科研丨J DENT RES: 小鼠口腔宏转录组揭示牙周病的微生物和宿主特征

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

牙周病伴随着龈下微生物组和宿主组织的细胞特征和生物活性的改变。尽管与疾病中的破坏性失衡相比，在描述健康状态中宿主-共生微生物相互作用的稳态平衡的分子基础方面取得了重大进展，尤其是在免疫和炎症系统方面，但很少有研究尝试在不同的宿主模型中进行全面分析。本研究描述了一种基于牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)灌胃感染C57BL6/J小鼠构建的小鼠牙周病模型中宏转录组学方法的开发和应用，该方法可用于分析宿主-微生物基因转录。本研究从单个小鼠口腔拭子中生成了24个宏转录组文库，代表健康和疾病。平均而言，每个样本中有76% ± 11.7%的reads属于小鼠宿主基因组，其余属于微生物。我们发现3468个(占总体的2.4%)小鼠宿主转录本在健康和疾病组之间存在差异表达，其中76%在牙周炎中过表达。可以预见，在疾病组中，与宿主免疫区室相关的基因和通路发生了显著改变，CD40信号通路是该数据集中最丰富的生物过程。此外，本研究还观察到疾病组中其他生物过程的显著变化，特别是细胞/代谢过程和生物调节。差异表达的微生物基因的数量特别说明了疾病中碳代谢途径的转变，并可能影响代谢终产物的形成。总之，这些宏转录组数据揭示了小鼠宿主和微生物群中基因表达模式之间的显著变化，这可能代表了健康和疾病的特征，为未来牙周病原核和真核细胞反应的功能研究提供了基础。此外，本研究中开发的非侵入性方案将使宿主-微生物基因表达网络的进一步纵向和干预研究成为可能。  

论文ID

原名：The Murine Oral Metatranscriptome Reveals Microbial and Host Signatures of Periodontal Disease

译名：小鼠口腔宏转录组揭示牙周病的微生物和宿主特征

期刊：Journal of Dental Research

IF：8.924

发表时间：2023.3

通讯作者：S. Joseph

通讯作者单位：英国伦敦国王学院

DOI号：10.1177/00220345221149675

实验设计

结果

图1中的流程图总结了本研究的实验方案。与健康对照组相比，接受3次牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)口腔灌胃的牙周病组小鼠表现出显著的牙槽骨水平下降(附录图1)，在8周内平均骨质丢失0.03±0.01 mm(P=0.0003)(图1)。

图1

小鼠口腔宏转录组学研究采用的实验方案的流程图。图中显示了对照组(蓝色)和牙龈卟啉单胞菌处理小鼠(红色)灌胃8周后的牙槽骨水平。骨质丢失表示为相对于基线的负值。每个点代表单个小鼠骨水平的平均值±SD，水平线表示每组的平均骨水平(***P<0.0005)。该图使用BioRender生成。  

1.与健康SPF小鼠相比，实验室SPF牙周病小鼠的宿主口腔宏转录组谱存在显著差异

在来自小鼠口腔拭子的Illumina Next-Seq转录组测序数据中，每个样本中76%±11.7% reads属于小鼠宿主基因组。选择用于细菌基因注释的其余信使RNA(mRNA) reads占微生物总reads的5%±1.6%。

使用最小平均倍数变化(fold change，FC)阈值为2(FC >2)、P<0.05和效应量>0.5的过滤器，本研究发现宿主基因转录本中共有3468个转录本在健康与疾病之间存在差异。每种条件下基于倍数变化的前100个基因列于附录表1中。3468个转录本的完整列表可在https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20364114获得。其中，836个(24%)转录本在对照小鼠中大量出现，其中268个(32%)在所有患病小鼠样本中缺失。其余的2632个转录本(76%)在患病组中表现出过表达，其中811个(30%)转录本在所有对照小鼠样本中缺失(图2A)。宿主转录本的典型相关分析(CCAs)揭示了对照和疾病样本的分离，大部分方差沿坐标轴1解释(图2B)，尽管Adonis检验(P=0.76)没有统计学意义。

在基因水平上，这些差异表达的转录本代表3067个独特的基因，在健康(24.9%)和疾病(75.1%)之间具有相似的分布。使用Panther分类系统将这些基因分为22个不同的蛋白质类别(图2C)。

除了健康组与疾病组之间的差异表达外，本研究中健康小鼠口腔宏转录组产生了108,807个转录本，根据基因表达水平排名前500位的转录本已列于附录表2，供读者查阅。可在https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20364117上查阅可作为有用参考数据集的大量转录本。

图2

小鼠宿主口腔宏转录组中健康(蓝色)和牙周病(红色)之间差异表达基因的快照。(A)基于健康和疾病组中存在和/或不存在(倍数变化>2)的差异表达基因的分类。(B)典型相关分析(CCA)图显示了基于宿主基因表达的24个小鼠样本的分布。(C)基于蛋白质类别的健康和疾病中差异表达基因的百分比细分。(D)基于生物过程基因本体(GO)的健康和疾病组中差异表达基因的百分比细分。(E)基于分子功能基因本体的健康和疾病组中差异表达基因的百分比细分。  

2.牙周病宿主口腔宏转录组谱以免疫相关功能和基因存在的主要差异为特征

根据生物过程和分子功能，采用Panther分类系统将差异表达的基因列表分类为基因本体。小鼠宿主基因被分为20个不同的生物过程，其中最丰富的是细胞过程、代谢过程、生物调节、定位和对刺激的反应(图2D)。在分子功能中，排名靠前的类别主要是结合、催化、分子功能的调控和转运(图2E)。使用Enrichr的基因富集分析进一步将这些基因本体类别分为亚组。基于此，在生物过程中，有114个基因本体群在牙周病条件下富集，150个基因本体群在健康状态下富集(附录表3)。根据综合得分对每个条件下的前25个基因本体进行排名，如图3A所示。相比之下，在分子功能中使用相同的过滤标准，最终列表仅包含34个在健康组富集的基因本体群和26个在疾病组中富集的基因本体群(附录图2)。

疾病组中富集的生物过程列表(图3A)中的最佳候选者是由疾病中过表达的5个基因(CD86、ITGB1、RNF31、TNIP2和PHB2)驱动的CD40信号通路。然后，我们研究了疾病中其他富集的免疫相关通路，以获得与免疫信号传导和调节相关的18个功能基因本体的列表，这些基因本体由小鼠宿主基因组中在疾病中差异表达的56个基因驱动(图3B；附录表4)。相比之下，仅与12个基因相关的22个富集免疫相关途径在健康组中的代表性过高(图3B; 附录表4)。

本研究还使用趋化因子、白细胞介素、B细胞、T细胞、中性粒细胞、TLRs和成纤维细胞等关键词从差异表达基因集中生成了一个免疫相关基因列表，以生成64个基因列表，其中44个(69%)在疾病中过多表达(附录图3)。

图3

使用Enrichr对小鼠口腔宿主宏转录组中差异表达的基因进行基因富集分析。(A)根据Enrichr计算的健康(蓝色)和疾病(红色)综合得分，排名前25位的生物过程基因本体。(B)根据Enrichr分析，热图描绘了与免疫相关生物过程相关的基因的相对基因表达水平，这些基因在健康(蓝色)和疾病(红色)组中富集。x轴上的样本C1至C12与健康相关，样本Pg1至Pg12与疾病相关。这些基因按倍数变化的降序排列，标有星号的基因是指仅在指定条件下存在而在其他条件下完全缺失的基因。  

3.SPF小鼠的口腔细菌宏转录组谱与先前在SPF小鼠口腔微生物组中观察到的简单种群结构一致

在该口腔宏转录组数据集的所有细菌转录本中，61% ± 17%使用小鼠口腔微生物组数据库中的参考基因组进行注释。根据总平均丰度水平，我们发现与Streptococcus danieliae的3个基因组匹配的转录本数量最多，其次是Sanguibacter inulinus、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)(图4A)。比较健康和疾病组之间的平均物种丰度，仅观察到2种葡萄球菌物种(木糖葡萄球菌AE2和Staphylococcus lentus HT5)的基因组存在统计学显著差异(图4A)。一些丰度最低的物种，如Gemella species 2、Rothia nasimurium、Pasteurella species 1、Neisseria species 1、Staphylococcus sciuri和Gemella palaticanis，是唯一在任何一种情况下都完全不存在或存在的成员(图4B)。物种水平的CCA分析图显示了健康和疾病样本的分离，疾病样本的聚类更为紧密，分散的对照样本中也有很强的异常值(样本C5)(图4C)。

图4

小鼠口腔细菌宏转录组的分类图谱。(A)基于整体口腔宏转录组中丰度水平的降低绘制的小鼠口腔细菌分类群。以绿色表示最具优势的分类单元Streptococcus danieliae，带星号的条形表示在健康和疾病组之间基因表达有显著差异的分类群。(B)小鼠个体口腔细菌分类群在健康(蓝色)和疾病(红色)条件下以相对丰度表示。(C)典型坐标分析(CCA)图显示了基于细菌物种水平分类概图谱的小鼠样本分布。  

4.牙周病SPF小鼠的口腔细菌宏转录组谱揭示了金属结合和代谢过程中的功能差异

在该数据集的口腔细菌转录本中，使用与宿主基因集相同的过滤标准过滤后有29个转录本在健康和疾病组之间差异表达(附录表5)。其中12个在对照样本中代表性过高，17个在疾病组中代表性过高(图5A)。

细菌转录本的CCA分析还揭示了健康和疾病样本的分离；67.2%的方差沿坐标轴1解释(附录图4A)，尽管差异无统计学意义。在排除极端异常值样本(Pg12)后重新绘制了该图，可更清楚地观察到健康组和疾病组之间的分离(图5B)。这23个样本被用于细菌数据集的进一步分析。基于健康组与疾病组之间细菌种群分子功能的基因本体网络分析，对差异表达基因进行了表征(图5C)。在健康组中，与唾液酸酶活性和寡糖/多糖代谢相关的网络显著过多，而疾病组中显著的分子功能是与金属离子结合(包括血红素结合、铁-硫结合)和丙酮酸脱氢酶相关活性相关的功能网络。

图5

小鼠口腔细菌宏转录组中的差异基因表达谱。(A)健康(蓝色)和疾病(红色)组中29个差异表达基因的细分(倍数变化>2)。(B)典型坐标分析(CCA)图显示了基于细菌基因表达的小鼠样本分布。(C)在健康(蓝色)和疾病(红色)组中与差异表达细菌基因相关的分子功能的Revigo细菌基因本体(GO)网络。气泡颜色的深浅(由浅色到深色)对应于基因表达中倍数变化的效应大小。高度相似的GO术语由虚线链接，其中线宽表示相似程度。  

讨论

本研究展示了一种非侵入性方案，以获得小鼠模型中包括宿主和常驻微生物群的口腔基因表达谱的全局快照。众所周知，口腔拭子在核酸产量方面存在挑战，在低生物量的鼠类样本中更是如此(未发表的数据)。我们优化了一种方案，该方案通过对同一只小鼠进行重复采样来最大限度地提高个体RNA产量，从而通过避免样本池将个体间差异纳入分析。这一优化以及多个实验批次的纳入有助于证明此方案的可重复性和稳健性(附录图5)。

除了健康组和疾病组的比较外，健康SPF小鼠口腔转录本的基因表达图谱可以作为未来使用鼠类模型的研究的参考数据库。最丰富的转录本主要为上皮来源，例如口腔角蛋白(附录表2)。考虑到采样的方法，这一结果符合预期，尽管差异分析也证明了替代宿主细胞来源的显著贡献。

本研究的一个可预测观察结果是牙周病对宿主免疫基因表达的显著影响：基因富集数据分析显示，30个富集的基因本体与78个健康和疾病组之间免疫功能的差异表达基因相关(图3B)。在疾病组中，富集的免疫基因本体中的最佳候选者是CD40信号通路，一种既往与人类牙周病以及其他相关的系统性疾病(例如类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)和动脉粥样硬化)相关的免疫通路。据报道，CD86是在该通路中上调的共刺激分子之一，在疾病样本中也被过量表达。此外，还有55个与免疫信号传导和调节相关的基因与18个在疾病组中富集的功能基因本体有关，包括涉及白细胞和巨噬细胞迁移的CD200和CD200R1基因集。CD200分子及其受体与响应病原刺激的免疫调节有关，并与牙周病和骨密度水平有关。趋化因子受体基因CCR2在疾病组中的比例也过高，已知其与相应配体CCL2一起参与各种口腔疾病(包括牙周炎)中的单核细胞募集和组织破坏。该列表中的其他相关基因已在附录中讨论。

除了免疫相关通路之外，该数据集中的主要生物过程与细胞/代谢过程和生物调控有关，包括与辅酶A生物合成、蛋白质易位和肌动蛋白丝调控等过程相关的某些基因组的富集。疾病组中宿主代谢和生化途径的富集以及与碳代谢途径相关的差异表达微生物基因证明了代谢在疾病机制中的潜在影响，这值得进一步研究。

最近，2项独立研究通过健康和牙周病中的单细胞转录组学生成了参考人类口腔基因数据集，揭示了疾病中多种细胞类型(包括上皮细胞和基质细胞)的免疫和炎症基因表达增强。尽管样本采集的特异性存在差异，但在目前的研究中，我们观察到与淋巴细胞募集和粘附、基质和上皮牙龈蛋白以及配体-受体相互作用相关的基因组存在重叠。

在混合微生物种群中，成功的宏基因组/宏转录组学研究依赖于使用目标参考数据库进行准确的分类学分析。我们使用最近发表的小鼠特异性口腔微生物组数据库作为分析这些数据集的参考。在微生物谱方面，我们通过培养和扩增子测序观察到与我们曾报道的同一小鼠群体的种群结构相对应的组成，其中相同的4至5个主要分类群占种群的98%。特别令人感兴趣的是细菌S. danieliae，这是一种在各种SPF实验室小鼠背景下报道的鼠特异性链球菌。在本研究中，该微生物也占优势，这表明最丰富的微生物也是小鼠口腔微生物组中功能最活跃的成员。

在29个差异表达的细菌基因中观察到了功能相关的模式，其中基因本体网络分析也观察到了疾病组中过度表达的涉及代谢酶和转运活动的基因数量(图5B)。京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析确定了一组在疾病中过度代表的基因，这些基因通过丙酮酸代谢和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径在功能上相互联系。丙酮酸代谢也是人类口腔微生物宏转录组学分析中差异表达的通路之一，其中一个涉及的基因与本研究数据集中鉴定的基因相同(k01653—ilvH、ilvN；乙酰乳酸合酶I/III小亚基；附录表5)。

细菌代谢基因的过表达可能是短链脂肪酸(SCFAs)等细菌产物在体内平衡和驱动牙周病中致病作用的指标。与该假设一致，Aimetti等人报告的一项比较健康和牙周炎的唾液代谢组学分析将细菌代谢物(包括不同水平的丙酮酸、缬氨酸、琥珀酸盐和其他SCFAs)描述为潜在的疾病生物标志物。

在健康基因本体网络分析的分子功能中，唾液酸酶活性和寡糖/多糖代谢的过表达可能反映了唾液糖蛋白的分解/利用可作为健康口腔细菌营养的主要来源。在疾病组中则观察到与金属结合功能相关的大型网络，这一特征可在革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体中观察到，是疾病感染过程的一部分。值得注意的是，牙周病原体P. gingivalis具有特征明确的通过血细胞凝集素和牙龈蛋白酶的血红素获取机制，这是该微生物致病性的关键毒力因子。在基因本体网络分析(附录图6)中观察到的生物过程中，健康组中主要候选者是与修复和维护相关的管家基因活性，而疾病组中最大的网络与代谢和酶促过程有关。这可能反映了牙周病触发的微生物代谢率增加和快速生长，可能反映了GCF的出现作为疾病中微生物营养的主要来源，而不是健康个体中基于唾液的营养。

尽管人类和小鼠的个体口腔微生物组存在差异，但本研究中细菌宏转录组的差异表达与人类牙周病研究中所描述的差异有许多相似之处。我们观察到其他共生微生物种群的疾病代谢特性发生了显著变化。同样，人类口腔宏转录组学研究表明，链球菌和Veillonella等共生生物在表达牙周疾病中假定的毒力因子时，转录活性增加。此外，一项人类健康与牙周炎中龈下微生物组的宏转录组学研究发现牙周病中的铁获取功能上调，这与本研究结果相似。

总之，我们提供了牙周病对小鼠口腔宿主转录组和微生物组影响的全局快照。虽然本研究使用的是动物模型，但我们的研究补充了对人类样本进行的细胞图谱工作。在对比健康组和疾病组时，我们观察到宿主基因表达谱的显著变化，以及疾病发展对免疫和炎症基因功能谱和其他生物过程的强烈影响，重要的是，我们能够在口腔拭子宏转录组分析中揭示这些变化，开辟了潜在的快速诊断策略。除了该数据集中的差异表达基因(先前已发现其产物在人类牙周病研究中具有重要意义)之外，这项研究还揭示了一些尚未在人类中检测的候选基因，特别是那些参与细胞代谢和生物调节的基因。我们认为这可能为研究与人类疾病相关的新途径/网络提供机会。

本研究的一个局限性是批量RNA测序无法识别特定宿主细胞/组织水平的局部变化，特别是在口腔拭子中。尽管如此，本研究通过：1)优化低产量RNA提取和测序方案；2)首次使用靶向鼠类微生物组参考数据库；以及3)首次生成鼠类口腔宿主基因表达资源，为未来的鼠类牙周炎模型研究提供了基础。因此，这一数据集和方法应该为进一步的体外和体内研究提供潜能，以调查牙周病的发病机制以及健康和疾病中的宿主免疫机制。