疫苗前沿 | Vero细胞在疫苗生产工艺中的发展历程

3.悬浮培养Vero细胞

微载体一般采用玻璃、塑料或其他具有不同密度、孔隙度和表面处理的小球，这些球状体分布在反应器内被不停搅动的培养液中，作为贴壁细胞生长的平台。这种Vero细胞培养工艺比较复杂，比如在细胞传代过程中需要先将Vero细胞与微载体分离，随后又要使Vero重新附着在微载体上。与之相比悬浮培养细胞的工艺操作更加简洁。

想要悬浮培养Vero细胞，首先要使细胞适应悬浮生长。人们先将贴壁细胞在无血清培养基中复苏后，再使细胞继续在无血清培养基中适应悬浮培养，适应过程需要5-8周。

适应悬浮生长后的Vero细胞能否用于疫苗生产，其安全性是关键。通过研究发现，分别将贴壁和悬浮生长的Vero细胞传代一定代数后提取其各自的DNA，对他们的短串联重复序列分析，并同时与多种Vero细胞克隆的DNA样品进行比较。电泳结果显示，所有样品的结果保持一致。因此悬浮生长的Vero细胞在一定传代代数内具有遗传稳定性。另外，通过小鼠皮下注射163代悬浮生长Vero细胞实验，人们发现163代悬浮生长Vero细胞不具有致癌性。因此悬浮生长的Vero细胞安全性是可靠的。

安全性得到保证之后，人们开始研究是否悬浮生长的Vero细胞比贴壁生长的Vero细胞能产出更高滴度的病毒。以水疱性口炎病毒VSV为例，用VSV分别接种密度相同的两种细胞，然后发现通过悬浮细胞培养可以收获更高滴度的病毒（图3）。随后人们还对病毒产量与细胞密度的关系进行了探究。还是以VSV实验对象，当用密度为0.87*106个/ mL的细胞接种病毒时，收获的病毒滴度为2.3*109TCID50%/mL，当提升细胞密度至2.5*106个/ mL时，收获的病毒滴度大幅提升至8.9*109TCID50%/mL，而继续提升细胞密度至5.0*106个/ mL时，收获的病毒滴度并没有随之提升，反而略微下降（图4）。说明并不是细胞密度越高收获的病毒滴度越高，最佳接种时的细胞密度还需要进一步探究。另外，与贴壁生长的Vero细胞情况相同，采取连续发酵的方式，最终获得的细胞产量比补料分批发酵和分批发酵高。

图3.蓝色柱表示贴壁生长的Vero细胞，红色柱表示悬浮生长的Vero细胞，纵坐标为收获时病毒滴度。  

图4.横坐标为接种病毒时细胞的密度，纵坐标为收获时病毒滴度。  

4.展望  

Vero细胞系是第一种被WHO认可用于生产人类疫苗的细胞系。由于其安全、能高效产出病毒而在疫苗生产中被广泛使用，包括狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、EV71疫苗、流感疫苗的生产以及其他多种疫苗的生产。  

除了鸡胚及Vero细胞之外，人二倍体细胞也是一种制备疫苗的重要细胞基质。由于人二倍体细胞与人类基因组相同、无外源因子、对多种病毒易感性、无潜在致瘤性、所制备的人二倍体疫苗安全性同样能够得到保证。用于疫苗制备的人二倍体细胞主要有WI-38、MRC-5、2BS和KMB-17等细胞系。然而,人二倍体细胞为有限性细胞,细胞的来源和培养技术等存在某些缺陷,进而影响其应用。为了安全、快速、低沉本地制造疫苗，人们对产生病毒的细胞基质的挖掘和工艺的优化在不断进行中。  

撰写 | 生物制品圈

校稿 | Gddra  

编审 | Hide / Blue sea

编辑  设计 |  Alice