科研丨南昌大学: 小黑豆多糖通过调节肠道菌群和血清代谢缓解2型糖尿病(国人佳作)

编译：微科盟皮皮，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

2型糖尿病(T2DM)是一种复杂的代谢紊乱，与慢性高血糖和胰岛素抵抗有关。小黑豆是一种药用大豆，在中医中有补肾健脾的作用。研究了小黑豆(SB)粗多糖通过肠道微生物群和代谢调节对STZ诱导的糖尿病大鼠的抗糖尿病作用及其机制。结果发现，SB可改善高血糖、高血脂症状，调节亚油酸代谢。此外，中剂量SB改变了Ruminococcus、Oscillospira、Dorea和Mucispirillum的相对丰度，这些细菌属与6种重要代谢产物和10项T2DM风险指标有很强的相关性。此外，400 mg/kg纯多糖比粗多糖具有更好的抗糖尿病活性，表明小黑豆多糖的抗糖尿病作用主要归因于纯多糖。  

论文ID

原名：Polysaccharides from small black soybean alleviating type 2 diabetes via modulation of gut microbiota and serum metabolism

译名：小黑豆多糖通过调节肠道菌群和血清代谢缓解2型糖尿病

期刊：Food Hydrocolloids

IF：11.504              

发表时间：2023.3

通讯作者：黄晓君

通讯作者单位：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室

DOI号：10.1016/j.foodhyd.2023.108670

实验设计

动物实验1旨在研究SB对HFD和STZ诱导的2型糖尿病大鼠的抗糖尿病作用和机制。通过喂食HFD五周并静脉注射STZ建立T2DM模型；正常大鼠喂食标准的正常饮食并静脉注射等量的生理盐水。将动物随机分为6组(n = 8)：1)对照组，给予蒸馏水；2)糖尿病模型组，给予蒸馏水；3)二甲双胍(Met)组，给药二甲双胍；4)低剂量SB(SBL)组，给药100 mg/kg BW SB；5)中剂量SB(SBM)组，给药200 mg/kg BW SB；6)高剂量SB(SBH)组，给药400 mg/kg BW SB。

动物实验2旨在验证SB的纯多糖在抗糖尿病活性中的关键作用。将动物随机分为7组(n = 8)：1)对照组，给予蒸馏水；2)糖尿病模型组，给予蒸馏水；3)二甲双胍(Met)组，给药二甲双胍；4)中剂量SB(SBM)组；5)低剂量SBP(SBPL)组，给药100 mg/kg BW SBP；6)中剂量SBP(SBPM)组，给药200 mg/kg BW SBP；7)高剂量SBP(SBPH)组，给药400 mg/kg BW SBP。每周用血糖仪测量空腹血糖(FBG)水平，处理4周后，所有大鼠处死，采集血样、结肠内容物、胰腺和肝组织，通过病理切片观察胰腺组织学变化；血清代谢组学分析、16S rRNA基因测序分析肠道菌群。  

图1 T2DM的诱导及实验设计。

(A)动物实验1，(B)动物实验2。DM：糖尿病模型组；Met：二甲双胍组；SBL：SB低剂量组；SBM：SB中剂量组；SBH：SB高剂量组；SBPL：SBP低剂量组；SBPM：SBP中剂量组；SBPH：SBP高剂量组；CON：对照组。

结果

1 SB对葡萄糖稳态和血脂的影响

为了研究SB调节血糖和血脂的能力，我们建立了T2DM模型。利用T2DM模型，我们观察到DM组的空腹血糖(FBG)、GSP、AUC、NEFA、TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著高于CON组(p < 0.05)(图2A-H)。HDL-C升高的原因是高脂饮食中需要HDL-C转运的脂质增多。但经SBM处理后HDL-C显著降低(p < 0.01)。给药SBL、SBM或SBH 4周后，GSP、AUC、NEFA、TC、TG、LDL-C显著降低。FBG水平由前四周(图S1)和最后一周的FBG变化率反映(图2A)。SBM治疗组的最终FBG显著低于DM组。总体而言，这些结果表明，与其他处理方法相比，SBM表现出最佳的降血糖和降血脂活性。

图2 SB对2型糖尿病大鼠血糖稳态和血脂的影响。

对(A)空腹血糖(FBG)、(B)糖基化血清蛋白(GSP)、(C)口服糖耐量试验(OGTT)的葡萄糖曲线下面积(AUC)、(D)非酯化脂肪酸(NEFA)、(E)总胆固醇(TC)、(F)甘油三酯(TG)、(G)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和(H)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响。单因素方差分析(ANOVA)与Tukey事后检验用于组间比较。与CON组比较，*p<0.05，**p < 0.01；与DM组比较，#p < 0.05，##p < 0.01。  

2 SB对胰岛素抵抗和胰腺病理的影响

与对照组相比，DM组的胰岛素浓度明显降低，HOMA-IR水平升高(图3A和B)。口服SB四周后，胰岛素抵抗水平降低，但无显著差异。与CON组相比，DM组出现胰岛数量和大小减少以及严重的囊泡变性(图3C)。这些症状在SB治疗四周后得到缓解。

为了研究参与胰岛素分泌的几个关键基因的mRNA表达水平与基本生化指标之间的相关性，我们研究了胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、胰岛素受体底物2(IRS-2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)的mRNA表达(图S2)，并建立了10个基本生化指标与6个基因mRNA表达水平之间的Spearman相关性(图3D)。DM组IR和IRS-1的mRNA表达显著低于CON组，SBL、SBM和SBH组IR、IRS-1基因表达均高于CON组。IRS-2、PI3K、AKT、GLUT-2 mRNA表达在六组之间没有显著变化。此外，IR mRNA表达与7项基本生化指标(GSP、FBG、AUC、NEFA、TC、TG、LDL-C)呈正相关，与胰岛素呈负相关。IRS-1 mRNA表达与8项基本生化指标(GSP、FBG、AUC、NEFA、TC、TG、LDL-C、HOMA-IR)呈正相关。综上所述，这些结果表明，PI3K/AKT通路中IR和IRS-1 mRNA表达与T2DM的几项基本生化指标密切相关。由于PI3K/Akt通路的靶基因没有被显著激活，治疗组的胰岛素抵抗没有明显缓解。

图3 SB对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗和胰腺组织病理学的影响。

对(A)胰岛素浓度、(B)胰岛素抵抗(HOMA-IR)的影响。2型糖尿病大鼠(C)胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、胰岛素受体底物2(IRS-2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2) mRNA表达水平与10项生化指标之间的Spearman相关性。R值由渐变色表示，其中蓝色和粉色单元格分别表示正相关和负相关；*p<0.05，**p < 0.01。(D)实验中胰腺的组织病理学特征。胰腺组织用H&E染色(200×)。单因素方差分析(ANOVA)与Tukey事后检验用于组间比较。与CON组比较，*p<0.05，**p < 0.01；与DM组比较，#p < 0.05，##p < 0.01。  

3 SB对代谢谱的影响

从OPLS-DA模型的血清代谢谱可以看出，CON和DM组之间有明显的差异(图4A和B)。53种代谢产物符合VIP>1、p < 0.05和FC > 2标准，被鉴定为生物标志物。这些代谢产物与11个不同的簇有关，包括饱和溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、羟基二十碳三烯酸(HETrE)、肉碱、胆酸、磷脂酰胆碱和饱和脂肪酸(FA)、不饱和溶血磷脂酰胆碱、饱和溶血磷脂、不饱和溶血磷脂和不饱和FA。与CON组相比，DM组有7个簇显著增加，而其余5个簇没有显著增加。

采用PCA分析评估SB对代谢谱的影响。结果表明，SB (SBL、SBM、SBH)、DM组和CON组的样品明显分离，说明SB对血清代谢产物有治疗效应。值得一提的是，SBM的样本比SBL和SBH的样本更接近CON组，这一结果表明SB调节T2DM代谢紊乱的最佳剂量为SBM。如图4、图6所示，SBL、SBM、SBH和Met显著降低了53种代谢产物中的6种(与T2DM组相比，p < 0.05，VIP>1)，包括Arachidyl carnitine、L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱、LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/16:0)和LysoPE(0:0/18:1(11Z))(图4F)。

本研究确定了七种途径(p < 0.05或impact value > 0.1)在T2DM大鼠中可能受到干扰。这七条重要途径分别为不饱和脂肪酸生物合成、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、醚脂代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化。通路分析的细节和参与通路的代谢物如图4G和图S4所示。经SB处理4周后，不饱和脂肪酸生物合成、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化受到调节，其中亚油酸代谢途径最为显著。

图4 SB对2型糖尿病大鼠血清代谢组的影响。

(A)正模式下DM组和CON组之间的OPLS-DA得分图，(B)负模式下DM组和CON组之间的OPLS-DA得分图，(C)正模式下DM、CON、Met、SBL、SBM和SBH组之间的PCA得分图 ，(D)负模式下DM、CON、Met、SBL、SBM、SBH组之间的PCA得分图，(E) CON、Met、SBL、SBM、SBH与DM组相比的Venn图(p < 0.05，VIP＞1)，(F) SB和Met处理改善的显著代谢产物的热图，(G) CON/DM通路分析汇总图(1-10代谢通路满足p < 0.05或impact value > 0.1)，(H) RK/DM(1，2，5，6，9代谢通路满足p < 0.05或impact value  > 0.1)。

4 SB对肠道菌群的影响

为了探索SBM较SBL、SBH更能改善葡萄糖稳态、血脂和代谢紊乱的潜在机制，我们通过16S rRNA测序技术研究了SBM对肠道微生物群组成的影响。如图S5所示，SBM肠道微生物群的α-多样性指数(Chao1、Shannon和Observed otus)高于DM，而不同组之间的α多样性没有显著差异。基于Bray-curtis相异性的β-多样性分析显示，四组之间存在明显的分离(图S6)。还分析了属水平的相对丰度变化。结果显示，SBM中Oscillospira、Ruminococcus、Dorea的相对丰度显著高于DM，Mucispirillum显著降低(图5A)。

使用Spearman相关性分析分析了肠道微生物群和6种重要血清代谢物之间的关系(图5B)。瘤胃球菌(Ruminococcus)与6种重要代谢产物呈负相关，包括3种肉碱代谢物、1种饱和溶血磷脂酰胆碱代谢物、1种饱和溶血磷脂代谢物和1种磷脂酰乙醇胺代谢物。Dorea与2种肉碱代谢物和1种磷脂酰乙醇胺代谢物呈负相关。双歧杆菌(Bifidobacterium)与前6种重要代谢产物呈正相关，Mucispirillum与3种肉碱代谢物和1种磷脂酰乙醇胺代谢物呈正相关。

此外，本研究还评估了肠道微生物群与T2DM主要风险指标之间的相关性。瘤胃球菌(Ruminococcus)与FBG、胰岛素和HDL-C呈显著负相关。Oscillospira与2项血脂指标(NEFA、LDL-C)呈显著负相关(p < 0.05)。Dorea与AUC、TG和LDL-C呈负相关。相反，Mucispirillum与FBG、GSP、AUC、NEFA、TC、TG和LDL-C等7个风险因素指标呈正相关。双歧杆菌与GSP、AUC、TC、HDL-C和LDL-C呈正相关。这些结果表明，肠道微生物群可能通过与血清代谢产物相互作用来调节T2DM大鼠的葡萄糖稳态和血脂。

图5 SB对2型糖尿病大鼠肠道微生物群的影响及其与重要代谢产物的相关性。

(A)不同大鼠组肠道细菌属水平的细菌分类特征(每组n=6)。差异通过Mann–WhitneyU检验进行评估。与CON组比较，*p<0.05，**p < 0.01；与DM组比较，#p < 0.05，##p < 0.01。(B) 6种重要代谢产物的浓度与SB和DM组微生物属的相对丰度之间的Spearman相关性。R值由渐变颜色表示，其中紫色和粉色单元格分别表示正相关和负相关；*p<0.05，**p < 0.01。(C) 10个生化指标的浓度与各组微生物属相对丰度之间的Spearman相关性。R值由渐变颜色表示，其中紫色和粉色单元格分别表示正相关和负相关；*p<0.05，**p < 0.01。  

5 SBP对血糖稳态、血脂及胰岛素抵抗的影响

为了证实SB的抗糖尿病成分为SB的纯多糖，我们通过JK008树脂吸附技术纯化SB以获得纯化的多糖，并标记为SBP。SBP的中性糖和糖醛酸含量增加了3倍以上。SBP由137  kDa、30  kDa，0.7 kDa组成，其单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸，质量比为11.85:50.51:3.92:31.03:2.69(表S2和图S7)。在随后的研究中，我们通过评估FBG、GSP、AUC、NEFA、TC、TG、胰岛素和HOMA-IR等10个T2DM风险指标，分析了SBM、SBPL、SBPM和SBPH对T2DM的影响(图6A-J)。SBPH在调节血糖稳态、血脂方面的抗糖尿病作用优于SBM、SBPL、SBPM。CON、DM和治疗组间的胰岛素水平没有显著差异，而HOMA-IR仅SBPH组有显著改善。综上所述，这些结果表明SB的抗糖尿病活性是通过SBP表现出来的。

图6 SBM和SBP对2型糖尿病大鼠血糖稳态和血脂的影响。

对(A)空腹血糖(FBG)、(B)糖基化血清蛋白(GSP)、(C)口服糖耐量试验(OGTT)的葡萄糖曲线下面积(AUC)、(D)非酯化脂肪酸(NEFA)、(E)总胆固醇(TC)、(F)甘油三酯(TG)、(G)高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、(H)低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、(I)胰岛素浓度和(J)胰岛素抵抗(HOMA-IR)的影响。单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验用于组间比较；与CON组比较，*p<0.05，**p < 0.01；与DM组比较，#p < 0.05，##p < 0.01。  

讨论

本研究发现SB显著调节T2DM大鼠的葡萄糖稳态和血脂，与SBL和SBH相比，SBM表现出最佳的降血糖和降血脂活性。此外，SBM对血清代谢和肠道微生物群具有有效作用。通过Spearman相关性分析，我们发现T2DM的重要细菌属与6种重要血清代谢产物和主要风险因素指标均有显著相关性。T2DM的10个主要风险指标(FBG、GSP、AUC、NEFA、TC、TG、HDL-C、LDL-C、胰岛素、HOMA-IR)用于评估T2DM的发展。因此，SB对上述指标的改善作用表明其对T2DM大鼠具有抗糖尿病作用。SB对胰岛素和HOMA-IR没有明显的调节作用，这可能是由于SB多糖含量低所致。因为SBPH治疗后HOMA-IR水平明显提高。

越来越多的证据表明，血浆代谢组反映了宿主的代谢稳态，在2型糖尿病患者中发现了高浓度的长链酰基肉碱、游离肉碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、脂肪酸(十二烷酸和肉豆蔻酸)。与文献一致，本研究发现，饱和溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、羟基二十碳三烯酸(HETrE)、肉碱、胆酸、磷脂酰胆碱和饱和脂肪酸(FA)在T2DM大鼠中升高。SBL、SBM和SBH降低了3种肉碱代谢物、1种饱和溶血磷脂酰胆碱代谢物、1种饱和溶血磷脂代谢物、1种磷脂酰乙醇胺代谢物。此外，SB还调节亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等代谢途径；其中亚油酸代谢最为显著。亚油酸是FA的母体，一些报道表明，高浓度的血清游离FA通常与胰岛素抵抗有关，是T2DM的风险因素。一致地，随着SBM的处理，部分FA减少(表S3)。此外，SB还能调节不饱和脂肪酸的生物合成。

大规模的流行病学研究证实了肠道菌群对宿主代谢的潜在影响。T2DM与异常的肠道微生物群有关，特定的细菌可以通过饮食干预来调节。在本研究中，SBM显著增加了Ruminococcus、Oscillospira、Dorea，减少了Mucispirillum。此外，这些细菌属与T2DM的6种重要代谢产物和10种风险因素指标均有很强的相关性。瘤胃球菌是肠道生态系统的重要贡献者，在肥胖模型中被认为是一个有利的属，其丰度可以通过可发酵膳食纤维来增加。先前的一项研究表明，瘤胃球菌与HDL-C和FBG呈负相关。在本研究中，观察到瘤胃球菌与3个指标(FBG、HDL-C、胰岛素)以及与6种重要代谢产物之间存在显著相关性。先前的研究表明，Oscillospira能够发酵宿主聚糖，可能对减肥和人类健康有重要贡献。在饮食干预之后，如地中海饮食，会增加Oscillospira属的丰度。根据这些文献，在我们的研究中，SBM处理显著增加了Oscillospira。通过文献回顾，Oscillospira与炎症性疾病和体重指数(BMI)呈负相关。在本研究的分析中，观察到Oscillospira与两项血脂指标(NEFA、LDL-C)呈负相关。Dorea与肥胖和血浆代谢物(谷氨酸、支链氨基酸、石胆酸)有关。本研究发现，Dorea与三个基本指标(AUC、TG、LDL-C)和三种代谢产物(L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱、LysoPE(0:0/18:1(11Z))相关。SBM组中Dorea明显高于DM组。先前的研究表明，高脂肪/高氧化损伤猪肉饮食会显著增加Mucispirillum的相对丰度，而富含麸皮的饮食组的Mucispirillum相对丰度降低。综上所述，本研究显示DM组Mucispirillum的丰度显著高于CON组，且经SBM治疗后其丰度降低。在DM组中，Mucispirillum与6种重要代谢产物和7项风险因素指标均呈显著正相关。根据这些结果，我们推断SBM治疗对T2DM大鼠肠道细菌属的调节作用，特别是Ruminococcus、Oscillospira、Dorea和Mucispirillum，可以影响血清代谢产物，并有助于调节葡萄糖稳态和血脂。

在进一步的研究中，SBPH在2型糖尿病大鼠中表现出比SBM、SBPL、SBPM更好的抗糖尿病作用，这种作用可能归因于两种主要的多糖组分(137 kDa、30 kDa)。有关纯多糖抗糖尿病作用的各种报告进一步支持了这一假设。关于多糖的潜在抗糖尿病机制，先前的研究表明，不同的多糖是由特定的细菌种类加工的。此外，肠道细菌属影响血清代谢产物，以调节与葡萄糖稳态和血脂相关的代谢途径。综上所述，本研究的结果表明，SBP可以作为一种膳食补充剂，用于缓解T2DM患者的高血糖和高血脂症状。