12+！结直肠癌微卫星稳定性相关分析~

导语

熟练错配修复或微卫星稳定性 (pMMR/MSS) 结直肠癌 (CRC) 对免疫检查点阻断 (ICB) 疗法的疗效有限，其潜在机制仍不清楚。鸟苷酸结合蛋白 2 (GBP2) 是 GTPase 家族的成员，对于宿主对病原体的免疫至关重要。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章通过微卫星稳定性结直肠癌的亚型显示鸟苷酸结合蛋白 2 (GBP2) 可以作为潜在的免疫治疗靶点，文章发表在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上，影响因子为12.469，文章题目为：Subtyping of microsatellite stability colorectal cancer reveals guanylate binding protein 2 (GBP2) as a potential immunotherapeutic target。

数据介绍

本研究选择了六个独立队列，包括总共 1424 名 pMMR/MSS 和 457 名 dMMR/MSI CRC 患者：GSE39582；来自TCGA的结肠腺癌 (COAD)；GSE41258；GSE26682；合并队列 1 和合并队列 2。合并队列 1 由 GSE4554、GSE13067、GSE13294、GSE18088 和 GSE75316 组成。合并队列 2 由 GSE35896 和 GSE39084 组成。 

数据介绍          

本研究技术路线如图所示。

结果解析

01、pMMR/MSS CRC中存在免疫类别

为了解释为什么少数 MSS CRC 患者对抗 PD-1 治疗有反应，本研究通过在六个独立的 pMMR/MSS CRC 队列中应用基于基因表达的共识聚类方法对 MSS CRC 患者进行分层，确定了两个不同的类别（簇 1 和簇 2）。本研究发现其中一个簇中的患者表现出显著丰富的识别免疫细胞或免疫反应的特征。同时，还观察到 MSI 肿瘤与高度浸润的 MSS 肿瘤之间的高度相似性（图 1A、C ）。因此，本研究将这两个类别称为免疫类别（IC）和非免疫类别（non-IC）。

图 1

此外，与非 IC 组相比，在 IC 组和 MSI 组中观察到T 细胞炎症基因表达谱（GEP）、先天性抗 PD-1 耐药性（IPRES）和免疫预测评分（IMPRES）特征的富集评分更高（图1B、D ）。这些数据表明 pMMR/MSS CRC 样本中存在免疫异质性。

02、GBP2表达在IC中上调

接下来，本研究试图发现在 pMMR/MSS CRC 中区分 IC 和非 IC 的潜在机制。本研究计算了 COAD 队列中 IC 和非 IC 之间的 DEG，以与已报道的 3800 多个 RBP 相交，获得了 682 个差异表达的 RBP。通过单变量Cox比例风险回归分析，最终得到22个基因（图2A）。前五个基因如图 2B 所示。然后本研究计算了前五个基因与上述免疫特征之间的相关性，发现 S100 钙结合蛋白 B (S100B) 和 GBP2 与这些免疫特征显著正相关（图 2C）。然而，据报道，S100B 的过度表达可促进 CRC 进展，可作为术后早期复发的独立预测因子。S100B 高表达的患者临床结果也较差。相反，GBP2 在癌症中很少见报道，GBP2 的高表达增加了紫杉醇耐药 CRC 对紫杉醇的敏感性。因此，本研究选择 GBP2 进行进一步研究。

图 2

基于 GEPIA2 数据库，本研究首先发现与正常样本相比，CRC 中 GBP2 表达显著降低，并且主要在 MSI-L/MSS CRC 中降低（图 2D）。IC 和 MSI 组中 GBP2 的上调在六个独立的 CRC 队列中得到验证（图 2E）。此外，Guinney 等人提出了一种稳健的分类系统，可以将 CRC 分为四种具有鲜明特征的 CMS：CMS1；CMS2；CMS3和 CMS4。本研究发现 CMS1 亚型的 GBP2 表达最高，而 CMS2 亚型的 GBP2 表达最低（图 2F）。 

为了进一步确定 GBP2 在 pMMR/MSS CRC 中的潜在生物学功能，本研究应用了 GSEA 和基因本体论 (GO) 分析。六个队列中的数据显示，具有高 GBP2 表达的患者显著在几种免疫相关通路和功能富集，尤其是干扰素-γ (IFN-γ) 反应、IFN-γ 介导的信号通路和 T 细胞活化（图 2G， H ）。这些发现表明 GBP2 主要通过调节 IFN-γ 反应和 T 细胞活化参与 pMMR/MSS CRC 的免疫反应。

03、GBP2低表达与CRC患者预后不良相关

接下来，本研究检查了 GBP2 与临床特征之间的相关性。本研究首先探讨了 GBP2 在 CRC 中的预后作用。结果表明，GBP2 的低表达预示着 GSE39582、COAD 和 TMA 队列中较差的 OS 和无复发生存期（图 2I）。然而，在 MSI CRC 样本中未发现 GBP2 表达与预后之间存在关系。接下来本研究在 GSE131418 数据集中分析了 GBP2 与转移之间的关系，该数据集包含 878 个原发性 CRC 和 257 个转移性 CRC。GBP2低表达组的转移患者数量(35.1%，199/567)明显高于高表达组(10.2%，58/568)(图2J)。因此，GBP2可能与结直肠癌转移密切相关，但GBP2表达与结直肠癌临床特征的相关性有待进一步研究。

04、pMMR/MSS CRC中GBP2表达与肿瘤CD8+T细胞浸润呈正相关  

为了进一步探索 GBP2 与 MSS CRC 免疫微环境之间的关系，本研究分析了来自 8 名 MSS CRC 患者的单细胞 RNA 测序数据（图 3A）。结果发现在 GBP2 表达最高的两名患者中，CD4 + 和 CD8+ T 细胞浸润显著增加（图 3B、C）。此外，GBP2 在六个队列中与 CD8A 呈正相关（图 3D）。本研究还使用 ssGSEA 算法来估计每个 MSS CRC 样本中 28 个浸润性免疫细胞的浸润水平，结果发现 GBP2 表达与发炎的免疫微环境之间存在很大相关性，并且主要与六个队列中的 CD8 + T 细胞呈正相关（图 3E）。此外，本研究发现 GBP2 与大多数抗肿瘤免疫步骤高度相关，例如癌细胞抗原的释放（步骤 1）、癌症抗原呈递（步骤 2）、引发和激活（步骤 3）、免疫细胞的运输肿瘤（第 4 步）。在骨髓来源的抑制细胞 (MDSC) 和 Treg 细胞的运输中没有发现显著差异（图 3F ）。

图 3

由于上述结论是基于生物信息学分析得出的，因此需要进一步验证以提供足够的证据证明 GBP2 的高表达与 pMMR/MSS CRC 中较高的肿瘤 CD8 + T 细胞浸润有关。因此，本研究在 TMA 队列中验证了这些结果。根据四种 MMR 蛋白的核免疫组织化学染色结果，总共包括 62 个 MSS CRC 样本用于后续分析。结果发现具有高百分比 GBP2- 阳性的样本显示出更高的 CD8 和 PD-L1 阳性百分比和细胞计数（图 4A、B ）。一致地，GBP2 阳性百分比与 CD8 和 PD-L1 阳性百分比呈正相关（图 4C、D）。本研究还根据 CD8 + T 细胞的阳性百分比将 TMA 中的 MSS CRC 样本分为 IC 组和非 IC 组。结果进一步证实，与非 IC 组相比，IC 组的 GBP2 阳性率更高（图 4E）。生存分析表明，在 TMA 队列的 MSS CRC 中，高百分比的 GBP2 阳性与更好的 OS 相关（图 4G）。综上所述，这些结果表明 GBP2 与 pMMR/MSS CRC 中更高的 CD8 + T 细胞浸润相关（图 4F）。

图 4

05、在pMMR/MSS CRC中，GBP2表达相关研究

由于 GBP2 表达与较高的 CD8 + T 细胞浸润高度相关，本研究分析了 GBP2 表达与 CXCL 家族之间的关系。 本研究发现 GBP2 表达与六个队列中的 CXCL9、CXCL10、CXCL11 和 CXCL13 水平显著正相关（图5A)。同时，本研究发现 IFN-γ 主要激活 HT29 和 SW480 细胞中 CXCL10 和 CXCL11 的表达。因此，本研究主要关注研究 GBP2 和 CXCL10/11 之间的关系。为验证上述发现，本研究在两种 MSS CRC 细胞系（HT29 和 SW480）中使用小干扰 RNA (siRNA) 沉默 GBP2 表达。结果表明，GBP2 本身对 CXCL10/11 的表达没有影响，在 IFN-γ 刺激下，GBP2 敲低细胞中 CXCL10/11 的 mRNA 水平显著下调（图 5B、C）。 ELISA 结果进一步证实，下调 GBP2 可抑制 CXCL10 和 CXCL11 响应 IFN-γ 的蛋白表达（图 5D、E）。总之，这些结果表明 GBP2 的高表达与 CXCL10 和 CXCL11 的更高表达和分泌相关。

图 5

另外，本研究还发现 GBP2 表达与六个 CRC 队列中的 HLA-I APM 表达显著正相关（图 5F）。GBP2 高表达的患者不仅具有更高水平的 CD8 + T 细胞浸润，而且在六个 pMMR/MSS CRC 队列中也具有更高水平的 HLA-I APM 表达（图 5G）。然而，响应 IFN-γ，GBP2-敲低细胞中 HLA-I APM 表达显著降低（图 5H，I）。同样，流式细胞术也发现 GBP2 的敲低抑制了 IFN-γ 刺激下 MHC-I 的表达（图 5J，K）。总之，这些结果表明高 GBP2 表达与更高表达的 HLA-1 APM 相关。

06、在pMMR/MSS CRC中，GBP2与SHP1相关研究

接下来，本研究试图从机制上说明GBP2对pMMR/MSS CRC免疫微环境的影响。本研究观察了GBP2表达的改变是否可以调节pMMR/MSS CRC中STAT1磷酸化的激活。在HT29和SW480细胞中，GBP2的沉默降低了磷酸化STAT1 (p- STAT1)的激活(图6A)。在GBP2沉默的细胞中重建GBP2可以增加p- STAT1的激活(图6B)。

此外，STAT1磷酸化可以通过直接与负调控因子相互作用而被抑制，如含SH2的蛋白酪氨酸磷酸酶1 (SHP1)。本研究发现，经Na3VO4(一种非特异性酪氨酸磷酸酶抑制剂)处理后，上述降低的STAT1磷酸化可以得到恢复(图6C)。在GBP2沉默的细胞中，SHP1的下调损害了STAT1的去磷酸化(图6D)。

图 6

接下来本研究假设GBP2可以与SHP1竞争结合STAT1。本研究首先使用ClusPro 2.0将SHP1蛋白和GBP2蛋白与p- STAT1蛋白进行对接。结果显示，GBP2和SHP1与STAT1具有相似的相互作用域(图6E)。为了进一步验证这一假设，本研究进行了免疫共沉淀实验，发现在体外IFN-γ刺激下，GBP2和SHP1与STAT1相互作用显著增加(图6F)。此外，在GBP2沉默的细胞中，SHP1和p- STAT1之间的相互作用增加(图6G)。综上所述，这些结果表明，GBP2通过与SHP1竞争结合STAT1来增强STAT1的磷酸化。

07、GBP2缺失削弱体内PD1阻断的功效

据报道，p-STAT1 表达可能是乳腺癌患者 ICB 的潜在生物标志物，因此，本研究推测 GBP2 可能影响免疫治疗在 pMMR/MSS CRC 中的疗效。结果发现具有高 GBP2 表达的患者与反应组 PD-1 信号高度正相关（图 7A ）。在高 GBP2 组中也观察到更高的 T 细胞炎症 GEP、IPRES 和 IMPRES 特征富集分数（图 7B ）。本研究进一步分析了高 GBP2 组和低 GBP2 组之间通过 SubMap 响应 ICB 的概率。通过将GBP2 表达谱与已发表的黑色素瘤免疫治疗数据集进行比较，结果表明，高 GBP2 组与六个队列中的 PD-1 反应组高度相似（图 7C ）。在六个队列中也观察到 GBP2 和 PD-L1 之间存在高度相关性（图 7D）。

图 7

为了检验这个假设，本研究构建了两个缺乏 GBP2 的 CT26 细胞系（图 7E）。结果发现在植入免疫缺陷 NSG 小鼠的 GBP2 KO 肿瘤中仅观察到肿瘤体积略有增加（图 7F）。然而，在野生型小鼠中，GBP2 KO + IgG 组的肿瘤体积明显大于 Vec + IgG 组。此外，抗 PD-1 治疗导致约 43.7% 的肿瘤抑制率，而 GBP2 的消耗仅导致约 16.9% 的肿瘤抑制率，表明 GBP2 在对 PD-1 阻断的反应性中的潜在作用（图 7G， H）。本研究通过流式细胞术分析发现 GBP2-KO 组的肿瘤具有较低水平的 CD3 + CD8 + T 细胞浸润（图 7I，J）。FACS 数据还表明 GBP2-KO 组中的 IFN-γ 和 TNF-α 水平降低（图 7K）。

最后，本研究通过免疫组织化学 (IHC) 确定了 GBP2 高和低 CRC 肿瘤中 CD8a、MHC I 类和 CXCL10/11 的表达水平。结果发现瘤内 CD8a、MHC I 类和 CXCL10/11 表达也与 CRC 肿瘤中的 GBP2 水平呈正相关（图 7L）。总之，这些结果表明表达高水平 GBP2 的肿瘤对抗 PD-1 疗法敏感（图 7M）。

小编总结

这篇文章将 pMMR/MSS CRC 分为免疫类和非免疫类，并确定 GBP2 是与 ICB 联合治疗的有希望的靶标。首次揭示了 GBP2 促进 pMMR/MSS CRC 中 STAT1 磷酸化的新机制。缺陷在于尽管GBP2 可以作为增强 ICB 治疗疗效和患者反应的生物标志物，然而，GBP2 与 pMMR/MSS CRC 的免疫监视和免疫治疗之间的相关性尚未见报道。总之本研究从微卫星稳定性的角度进行了切入和分析，值得大家借鉴！

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