生化反应曲线解析2（速率法）

上一篇推送内容，我们介绍了终点法以及反应曲线，陆续收到很多粉丝私信，要求介绍异常反应曲线，该内容会后续推送，敬请关注。

本期我们延续上一期内容，介绍速率法（速率法A和两点速率法）

速率法：

要了解该方法需要先理解酶促反应的一些特性，在反应刚开始时有一段延迟期，在该期内，酶刚与底物接触，反应产物的增加或底物的消耗较少，吸光度的变化不明显。待反应进行一段时间后，反应进入线性期（也称为零级反应期），此时底物浓度仍处于过量状态，在此阶段产物的增加或底物的消耗达到一个稳定的状态，即单位时间内底物的消耗量或产物的生成量是恒定的，此时的反应速度与底物浓度无关，只与酶活性有关，通过检测这段时间的产物生成量或底物消量来计算出酶的活性。随着时间的延长，底物因酶的催化消耗、产物的增加而出现逆反应，反应的产物可能有抑制酶反应的作用，酶促反应缓慢，反应速率变慢，偏离了线性反应期，进入一级反应期，不成线性。Rate A法就是通过测量零级反应线性期内的测光点的吸光度变化来得到被测物浓度或活性值。

速率法实例1（速率法A）

如ALT项目，血清中的ALT催化试剂盒中该酶的特异性底物丙氨酸，生成产物丙酮酸，而丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下，偶联还原性辅酶辅酶系统，使得有NADH向NAD+转化。由于NADH在340nm下有吸收波峰，所以通过该波长下，NADH的降低速度与ALT的活性成正比，故可得到血清中ALT的活性。

反应原理式如下：

如下图，在日立7180上的反应曲线

其中横坐标表示时间（以测光点表示，10min共记录34次吸光度），纵坐标为吸光度，反应模式是先加入样品，再加入R1试剂，开始测光（约每18S记录一次吸光度），该过程并未发生反应，通过反应曲线可以看出，吸光度值较高，主要是试剂中的NADH在340nm波长下产生的吸光度，加入R2试剂，血清中ALT开始催化底物启动反应，由于消耗NADH，故吸光度呈现下降趋势。通过测定测光点20-26吸光度变化（通过最小二乘法计算吸光度变化，所有测光点参与计算，如下图紫色区域），该变化速度与ALT的活性成正比。

采用速率法A的项目如

几乎全部酶类：ALT、AST、GGT、CHE、AMY、LPS、LDH、ALP、CK、CKMB等（有一个酶不是采用速率法，SOD，知道什么名字？想想那个广告，大宝天天见，是否已经想到是超氧化酶歧化酶~~）

非酶类项目：HCY、TBA（部分厂家采用两点速率法）、BUN（部分厂家采用采用两点速率法）等。

速率法2（两点速率法）

某些项目，需要用速率法测定，但是受到方法学原因，或者是技术原因，反应速度不能像速率法A那样恒定（速率法A要求在测光点范围内速度变化恒定，具体判断规则后期会推送一篇文章专门介绍），所以采用选定的两个测光点的平均速度进行计算，也成为固定时间法，这也是两点速率法和速率法A的最基本区别。

如下图反应曲线

通过计算27点与20点的平均速度进行结果计算。

采用两点速率法的项目如

CO2，BUN（部分厂家）、CRE（苦味酸法）、TBA（部分厂家）等。

速率法常见小问题汇总

1. 为什么有的反应方向向上，有的向下？

   如果是测底物消耗，则反应方向是下降的，如果是测产物生成，则反应方向向上。

2. 两点速率法和速率法A的区别是什么？

   速度的计算方法不一样，速率法A是通过最小二乘法计算单位时间吸光度变化（实时速度），选择的测光点内的所有点都用于计算，两点速率法是通过两个测光点计算的平均速度。

3. 那个方法学更好？

   从严谨的角度考虑，速率法A要好。但是有些项目如CO2，反应速度不能恒定，如果选择用速率法A，则会出现线性报警（后续后介绍）。

4. 为什么设置第一个测光点时，不从加入R2试剂启动反应后开始测定，而是说明书会提示加入R2试剂1min后开始测光？

   由于刚加入R2试剂，酶与底物刚结合，处于处于酶动力学的延迟期，这时候酶的活性没有达到最大，反应速度不恒定，需要达到零级反应测定。

以上为方法学的全部内容，欢迎大家给建议。

检验之声原创文章。 

编辑：青翠欲滴，校审：晨晨