的几种疫苗已经过各种临床前模型中的疗效评估。

虽然针对CVB3的疫苗已经通过使用所有指明的方法进行了测试，但灭活疫苗已经针对所有六个CVB血清型进行了测试，而VLP疫苗只针对CVB1、CVB3和CVB5进行了测试。

各类CVB疫苗的研究汇总详见表1。

表1.用于各种CVB血清型的疫苗的效力。 

1. 改良减毒活疫苗（MLVs）

MLVs的主要优势是能够诱导体液和细胞介导的免疫(CMI)反应，主要产生可高效消除既定感染的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。针对CVB的MLV是通过在各种细胞系中连续传代病毒或在结构蛋白中引入突变而生产的。如表1所示，一种命名为p14V-1的CVB3疫苗株，就是在皮肤成纤维细胞中连续传代14代后实现毒性衰减产生的。

随后的研究证明，p14V-1对CVB3感染引起的心肌炎和胰腺炎具有保护作用，并且抗肌球蛋白抗体水平非常低。这是一个关键的观察结果，因为CVB3感染可以导致自身抗体的从头出现。已有研究证明，CVB3后可导致影响心脏的致病特异性T细胞的产生。在接种p14V-1疫苗受试者中，仍能检测到心脏抗体，表明疫苗接种者可能经历了某种程度的心脏损伤。

CVB3-RD疫苗使用的是在人横纹肌肉瘤细胞中连续传代后减弱毒性的毒株，其扩展VP2区有一个突变（T151S），消除了病毒的心脏毒性。试验显示，作为候选疫苗的CVB3-RD还可对CVB1感染有效，但无法预防胰腺损伤(表1)。

其他研究团队在双突变病毒[CVB3(KR/EG)]上，通过VP1 EF环的D155E和VP1 DE环的P126M的定点突变，获得了系列减毒株CVB3(KR/EG/DE)和CVB3(KR/EG/PM)。

目前已经有许多关于MLV的使用调查，但结果仍不尽如人意。尽管CBV的减毒活疫苗能够诱导抗体和CMI反应，但接种后可能会有毒株毒力恢复的风险。因此，有团队已经将目标转移到了灭活疫苗的开发中。

2. 灭活疫苗

传统的灭活疫苗是通过使用甲醛、紫外线、X射线、γ射线、β丙内酯、过氧化氢和锌指活性化合物等方法杀灭整个病原体来制备的。灭活疫苗接种后不会在机体内恢复致病性，而且更稳定，但免疫原性也往往会降低，需要一种或多种佐剂协助，才能诱导有效的保护性反应。第一批灭活的CVB3疫苗之一是使用BPL来灭活CVB3、用Quil A基质作为佐剂的疫苗(表1)。试验显示，接种这种疫苗的小鼠模型nAbs滴度很低，在挑战性接种研究中存活率约为74%。

还有一种针对CVB1-6型的多价福尔马林灭活疫苗，对所有六种CVB血清型都有预防作用，但在动物模型的挑战性接种中观察到接种者发生轻度胰腺炎，且需要三剂次接种才能提供有效的保护作用。在NOD模型进行的T1D预防研究显示，这种疫苗延迟了T1D的发生，但在机体内产生的交叉反应可能引起胰岛β细胞自身抗体升高。

最近，有团队整合了所有六种CVB血清型，开发了另一种福尔马林灭活六价疫苗，并以CVB1和CVB4单价疫苗为阳性对照，对CVB1和CVB4诱导的T1D进行了测试(表1)。尽管目前尚不清楚接种疫苗的动物是否产生了T细胞反应，但可以检测到疫苗接种者机体内出现疫苗诱导的免疫球蛋白G反应，也就是说，这种六价疫苗存在诱导病毒反应性T细胞的可能性，这对于同型血清转换非常重要。

3. 重组亚单位疫苗

重组疫苗是针对传染病的常规疫苗，但针对CVB3的重组疫苗很少。目前正在开发中的疫苗，都有难以兼顾保护效力和安全性等问题，这意味着在研发亚单位疫苗时，还需要对其他结构蛋白进行研究。现有团队利用免疫刺激复合体技术整合了CVB3的所有结构蛋白以进行疫苗研发，动物模型研究显示，接种这种疫苗后，机体可产生高水平nAbs，接种者中未见心肌炎，但预防CVB所致胰腺损伤的效果还未测试。最近还有在大肠杆菌中制备的口服VP1包涵体纳米颗粒，可诱导接种者的粘膜免疫反应，预防CVB3引起的心肌炎。这类无佐剂疫苗是颇有前途的备选疫苗，与前一种疫苗一样，现正待研究这种疫苗能否预防CVB3感染所致胰腺损伤。

4. 载体疫苗

自20世纪80年代末以来，以Ad载体为主的重组病毒载体被用于传递外源基因。载体疫苗的主要缺点是，接种后可产生载体反应性抗体，在加强接种时，这种抗体会诱导记忆反应的屏障作用，降低接种效果。虽然这一局限性可以通过启动和增强重组病毒蛋白克服，但缺乏具有良好特性的免疫原蛋白反而会进一步阻碍载体疫苗的进展。不过，使用与SARS-CoV-2疫苗类似的载体，可能有助于减少载体特异性免疫反应的诱导，但在疫苗接受者中可能会发生病媒载体传播的副作用。

一项研究报告了一种表达CVB3VP1的水疱口炎病毒载体疫苗的开发(表1)，动物模型研究显示，鼻内接种这种疫苗可诱导高水平的nAbs和CMI反应，保护70%的动物免受CVB3的致命攻击，更具体效果仍待研究。

5. DNA疫苗

DNA疫苗是在20世纪80年代初发展起来的，当时Enzo Paoletti和Dennis Panicali两位科学家通过基因工程从牛痘病毒中提取了DNA，并插入来自单纯疱疹病毒、流感等其他病毒的基因。尽管DNA疫苗可以诱导抗体和细胞反应，但采用合适的接种方式优化抗体水平还是一个问题。也有人担心使用DNA疫苗是将外来DNA插入宿主基因组，可能影响控制细胞生长的基因(癌基因激活或肿瘤抑制基因失活)，或产生自身免疫。不过报告表明，随机整合到宿主基因组中的质粒DNA的发生率几近于无。

有团队将CVB3 VP1 DNA序列克隆到猪巨细胞病毒载体得到了DNA疫苗(表1)，但接种的动物模型体内的抗体水平并不高，部分出现了轻度心肌炎。还有团队开发了在鼻腔/口腔粘膜接种的重组壳聚糖VP1的DNA疫苗，疫苗中将高迁移率族蛋白1(HMGB1)和黑色素瘤缺失2(AIM2)表达载体与VP1共转染，提高了免疫应答水平，也降低了心肌炎的发生风险(表1)。

其他DNA疫苗类型详见表1。

6. RNA疫苗

CVB3的RNA疫苗研发有以下几个要点：

(A)编码疫苗的mRNA表达全长突变的CVB3多蛋白；

(B)可自我切割，产生成熟的病毒蛋白用于抗原处理和呈递；

(C)不产生传染性病毒颗粒。

针对这三个要点，一项研究开发了针对CVB3的质粒pH3IH1，所含病毒的2A和3B蛋白之间突变的裂解位点，可导致5‘NTR区域开始处的缺失，避免感恢复感染性(表1)。但RNA疫苗只能为50%的接种小鼠提供保护，且大部分接种小鼠都出现了明显的胰腺炎。另一项研究利用慢病毒系统递送方法，研发出一种MET-2C Lenti疫苗。该疫苗诱导的病毒滴度、心肌损害和促炎细胞因子有所减少，但应答水平仅为50%(表1)。

7. 病毒样颗粒(VLPs)

VLP在形状和大小上与自然病毒相似，但缺乏病毒本身的基因组物质，因此不具有传染性，不会通过逆转、重组等方式恢复为毒力形式。VLP具有高度的免疫原性，可刺激B细胞和T细胞的免疫反应。有两种基于VLP的疫苗已经针对CVB3进行了测试，研究详见表1。

人们期望能够研发出在没有副作用的情况下诱导良好的B和T细胞反应的柯萨奇病毒疫苗。其中，减毒活疫苗已经取得了成功，却不能排除减毒病毒恢复其致病形式的可能性；灭活疫苗虽然比减毒活疫苗更安全，又无法诱导足够强的T细胞反应，在预防或消除病毒感染层面来说并不理想，通过亚基、纳米颗粒、核酸和载体疫苗等其他形式生产有效疫苗的方法也刚刚迈入正轨。就目前的情况而言，研发出能够诱导高亲和力nAbs的灭活疫苗，或许将对预防CVB感染产生重大影响。

挑战和展望

Challenges and Future Perspectives/

与其他传染病不同的是，针对CVB感染的疫苗很少受到关注。首先，CVB引起的疾病并非急重症，也就不足以确定CVB疫苗的直接效果；外加许多非CVB和非病毒药物可能引发心肌炎和T1D，也很难鉴别出CVB病毒在疾病中的实际影响。从预防心肌炎/DCM和T1D的角度来看，CVB作为这两种疾病的重要诱因，开发针对CVB疫苗的对人们的健康具有积极作用，但它们的使用对这心肌炎和T1D发病率的实际影响仍是未知数。

有研究评估报告称，使用CVB疫苗可以将T1D的发病率降低至少50%。不过在确定接种疫苗的目标人群及年龄时，可能也会出现争议。病毒性心肌炎首当其冲影响的就是儿童人群，可导致充血性心力衰竭/扩张性心肌炎，理论上儿童应该是CVB疫苗的优先接种人群，但也要考虑高危T1D成年人群对CVB的需要。虽然遗传性T1D的自发发展并不能通过早期接触CVB感染来预防，但为T1D年轻患者群体接种CVB疫苗，可以降低暴露于CVB的风险，减轻残留的胰岛β细胞的破坏程度。

CVB疫苗使用的安全性也仍待商榷。CVB是RNA病毒，很容易发生突变，像MLV之类的疫苗可能会有恢复毒力的风险。同样，疫苗的研发过程也应该考虑平衡机体的免疫反应，尽可能避免对心脏和胰腺的负面影响。如果针对一种自身抗原产生的自身抗体与另一种自身抗原发生交叉反应，则存在CVB感染间接诱导自身免疫的可能性，反而引发心肌炎等问题。

虽然前方困难重重，但如果停滞不前，对未来的人类健康并不是好事。要知道，如果没有使用天花疫苗，也许我们今天仍然生活在天花中。CVB疫苗迈入开发后的许多障碍，以及来自社会各界的关切和迷思，也等待着更深入的解读和研究。

撰写 | Vaccine前沿

校稿 | Gddra  

编审 | Hide / Blue sea

编辑  设计 |  Alice