TCR mimic抗体—肿瘤免疫治疗

基于抗体的免疫疗法在各种癌症类型中显示出临床效果。然而，靶标仅限于表面或可溶性抗原，它们在癌症蛋白质组中所占比例相对较小。人类蛋白质组的大部分蛋白质都在细胞内。来自细胞内靶点的短肽可由细胞表面的MHC-I分子递送，使其成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。可以开发抗体来靶向这些肽/MHC复合体，类似于TCR对此类复合体的识别。这些抗体被称为TCR mimic (TCRm)或TCR样抗体。正在进行的临床前和临床研究将帮助了解它们的作用机制和免疫治疗的靶位选择。这里就细胞内抗原的选择、多肽/MHC复合体的制备、TCRm抗体的分离及治疗应用、TCRm抗体的局限性以及以TCRm抗体为基础的临床应用的可能途径进行介绍。

肿瘤中pMHC靶点的选择

在为TCRm抗体开发选择pMHC靶点时，可能会考虑以下因素：表位的丰度、癌细胞与正常细胞的特异性、MHC分子的呈递以及肿瘤细胞表达的异质性。TCRm抗体的理想靶点是肿瘤特异性pMHC复合体，它以高密度存在于靶细胞表面，而在正常细胞上不存在。靶抗原可能在肿瘤生长过程中起作用，甚至是至关重要的作用，以帮助避免在随后的治疗选择压力下丢失抗原。这种多肽也可能与患者的MHC有很高的亲和力，并形成稳定的复合体，持续存在于细胞表面，允许TCRm抗体识别。TCRm抗体开发的一个主要挑战是肿瘤细胞倾向于下调MHC-I的表达。因此，pMHC复合体的丰度通常较低。然而，最近的一项研究【Bispecific antibodies targeting mutant RAS neoantigens】表明，TCRm抗体具有强大的抗肿瘤活性，具有KRAS G12V MHC复合体，尽管该复合体在细胞表面的数量很少(平均每个细胞3-10个拷贝)。

HLA是pMHC复合体的重要组成部分，因此选择一种HLA用于癌症治疗非常重要。在不同的人群中有20000多个HLA-I类等位基因。同一致癌多肽可能由不同个体的不同等位基因所呈现。为拓宽其临床应用，应优先开发与主要HLA亚型结合的多肽TCRm抗体。根据巴西一项研究，在高加索人中发现的最常见的HLA-I类等位基因是HLA-A*02、24、01和HLA-B*35、44、51；亚洲人是HLA-A*24、02、26和HLA-B*40、51、52；非裔巴西人是HLA-A*02、03、30和HLA-B*35、15、44。显然，在所有的等位基因中，以HLA-A*02最为常见，占27%，是开发TCRm抗体的合适候选基因。

根据其短肽成分的来源，pMHC复合体可大致分为以下两大类：肿瘤相关抗原(TAA)(包括过表达的蛋白质)和肿瘤特异性抗原(TSA；表1)。TSA包括特异性融合蛋白、致癌病毒抗原和突变的自身抗原。表1中列出的抗原已经被证实可以在细胞表面表达pMHC复合体，使它们成为TCR细胞治疗或TCRm抗体开发的有效靶点。细胞上pMHC复合体的发现和验证通常使用复杂的蛋白质组学方法，涉及质谱学。因此，目前没有太多的抗原可用。此外，绝大多数pMHC抗原尚不清楚，这对TCRm抗体的发展是一个巨大的限制。

表1 目前TCRm抗体的靶标

TAA

TAAs由肿瘤细胞优先表达，并与一种恶性细胞表型相关，这是靶向肿瘤免疫治疗的基础。异常过表达的抗原是TAA中最大的一类。研究表明，通过疫苗、过继细胞疗法和抗体，包括WT1、甲胎蛋白(AFP)和GPC3等癌胎儿抗原，以及肿瘤-睾丸抗原，如在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)和NY-ESO-1，以及黑色素瘤抗原基因(MAGE)家族的基因，靶向这些TAA方面取得了一些成功。癌胎儿抗原WT1和AFP在胚胎发育过程中表达，在特定的肿瘤中发现，但在健康的成人组织中表达很有限。癌症-睾丸抗原，包括来自MAGE基因家族和NY-ESO-1的抗原，在几种肿瘤类型中高度表达，但它们在健康成人组织中的表达仅限于睾丸。这些TAA已经被很好地记录和验证为细胞毒性CTL、TCR-T治疗或TCRm抗体的靶标。

TSA

TSA是癌症免疫治疗的靶点，因为TSA是由肿瘤细胞特异性表达的，使免疫途径的治疗效果仅限于肿瘤，并减轻了off-target毒性。一些融合蛋白在肿瘤细胞中表达，如断点簇区-原癌基因酪氨酸蛋白激酶(BCR-ABL)和早幼粒细胞白血病-视黄酸受体α融合(PML-RARα)。BCR-ABL融合是9号和22号染色体t(9;22)(q34;q11)易位的结果。这种易位在CML的发病机制中是至关重要的，95%的CML患者可以检测到这种易位，而正常细胞中没有这种易位。PML-RARα融合是由(15;17)易位引起的，是急性早幼粒细胞白血病的显著特征。这种易位产生的融合蛋白作为一种异常的视黄酸受体发挥功能，具有异常的转录调节特性。一些使用BCR-ABL多肽疫苗的研究在临床试验中显示效果有限。然而，针对这些抗原的免疫治疗方法仍需进一步研究。

另一组TSA是致癌病毒抗原。大约12%的人类癌症是由肿瘤病毒引起的。有7种肿瘤病毒包括：EBV、HPV、HBV、HCV、HTLV-1、HHV-8和MCPyV。人类的病毒致癌是复杂的，只有一小部分感染者会患上癌症，通常是在最初感染几年或几十年后。这些病毒的癌基因由癌细胞结构性表达，使它们成为癌症免疫治疗的有吸引力的靶点。开发针对EBV相关癌症的TCRm抗体已被证明是可行的。EBV与许多人类癌症有关，如Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌。EBV多肽包括EBNA1 562-570、LMP1 125-133和LMP2A 426-434，由HLA-A*0201呈递到细胞表面，是TCRm抗体的潜在靶点。结果表明，针对EBV多肽的TCRm抗体可抑制EBV转化的B淋巴母细胞在小鼠体内的移植生长，并提高小鼠的存活率。使用TCR细胞疗法靶向HPV E6或E7多肽复合体的研究表明，通过靶向这些癌蛋白，可以抑制HPV相关的上皮性癌症。

突变的自身抗原，或新抗原，是癌症免疫治疗的极佳靶点，因为它们是针对恶性肿瘤细胞的。然而，大多数肿瘤突变并不在患者之间共享，而且在大多数情况下，一小部分患者共享相同的新抗原。由于临床应用的局限性，开发针对这些不同新抗原的TCRm抗体是困难和具有挑战性的。幸运的是，研究发现了复发突变(＞1%的患者)，这可能是复发的新抗原，如p53、KRAS和Myc。肿瘤抑制基因p53在多种癌症中表达失调，是免疫治疗的重要靶点。p3在结直肠癌中有两个常见的突变：R175H和R282W，每个突变的频率为9.5%。【Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation】开发了一种针对p53 R175H突变的TCRm抗体。从这种TCRm抗体衍生的双特异性抗体有效地激活T细胞来裂解带有这种突变的癌细胞。另一项研究【T-cell responses to TP53 "Hotspot" mutations and unique neoantigens expressed by human ovarian cancers.】已经分离出针对p53肽复合体的TCRm抗体T1-116C，并在体外和体内证明了其有效性。KRAS基因突变在各种癌症中都很丰富，例如：胰腺癌(70%-90%)、结肠癌(35%-50%)、小肠癌(35%)、胆道癌(20%-30%)和肺癌(20%-35%)。此外，特定的KRAS突变在一种类型的肿瘤中占主导地位。在32.4%的胰腺癌患者中，KRAS G12D是最常见的突变，G12V是第二常见的突变，其比例为22%。获得了针对KRAS G12V突变多肽与HLA-A3结合的TCRm抗体。从该TCRm抗体衍生的双特异性抗体有效地杀死肿瘤细胞。

pMHC复合物的制备

pMHC复合体不是单一的蛋白质，而是由MHC分子组成，包括HLA-I类重链、β2-微球蛋白(β2M)和来自肿瘤抗原的多肽。该多肽被加载到该HLA分子的结合槽中，并且MHC分子的侧链和该多肽的主干之间的保守氢键产生结合力。天然构象的pMHC复合体是分离成功的TCRm抗体的关键。利用目前的杂交瘤或噬菌体展示技术将pMHC复合体作为抗原用于抗体筛选是具有挑战性的，结果是TCRm抗体不像传统抗体那样普遍可用。最初，在其MHC分子的沟槽中含有免疫原肽的抗原提呈细胞被用作免疫原，但在产生TCRm抗体方面取得的成功有限。

重组pMHC复合体的出现促进了TCRm抗体的发展。为了使用不同的策略分离抗体，需要相对较高数量的纯化的MHC-肽复合体。首先，包括重链和β2M在内的MHC分子在细菌中分别表达，并从包涵体中纯化。然后用MHC限制性多肽进行重折叠，以产生正确的重折叠单体(图1B)。进行了结构和功能实验，以验证单体的复性。总体而言，这些单体的产量很低，与其他细菌或哺乳动物表达的抗原制剂相比，生产起来很繁琐。为了提高生产效率，探索了由MHC重链和β2M组成的融合蛋白的表达。该融合蛋白具有灵活的连接体，并且可以负载目的多肽。此外，另一种融合蛋白被设计为单链三聚体(SCT)，它通过两个接头整合MHC复合体的所有三个亚单位。这些嵌合复合体可以被不同的TCR识别，类似于天然的pMHC复合体。结构研究表明，SCT与pMHC单体在结构上存在一定差异，尤其是在α-1-α-2结构域。然而，抗原结合平台上的差异可能很小。这些融合蛋白的主要用途是产生四聚体或其他多价染色试剂，用于可视化T细胞。pMHC单体的天然构象在四聚体应用中可能不重要。然而，天然的pMHC单体可能是TCRm抗体筛查最常见的候选者。pMHC抗原生产的开发和优化将是TCRm抗体发现的重要研究和技术改进领域。

图1TCRm抗体研制及pMHC复合体制备流程图。要开发TCRm抗体，重要的是要制备与肿瘤相关的pMHC复合体。pMHC复合体产生后，可作为抗原用于免疫和杂交瘤方法的抗体发现，或噬菌体展示技术，甚至人类单个B细胞克隆策略。这些TCRm抗体可以进一步发展成不同的形式，如双特异性抗体、ADC、免疫毒素或用于癌症治疗的CAR-T细胞疗法。pMHC的抗原产生对TCRm抗体的研制具有重要意义。MHC-I类分子和β-2M是从细菌中表达和纯化的。然后将它们与肿瘤相关或特异性多肽组装成pMHC复合体单体，用作TCRm抗体筛选的抗原。

TCRm抗体的分离和生产

传统上，TCRm抗体很难产生。然而，由于包括如上所述的抗原生产的最新进展，针对越来越多的肿瘤和病毒抗原的TCRm抗体的开发有所增加，包括：WT1、AFP、PRAME、NY-ESO-1、MAGE-A1、hTERT、TARP、酪氨酸酶、hCGbeta、p53、p68MIF、蛋白酶3、MAGE3和EBV蛋白(表2)。免疫和杂交瘤策略以及通过噬菌体展示进行体外筛选是分离TCRm抗体的两种主要方法(图1a)。或者，单个B细胞分选和克隆策略可以是TCRm抗体分离的另一种选择。

表2 TCRm抗体在肿瘤免疫治疗中的应用

首次采用杂交瘤技术免疫产生TCRm抗体。早期，使用的抗原是呈递pMHC复合体的APC细胞。使用这种方法产生的TCRm抗体很少，许多努力被证明是不成功的。几个小组开始在免疫方法中使用重组pMHC复合体(表2)。对于每次筛查，可能有数千个克隆，并进行高通量筛查以识别特定的TCRm抗体。杂交瘤技术的主要优势是分离出与pMHC复合体具有高亲和力结合的抗体的可能性很高。如果动物在为细胞克隆牺牲之前多次用该抗原免疫，则有一个抗体在体内亲和力成熟的过程。然而，这种方法只有在稳定的MHC复合体与高亲和力的多肽结合时才能更好地发挥作用，这是诱导有效免疫和体内IgG成熟所必需的。此外，如果抗体需要推进到临床，人源化将是额外的一步。

最近，抗体噬菌体展示在TCRm抗体的分离上取得了突破和成功。特异性对于TCRm抗体的成功非常重要；因此，噬菌体展示可以结合阴性和阳性选择来分离靶pMHC复合体的特异性抗体，而杂交瘤通常不能做到这一点。噬菌体展示的另一个重要部分是抗体库的大小，它通常具有很大的多样性。文库中的抗体形式通常是抗原结合片段(Fab)或单链可变区(scFv)片段，展示在每个噬菌体颗粒上。通过几轮噬菌体淘洗，携带特定抗体的噬菌体颗粒被挑选出来，并针对目标进行浓缩。噬菌体展示方法的首批报道之一是由小鼠MHC-I提呈的针对流感病毒血凝素多肽HA 255-262(FESTGNLI)的抗体的分离。随着技术的进步，几种与癌症相关的pMHC复合体已经成为利用噬菌体展示技术开发TCRm抗体的目标。这种方法的主要优点是能够在相对较短的程序内实现对目标的广泛选择。另一个优点是产生完全人源化的抗体，这不需要杂交瘤策略中通常需要的抗体人源化步骤。然而，与杂交瘤策略相比，来自噬菌体文库的TCRm抗体通常具有较低的结合亲和力。为提高其亲和力和抗肿瘤活性，可能需要进行体外亲和成熟。

从TCRm抗体与MHC复合物揭示其结构特征

关于TCRm抗体与pMHC复合体结合的结构信息对于开发针对遗传多样性患者群体的治疗方法具有重要价值。TCRs与这些化合物的中等亲和力，范围为1~100μmol/L，而TCRm抗体则亲和力高得多。例如，抗WT-1的TCRm抗体ESK1具有亚纳摩尔亲和力，是天然TCR的1000倍。【Structure of a TCR-mimic antibody with target predicts pharmacogenetics】比较与TCR和其他TCRm Fabs与pMHC复合体的结合，ESK1具有不同的模式。ESK1的可变区结合TCRs通常不能到达的HLA区域。此外，ESK1结合了部分多肽，仅占整个pMHC接触表面的15%。不同的TCRm抗体与多肽的结合率不同。一项研究检测了TCRm抗体H2与p53 R175H多肽与HLA-A*0201的结合结构，发现H2-Fab同时与p53 R175H多肽和HLA-A*02结合，分别约占接触面的50%。此外，晶体结构研究表明，ESK1与HLA受体结合较多，约占HLA上总复合体接触区的85%。有趣的是，这个区域在HLA-A*02亚型中是保守的。预测ESK1可与其他亚型的HLA-A*02家族结合，并经亲和分析证实。这潜在地扩大了具有不同HLA-A*02亚型的目标患者群体。除了可溶性的基于TCR的构建体和TCR工程细胞外，基于TCR的药物的一个主要限制是它们对特定的HLA亚型的限制。ESK1的结构发现提示TCRm抗体有可能克服HLA亚型限制的局限性。TCRm疗法可能比基于TCR的药物具有更广泛的治疗应用。

TCRm抗体在治疗中的应用

TCRm抗体的制备为以抗体为基础的免疫治疗方法治疗癌症提供了新的机会(表2)。一种由HLA-A2呈递的针对人绒毛膜促性腺激素(hCG)-β的特异性小鼠抗体，并证明这种抗体可以减缓小鼠异种移植模型中乳腺肿瘤的生长。另一种TCRm抗体是针对HLA-A*0201提呈的PR1多肽而产生的，并抑制了AML祖细胞的生长。人TCRm抗体可以从人抗原未成熟的PBMC噬菌体文库中产生。针对WT1癌蛋白的pMHC复合体的人TCRm抗体的研制是癌症免疫治疗的一个典型例子。WT1是一种细胞内转录因子，在多种肿瘤中过表达。9肽WT1 126-134(RMFPNAPYL)是由肿瘤细胞表面的HLA-A*0201处理并提呈的。TCRm抗体ESK1与肿瘤细胞特异性结合，仅限于WT1和HLA-A2，而不与正常对照细胞结合。它在小鼠异种移植模型中显示出强大的抗肿瘤作用。

对于基于抗体的方法，TCRm抗体的作用机制类似于传统的针对特定肿瘤抗原的单抗，通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)或补体依赖的细胞毒性(CDC)。为了提高TCRm抗体的效力，可以使用不同的方法，包括增强ADCC、ADCP、工程双特异性单抗、免疫毒素、抗体药物结合物(ADC)以及与其他治疗方式相结合。与Fcγ受体(FcγR)结合增强的修饰版本ESK1通过增加激活Fcγ受体的亲和力和降低抑制FcγRIIb受体的亲和力而增强ADCC。通过增加巨噬细胞上FcγR的结合，也可以实现ADCP在ESKM中的作用。此外，ESKM与多种酪氨酸激酶抑制剂的联合治疗可提高慢性粒细胞白血病的疗效。

TCRm抗体也可用于CAR T细胞治疗，这是一种新兴的癌症免疫治疗方法。CAR结构由针对靶抗原的胞外抗体部分、铰链区、跨膜区和胞浆信号区组成，包括CD3 Zeta链和几个共刺激结构域。TCRm可以以CAR T细胞的形式进行工程，通过细胞免疫治疗直接靶向细胞内蛋白。已有几个源自TCRm抗体的CAR被报道。【Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracellular oncoprotein WT1 can be enhanced by vaccination】报告了基于TCRm抗体(包括针对WT1 pMHC复合体的ESK1)的CAR T细胞在体外和体内显示出有效性。针对gp100 pMHC复合体的TCRm抗体产生了抗黑色素瘤的CAR T细胞。来自这种TCRm的CAR T细胞在异种移植模型中显示出对肿瘤细胞的特异性细胞毒性和抑制黑色素瘤的进展。一种针对AFP 158-166肽的人TCRm抗体，并将其与HLA-A*0201复合，将其开发用于CAR T细胞治疗肝癌。AFP CAR T细胞在肝癌细胞株和异种移植瘤模型中显示出很强的抗肿瘤效果。目前，AFP CAR T细胞疗法正在进行临床试验(NCT03998033)，临床疗效正在评估中。

总结

TCRm抗体大多处于临床前状态进行评估。TCRm抗体的发展仍面临着几个重要问题。第一个主要的挑战和限速步骤是生产pMHC复合物。生产足够多的高质量的pMHC单体既耗时又昂贵。

第二个主要担忧是TCRm抗体的非靶点效应损害了TCRm抗体的治疗应用。大多数pMHC复合体来自可能不只在肿瘤细胞中表达的蛋白质，在正常组织中可能仍有低水平的表达。此外，TCRm与其他非特异性多肽的交叉反应也是一个令人担忧的问题，因为加载到MHC复合物中的多肽很短。重要的是，TCRm抗体不能单独识别MHC-I，因为它在大多数细胞上表达，并且必须是pMHC复合体的特异性抗体。【Construction and next-generation sequencing analysis of a large phage-displayed VNAR single-domain antibody library from six naive nurse sharks】一种可能的方法是从单域抗体库（camelid VH-Hs）中开发TCRm。其基本原理是，与传统抗体相比，小的重链单域抗体可能进一步进入蛋白空腔，如MHC结合槽，并识别抗原的构象表位。单域抗体的另一个优点是它可以很好地适用于诸如双对位或甚至多对位结合的应用。尽管Camelid单域抗体在序列上与人类接近，但免疫原性仍很大程度上尚不清楚。Camelid单域抗体的人源化可能会降低其免疫原性。

第三个挑战是MHC-I复合体在细胞表面的低表位密度和抗原提呈的下调，这是治疗耐药的机制。有可能的方法来应对这一挑战，包括增加pMHC-I在肿瘤中的表达，使TCRm抗体对低密度表位更敏感，与其他药物联合治疗，以及设计双特异性TCRm抗体。有多种方法可以上调肿瘤细胞上MHC-I的表达，如细胞因子(IFNγ和TNFα)或增加Fhit基因的表达。或者，一些失去MHC-I表达的肿瘤可能保留MHC-II的表达，使肿瘤相关的MHC-II类复合体成为潜在的靶点。

另一个限制是TCRm抗体的MHC限制性。尽管与TCRs相比，TCRm抗体受特定的HLA亚型的限制较小，但要同时分离与该多肽和HLA分子保守区特异结合的TCRm抗体通常是一项具有挑战性的工作。如果有这样的TCRm抗体，它可能能够覆盖更多的各种HLA类型的患者。TCRm抗体与MHC分子的结合结构仍然有限。对pMHC复杂结构的更多了解将有助于开发针对肿瘤相关多肽靶标但不限于HLA型的“通用”TCRm抗体。

TCRm抗体可以将抗原库扩大到细胞内蛋白，并有可能使许多“无法下药”的靶点可用于免疫治疗。虽然需要做出许多努力来分离特异性和成功的TCRm抗体，但它们在靶向细胞内蛋白方面具有很好的治疗潜力。更多针对现有和新的抗原的TCRm抗体的分离、pMHC抗原生产的改进、TCRm抗体的发现(包括单域抗体的使用)、抗体传递、结构研究以及TCRm的亲和成熟和去免疫将推动针对细胞内靶点的治疗，并有望在未来将有效的抗体引入临床管道。

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