双功能酵母展示与分泌系统

前言

与噬菌体展示相比，酵母是真核生物，具有翻译后修饰的能力; 同时结合流式细胞荧光分选 ( 简称流式分选) 技术实时可见的特点，酵母展示在抗体发现与亲和力成熟中具有更显著的优势。但传统酵母展示技术只能将抗体展示于表面，无法同时将抗体分泌至培养基的上清液进行功能筛选。

本期内容小编为大家介绍一种双功能酵母展示与分泌系统，可用于高效筛选含有高亲和力抗体序列的菌株，并实现抗体的双重展示与分泌。该系统可以显著提高工作效率并缩短抗体的研发周期。

酵母展示技术和其他替代方案的局限性

传统技术

传统酵母展示技术只能在表面展示特定蛋白，无法将蛋白同时分泌到培养基上，以用于活性与亲和力测定。要进行活性与亲和力测定，需要在哺乳动物细胞系中表达和纯化蛋白样品，这会带来通量、成本和时间方面的瓶颈。

终止密码子 UAG实现展示与分泌的切换

2015 年 Adimab 公司报道了一种经过改造的酿酒酵母，可在特定条件下利用人工合成氨基酸翻译终止密码子 UAG，进而实现展示与分泌的切换，但由于 UAG 翻译效率的限制，使得抗体在酵母细胞表面展示的 丰度大大下降，影响了文库的筛选效率[1]。

Fc区域与锚定蛋白连接展示

Glycofi公司利用Fc与锚定蛋白连接于毕赤酵母表面，实现抗体半分子的展示，并能分泌完整抗体分子至培养基，但使用该技术需要将文库插入毕赤酵母基因组中，这限制了文库的多样性。此外，抗体展示效率受Fc分子量和同源二聚体形成等因素影响[2]。

双功能酵母展示与分泌系统

该研究开发的基于Fc展示抗体的方法[3]，通过对重链恒定区 3T366W 突变 ( CH3Knob ) 与不同长度的 Fc 区域作为展示单元的优化，最终，选定了 CH3Knob作 为展示单元。CH3Knob展示于酵母细胞表面作为“诱饵”结合含 FcHole( Hole 突变: T366S、L368A、Y407A) 的抗体半分子; 同时，含 FcHole的抗体半分子可以形成同源二聚体，该完整的抗体分子分泌至培养基中，达到展示与分泌兼具的效果。

图1 展示与分泌兼具的酵母展示系统示意

评估双功能酵母展示与分泌系统的可行性

以抗人PD-L1 的 VHH ( AmNB1613. 36 ) 为例，为了选出最适合酵母展示且分泌效果好的 “诱饵”，构建了一系列展示质粒组合（表1，组1-3）并转入酿酒酵母 EBY100。

使用 CH3Knob 作为“诱饵”抗体的展示水平最优

取诱导24 h的细胞，用生物素化的人 PD-L1 抗原染色，比较抗体 AmNB1613. 36 的展示水平(图 2a)。可以看出组 3 的抗体展示效果最优。

使用 CH3Knob 作为“诱饵”抗体的分泌量最大

取诱导72 h的培养基上清液与展示人 PD-L1 的细胞(表1中组7) 孵育染色，比较抗体的分泌水平(图 2b)。组3 分泌抗体的量为组 1、2 的 10～20 倍，说明使用 CH3Knob 作为“诱饵”抗体的分泌量最大。

图2 双功能酵母展示与分泌系统的开发

获得展示比例最高的克隆

上文已确定 CH3Knob作为“诱饵”最利于抗体的展示与分泌，其编码基( CH3Knob-Flag-Aga2p) 可以质粒形式转入菌株中，亦可整合插入菌株基因组中。相较于质粒形式，整合插入菌株基因组时基因更不易丢失，细胞展示的比例更高; 同时可节省一 个质粒的筛选标签，以便于在质粒上构建抗体的 轻、重链文库使用。

因此，将质粒 pYDC041 编码基因及上、下游启动子与终止子序列: PGAL1-CH3KnobFlag-AGA2-TEＲMATα，与遗传霉素抗性基因 PAgTEF - KanＲ 串联，两端各加上 50 个碱基的 UＲA3 基因的 上、下游同源臂，转入酿酒酵母 EBY100 取代 UＲA3 基因( 图 1) 。筛选在 Ura 缺陷型培养基上不生长，但可在 YPD+G418 抗性平板生长的单克隆; 挑取若干单克 隆培养，再诱导细胞，用流式检测 CH3Knob-Flag 在酵母表面展示的水平，如图 3 所示。由图可知: 2、6、7、8 号克隆均能有效展示，其中IDY104-7号克隆展示比例最高，用作后续实验并命名为 IDY104。

展示且分泌效果好的 “诱饵”，构建了一系列展示质粒组合（表1，组1-3）并转入酿酒酵母 EBY100。

图3 流式检测CH3Knob-Flag在酵母表面展示的水平

论证该系统在抗体亲和力成熟中的应用可行性

为了验证双功能酵母展示与分泌系统在抗体亲和力成熟中的应用，该研究采用了抗人PD-L1高、低亲和力的不同分子AmNB1613.36和HzNB1613在IDY104上进行展示，分别对应表1中的5组和6组。同时，该研究还将这两种菌株按1：100或1：10000的比例混合，以模拟亲和力成熟文库。

表1 酿酒酵母质粒转化表

将组 5、6 两种菌株按比例混合成了1%和0.01%的模拟文库，并筛选出Y轴信号高的细胞群（即亲和力强的结合信号强）。经过两轮筛选，每一轮随机挑选24个单克隆进行测序，两个模拟文库都有效富集了展示AmNB1613.36的组5菌株。

在经过两轮流式细胞分选后，1%模拟文库中AmNB1613.36占比达到100%，0.01%模拟文库中AmNB1613.36占比达到92%, 图4(b)。这表明双功能酵母展示和分泌系统能够高效地从文库中筛选出高亲和力的突变体。

将组5和组6菌株诱导72小时后，检测其上清液与抗原的亲和力，结果如图4(c)所示，两个菌株的上清液样品都能测定与抗原的结合动力学参数。

图4 双功能酵母展示与分泌系统筛选亲和力成熟的模拟文库

以上结果充分验证了双功能酵母展示与分泌系统及其在抗体亲和力成熟中的应用可行性，从而显著提高工作效率、缩短抗体亲和力成熟的周期。

小结

为解决传统展示技术与分泌系统并行的局限，该研究采用含有Knob突变的抗体Fc片段作为“诱饵”，并将其展示于酵母表面。通过结合含有Hole突变的免疫球蛋白(IgG)半分子，实现抗体的展示，并使含有Hole突变的IgG半分子形成同源二聚体，从而形成完整的IgG分子，分泌至培养基中，实现酵母抗体展示与分泌的双重功能。

以抗人PD-L1的VHH抗体(AmNB1613.36)为例，初步证明了双功能酵母展示与分泌系统构建成功。通过1%和0.01%的模拟文库进一步验证，证实了双功能酵母展示与分泌系统在抗体亲和力成熟中的可行性，从而可以显著提高工作效率并缩短周期。

参考文献：

[1] JAMES A，VAN D，ＲYAN L，et al．A switchable yeast display /secretion system［J］． Protein Eng Des Sel，2015，28 ( 10 ) :317-325．

[2] SHAHEENH H，PＲINZ B，CHEN M T，et al．A dual-mode surface display system for the maturation and production of monoclonal antibodies in glyco-engineered Pichia pastoris［J].PLoS ONE，2013，8( 7) : e70190．

[3] WANG Xuhui，ZHOU Qian，LING Xiaomin，et al． Generation and verification of dual functional yeast display /secretion system［J］． Chin J Bioprocess Eng，2021，19( 5) : 547－554.

打赏