重磅！国内首个自主研发的三价轮状病毒疫苗获批上市

2023年4月17日，国药集团中国生物兰州生物制品研究所自主研发的口服三价重配轮状病毒减毒活疫苗（Vero细胞）获得国家药品监督管理局上市许可批准，成为国内首个获准上市的三价轮状病毒疫苗。该疫苗交叉保护性好，可有效预防G1、G2、G3、G4和G9型轮状病毒导致的婴幼儿腹泻。

  轮状病毒(Rotavirus, RV)是引起世界范围内5 岁以下儿童重症腹泻的最主要病原，也是导致发展中国家婴幼儿死亡的主要原因之一。自2006年以来，对于轮状病毒感染的防治，世界卫生组织倡导优先接种轮状病毒疫苗，我国2020年发布的《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识》中也明确指出，接种轮状病毒疫苗是预防轮状病毒的最简单有效的措施，建议适龄儿童按照共识所推荐的免疫程序尽早开始接种轮状病毒疫苗。     目前国内接种的国产疫苗是由兰州生物制品研究所独立研制生产的单价口服轮状病毒活疫苗。兰州生物制品研究所在三价轮状病毒疫苗研发过程中，克服重重困难，先后攻克了毒株筛选、基因重配、多型配比、规模化生产等一系列难题，并完成了目前国内规模最大的婴幼儿临床试验，对一万名适龄婴幼儿持续跟踪观察两个流行季。研究结果表明，该疫苗在预防G1、G2、G3、G4和G9型轮状病毒引起的腹泻方面具有很高的安全性和保护效力。  

轮状病毒（rotavirus，RV）是导致婴幼儿腹泻的主要病原体，感染途径为粪-口传播，临床表现为急性胃肠炎，呈渗透性腹泻病，是引起全球5岁以下儿童严重腹泻病的最常见病原，每年导致约20万名儿童死亡[1]。RV主要侵犯的部位是小肠上皮细胞，导致细胞损伤，从而引起腹泻。在未引入RV疫苗的国家中，每年在急性胃肠炎住院患者中检测到RV的比例为38.0%，而在已开展疫苗接种的国家，在急性胃肠炎住院患者中检测到RV的比例为23.0% [2]。

RV的基因组主要编码6个结构蛋白(VP1—VP4、VP6和VP7）和6个非结构蛋白（NSP1—NSP6）。VP2为内层核心蛋白，VP6为中间层蛋白，VP7和VP4为最外层衣壳蛋白，诱导机体产生主要的中和抗体。依据RV VP6可将其分为A—H 8个不同的组。

其中，感染人类的主要是A组，在世界范围内最占优势的是A组G型RV。根据VP7和VP4抗原性不同，在人类和动物中共发现了36个G血清型和51个P血清型[3]。常见的G血清型有G1、G2、G3、G4，血清型G9也日渐增多；常见P血清型有P[4]和P[8]。其中G9P[8]、G1P[8]和G3P[8]在我国最为常见，分别占39.5%、16.8%和9.9%，近年来G9P[8]逐渐成为了我国最主要的流行株[4]。

1RV疫苗的应用现状

目前WHO对4种RV疫苗进行了预认证：Rotarix疫苗（英国葛兰素史克公司生产，2009年预认证）、RotaTeq疫苗（美国默沙东公司生产，2008年预认证）、Rotavac疫苗（印度巴拉特生物技术公司生产，2018年预认证）和Rotasiil疫苗（印度血清研究所生产，2018年预认证）[5]。单价人RV疫苗Rotarix和五价牛-人重组RV疫苗RotaTeq供全球范围内使用，而Rotavac和Rotasiil疫苗使用范围仅在印度和巴勒斯坦。在我国获批上市使用的是兰州生物制品研究所有限责任公司生产的口服RV活疫苗LLR。这些RV疫苗的推广，大大降低了RV感染的重症和死亡率。

1.1Rotarix疫苗

Rotarix疫苗为英国葛兰素史克公司研发的口服人RV减毒活疫苗，含有G1P[8]型毒株，来源于89-12亲本候选株，对G3、G4、G9型毒株均有交叉保护作用。Rotarix疫苗于2005年在墨西哥获得批准上市，并在2009年通过了WHO的预认证。2008年4月被许可用于美国的婴儿，在2月龄和4月龄以2个剂量口服给药，第1剂应在6~14周，两次间隔4周，所有剂量应在8月龄前完成给药[6]。

Rotarix疫苗对预防RV感染具有一定的效果，但这种有效性是不均衡的，疫苗在发达国家的保护率明显高于发展中国家。Karafillakis等[7]通过分析RV有关的报道数据，得出Rotarix疫苗在欧洲的保护率为80.0%～98.3%，而在非洲的保护率为 56%～64%，这可能与发展中国家较差的生活环境有关[8-12]。此外，就成本而言，跨国疫苗制造商进行大规模试验需要巨大的资金成本支持，导致所出售的疫苗价格也不会太低，这对RV感染更加严重的发展中国家而言显然是无法负担的。

因此，定价机制和分级价格水平也是至关重要的一个环节。2010年3月22日，美国FDA因发现Rotarix疫苗中存在猪圆环病毒1型DNA的污染而宣布暂停该疫苗的使用，随后在 RotaTeq疫苗中也发现了此病毒[13]。对此，葛兰素史克公司决定重建Rotarix疫苗生产所用的细胞库和毒种库，以确保后期生产的疫苗不含猪圆环病毒[14]。

1.2RotaTeq疫苗

RotaTeq疫苗为默沙东公司研发的五价牛-人RV重组疫苗，2009年被WHO向全世界儿童推荐使用，包含G1、G2、G3、G4、P1A［8］型5种人-牛RV重配株，可有效预防G1—G4以及G9型RV引起的RV胃肠炎（RV gastroenteritis，RVGE）。RotaTeq疫苗适用人群为1.5~8月龄的婴幼儿，接种方式为口服，分3次接种，每两剂之间的服用间隔为4~10周[15]。

与Rotarix疫苗类似，RotaTeq疫苗在发达国家的有效性明显高于非洲等落后地区，据统计在欧洲和北美地区，接种RotaTeq疫苗后的第1年和第2年的保护率分别为73%和62%[16-17]；在非洲（加纳、肯尼亚、马里）及亚洲（孟加拉国、越南），接种该疫苗后对RVGE保护效力分别为33.9%、42.5%[18]。RotaTeq与Rotarix疫苗均为减毒活疫苗，其作用机制为刺激肠道产生免疫应答，这可能会给胃肠道带来不良反应。除肠套叠外，RotaTeq疫苗还伴有一些罕见的不良反应，包括腹泻、呕吐、烦躁不安、中耳炎、鼻咽炎和支气管痉挛等[19]。

1.3Rotavac疫苗

Rotavac疫苗是印度巴拉特生物技术公司生产的液体冷冻单价RV活疫苗，于2014年获得许可在印度上市，并在2018年通过了WHO预认证。Rotavac疫苗由天然减毒的人RV G9P[11]毒株分离而得，以冷冻形式储存，在-20 ℃最长可保存5年，在2~8 ℃之间最长保存6个月，可以反复冻融6次[20]。Bhandari等[21]通过随机、双盲、安慰剂对照试验得出，Rotavac疫苗对严重RVGE的疫苗效力为53.6%，对Ⅲ期临床试验极严重RVGE的疫苗效力为54.4%，对所有RVGE的疫苗效力为34.6%，且疫苗组和安慰剂组每年严重RVGE的发病率分别为1.5%和3.2%。

此试验证明Rotavac疫苗对不同严重程度的RVGE均有保护作用。然而相关研究显示这种保护作用是不均衡的：与在中等、高等收入国家的临床试验有效性相比，在非洲、拉丁美洲和亚洲中低收入国家的有效性显著降低[22-23]。另外经济成本也是一个值得考虑的因素，尤其是对于低收入国家。虽然Rotavac冷冻疫苗可以提供较低的成本和较长的保质期，但冷链运输依然是个不容小觑的经济问题，可能会产生额外的成本。

1.4Rotasiil疫苗

 Rotasiil疫苗是由印度血清研究所生产的冻干五价RV疫苗，是在Vero细胞中由天然减毒的人-牛RV毒株G1、G2、G3、G4和G9分离而得。该疫苗在2017年获得许可在印度上市，并于2018年通过WHO预认证。冻干形式的Rotasiil疫苗在2~8 ℃冷藏条件下可储存30个月[20]。

Kulkarni等[24]进行了1项随机、双盲、安慰剂对照Ⅲ期临床试验，其中3 749名婴儿接受疫苗为疫苗组，3 751名婴儿接受安慰剂为对照组，经过2年随访后，结果得出疫苗组的严重RVGE的发病率与安慰剂组相比显著降低。此外，Zade等[25]对60名健康婴儿进行II期临床研究，疫苗组与安慰剂组以1:1的比例分3次给药，每次给药间隔至少4周。

研究发现疫苗组和安慰剂组第2次给药后血清转化率分别为36.00%和7.14%，第3次给药后血清转化率分别为48.00%和21.43%。Anil等[26]纳入20名健康成人作为受试者接受疫苗接种，随访后发现，研究期间没有出现任何非预期的不良事件。由于Rotasiil疫苗的使用范围有限，仅在印度和巴勒斯坦使用，因此对疫苗潜在的安全性问题还需进一步评估，且冷链储存和运输方面存在的问题及较高的经济成本还需进一步改善。

1.5国产口服RV活疫苗

在我国主要使用兰州生物所研制的国产口服RV活疫苗LLR。LLR是由1985年首次从羔羊体内分离的RV株G10P[15]制备的单价口服减毒活疫苗，于2000年获得许可上市，目前只在中国使用，适用于2个月~3岁的婴幼儿。

在LLR上市后进行的几项基于人群的病例对照试验表明，LLR疫苗对RVGE的保护率为35.0%~73.3%，并且对于G3血清型引起的中度RVGE具有更高的保护作用[27-28]。张潮等[29]以随机招募100名接种LLR疫苗者为疫苗组，100名未接种疫苗者为对照组，通过比较2组间RV的感染情况、外周血中抗RV IgA抗体和IgG抗体的差异，发现疫苗组粪便RV抗原检出率明显降低，表明LLR疫苗可显著减少RVGE发生率；且疫苗组的外周血IgA与IgG水平显著高于对照组，推测外周血的抗RV IgA和抗RV IgG抗体水平对LLR疫苗接种效果有一定预测价值。

此外，疫苗接种效果还与首剂接种时间、接种次数等因素有关，接种时间早，且选择母乳喂养者，并完成全部疫苗接种程序，粪便中RV抗原的检出率更低，表明疫苗接种效果更好[27]。然而该疫苗尚未纳入我国国家免疫计划，免疫覆盖率相对较低[30]。

2RV疫苗的研究进展

目前，获批上市的RV疫苗基本都为减毒活疫苗，作用机制是将病毒减毒后在肠道中复制，诱导肠道产生免疫应答，但有可能带来肠套叠等胃肠道不良反应。因此，继续优化RV减毒活疫苗，或者开发替代RV减毒活疫苗的其他疫苗，包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，对进一步降低RV导致的发病率和死亡率具有重要意义。

2.1三价RV基因重组疫苗

三价RV基因重组疫苗（LLR3）是在原已上市销售的单价羔羊P[12]G10 RV疫苗的基础上，通过基因重配技术采用G2、G3和G4型人RV分别与LLR进行基因重配，获得3个分别含有G2、G3和G4型人RV的VP7基因的人-羊RV重配株，并用该3个毒株研制了三价RV重组疫苗[31]。

疫苗接种方式为口服。该疫苗覆盖了几种常见的RV血清型（G2、G3、G4型），能够更好地刺激机体产生免疫应答，有效预防RV感染[31]。Xia等[32]在中国河南的健康婴儿中进行了1项随机、双盲、安慰剂对照III期临床试验，以评估LLR3对RVGE的预防效果。试验将9 998名6~13周龄健康儿童纳入临床研究，LLR3疫苗组和安慰剂组受试者各4 999名，按照0、1、2个月的免疫程序随机服用3剂次口服LLR3或安慰剂。在接种疫苗后的2个流行季节中，分析了LLR3对RVGE的疫苗效力。

结果发现LLR3疫苗对于所有RVGE和严重RVGE的疫苗效力分别为56.6%和70.3%，其中第1个流行季节疫苗效力分别为75.2%和59.3%，第2个流行季节疫苗效力分别为68.8%和55.1%，表明第2个流行季节的疫苗效力呈现些许下降的趋势。此外，LLR3抗原是G2、G3、G4血清型，缺乏G9、G1和P[8]型，但在近万名受试者中，对G9、G1和P[8]型仍显示出良好的免疫原性、有效性和安全性。

2.2口服六价重配RV活疫苗

六价牛-人重组RV减毒活疫苗含有6种流行株血清G1、G2、G3、G4、G8及G9，涵盖了A群RV 99.6%的G血清型病毒，由武汉生物制品研究所有限责任公司研发，被证明在动物中安全且具有良好的免疫原性，并已被国家药品监督管理局批准进行临床试验。

Wu等[33]在中国河北省正定县进行了1项随机、双盲、安慰剂对照的Ⅰ期临床试验，纳入了120名6~12周龄的健康婴儿，分为疫苗组和安慰剂对照组。受试婴儿接种了高、中、低剂量的疫苗或安慰剂，每隔4周口服接种1次，采用ELISA测定抗RV IgA抗体的几何平均浓度（geometric mean concentration，GMC）和血清转化率以评估免疫应答。

研究发现疫苗组中抗每种RV血清型IgA抗体的血清转化率显著高于安慰剂组，高剂量组抗RV IgA血清转化率约为90.00%，中剂量组所有RV血清型的血清转化率为45.45%，低剂量组的血清转化率为42.11%~63.16%；高剂量组的GMC，除G3血清型外，均高于153.46 U/ml；中剂量组的GMC，最低为G3血清型的31.23 U/ml，最高为G4血清型的49.46 U/ml；低剂量组的GMC，最低为G3血清型的25.90 U/ml，最高为G9血清型的41.88 U/ml；安慰剂组的GMC约为10.00 U/ml[33]。

综上表明，高剂量组的IgA抗体血清转化率高于低剂量组和中剂量组，疫苗接种者在第3次给药后GMC也普遍高于安慰剂接种者，六价重配RV活疫苗初步显示了良好的免疫原性。目前，新型六价RV疫苗的Ⅲ期临床试验正在进行中，以进一步评估其安全性、免疫原性和免疫保护效力。

2.3RV亚单位疫苗

2.3.1  RV病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗   

VLP是具有自我组装能力的多亚单位蛋白质结构，与天然病毒相比，不含遗传物质，不具传染性，但模拟了天然病毒的整体结构，通常比单体蛋白质结构更具免疫原性[34]。VLP的颗粒大小范围为20~100 nm，这恰好是树突状细胞吸收纳米颗粒和激活T细胞产生免疫应答的最佳范围[35]。

RV-VLP的生产首次报告于20世纪80年代[36]。20世纪90年代，Crawford等[35]通过昆虫杆状病毒表达系统以不同组合分别表达了RV-VP2/VP6/VP7的3层VLP和RV-VP6/7的双层VLP，并在小鼠中评估了其免疫原性：在同样使用佐剂QS-21的情况下，3层VP2/6/7-VLP产生的抗体GMC比双层VP6/7-VLP的更高。

此外，Li等[38]通过大肠埃希菌表达RV衣壳蛋白VP2和VP6，纯化后组装成单层VP6-VLP或双层VP2/6-VLP，并在小鼠中进行了免疫原性的比较，发现双层VP2/6-VLP对RV诱导小鼠腹泻的保护率显著高于单层VP6-VLP。综上2个研究显示，3层RV-VLP对小鼠产生的保护率高于双层RV-VLP，双层RV-VLP对小鼠产生的保护率显著高于单层RV-VLP。

并且证实了VP6在形成RV-VLP的过程中发挥着关键作用。之前关于RV-VLP的免疫原性评估尚停留在实验室阶段，而近期Kurokawa等[39]在澳大利亚婴儿中进行了1项植物源性VP2/6/7-VLP的Ⅰ期临床试验，试验分为疫苗组（按剂量递增的方式接种疫苗）和安慰剂组。

结果显示，第2次和第3次注射后4周，RV-VLP疫苗诱导婴儿产生了抗G1P[8] IgG应答，第3次给药4周后，所有RV VLP婴儿组对同源G1P[8]RV的中和抗体应答均高于安慰剂组。且注射RV VLP疫苗后，没有出现安全性或耐受性问题。另外婴儿受试者的免疫反应并没有根据剂量的差异而出现明显的变化，所以有必要进一步研究剂量-反应关系，以探索植物源性RV VLP疫苗的最佳剂量。

2.3.2  P2-VP8-P[8]重组亚单位疫苗   

P2-VP8-P[8]重组亚单位疫苗由截短的RV-VP8（由RV衣壳蛋白VP4经胰蛋白酶裂解而来）与破伤风毒素的P2表位融合，在大肠埃希菌中表达所得[40-41]。此疫苗诱导的对P[8]毒株的中和抗体应答最为强烈，对P[4]毒株中等，对P[6]毒株却相当有限，基于此1种三价疫苗得以开发，包括来自P[4]、P[6]和P[8]毒株的抗原，该疫苗诱导的对这3种P型毒株的应答更为平衡。

Groome等[40]在南非开展了1项双盲、随机、安慰剂对照、剂量递增的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，发现实验组（15、30和90 µg）在第3次注射后4周对P[4]、P[6]和P[8]抗原产生的IgG和IgA抗体滴度是注射前的5倍，产生的中和抗体滴度是注射前的3.7倍，且各剂量组诱导的对P[4]、P[6]和P[8]的IgG和IgA抗体滴度和中和抗体应答均显著高于安慰剂组。

此外，30 μg组有58%~83%的婴儿出现抗P2-VP8 IgG抗体应答，而 90 μg组有高达83%~92%的婴儿出现IgG抗体应答；30 μg组只有50%~83%的婴儿出现IgA抗体应答，而90 μg组有高达67%~92%的婴儿出现抗P2-VP8 IgA抗体应答[40]。表明随着剂量的增加，出现抗体应答的效果越好。目前P2-VP8-P[8]疫苗已在Ⅲ期临床试验中对安全性、免疫原性和有效性进行了评估，但具体结果还未公布。

2.4RV灭活疫苗（inactivted RV vaccine，IRV）

美国CDC研发的一种可进行肠外给药的IRV CDC-9是一种单基因重配疫苗，VP3基因来自G2P4毒株，其他基因来自G1P[8]毒株[42]，在Vero细胞中培养，经热处理灭活。在临床前研究中，Resch等[43]通过肌内注射（intramuscular，IM）或使用微针贴片（microneedle，MN）进行疫苗接种，后对CDC-9 IRV的免疫应答进行评估。

研究发现以MN贴片方式接种疫苗后，诱导了相当水平的体液免疫，但与MN接种方式相比，IM接种方式可诱导更高水平的体液免疫[41]。需要关注的是，IM接种时是配制Al(OH)3佐剂使用的[42]。考虑到口服病毒活疫苗所带来的不良反应以及肠道微环境对疫苗有效性的干扰，通过IM给药或MN贴片注射IRV有望成为口服RV疫苗的一种替代和改进的方法。Shahrudin等[45]在小鼠体内测试了用50 kGy辐照的γ射线灭活RV的免疫原性，发现与活RV诱导的体液免疫应答相当，特别是可诱导高水平的IgG2c。

中国医学科学院医学生物所研制的IRV使用Vero细胞培养的G1P[8]人RV经热处理灭活，并与Al(OH)3佐剂配伍制成。以小鼠为动物模型，发现灭活疫苗可以诱发血清IgG和IgA、肠道IgG和IgA及中和抗体等全身和局部体液免疫应答，且中和抗体在体外可以中和同型感染性Wa株(G1型)RV和异型感染性SA11 株（G3型）RV，显示出一定的交叉保护作用[46]。

已有1项针对此IRV（Vero细胞）在健康人群中接种的安全性及初步观察免疫原性的随机、双盲、安慰剂对照Ⅰ期临床试验，受试者为18~49岁的成人、6~17岁的青少年、2~6月龄和7~71月龄的婴幼儿；试验分为疫苗组和对照组，其中疫苗组分为3组，每组每人每次剂量为0.5 ml，分别含RV灭活抗原80、160、320 EU，接种3剂，每次注射间隔28 d[47]。该试验于2021年11月完成，对受试者的安全性和初步免疫原性进行了评估，目前结果尚未公布。

3结论与展望

减毒活疫苗的推广一定程度上缓解了由RV带来的疾病负担，但仍有一些问题亟待解决，如安全问题（肠道不良反应等）、国家间的疗效差异问题（发达国家的疗效高于发展中国家的疗效等）以及高成本问题（冷链运输问题等）。

为此，在继续改进减毒活疫苗的同时还需要考虑其他疫苗研发平台来进行RV疫苗的研发。在改进减毒活疫苗方面，三价RV基因重组疫苗（LLR3）和六价牛-人重组RV减毒活疫苗实现了覆盖多种血清型，从而对RV引起的胃肠炎发挥了更好的保护作用，当前已经进入了临床试验阶段；除活疫苗外，还考虑了如灭活疫苗和亚单位疫苗等疫苗研发平台：

灭活疫苗使用物理或化学方法将具有感染性的病毒杀死但同时保持其抗原颗粒的完整性，使其失去致病力而保留抗原性，保证了疫苗使用的安全性，但在有效性方面还需进一步提升；亚单位疫苗筛选具有免疫活性的病毒蛋白质结构，不含核酸，结构模拟原病毒，常配制佐剂使用，在使用安全的基础上更好地刺激了机体产生免疫应答，但如何提高蛋白的表达量、优化纯化条件是亚单位疫苗研发的重点。

当前无论是RV灭活疫苗还是重组亚单位疫苗都尚处于前期研发或者临床研究阶段，对实验动物显示了一定的保护效果，但其人体的免疫保护效果还需进一步研究，应用前景值得期待。

撰写 | 中国生物、国际生物制品学杂志 

校稿 | Gddra  

编审 | Hide / Blue sea

编辑  设计 |  Alice