GPCR药物的局限、开发难点及未来方向

01、GPCR家族介绍

GPCR（G Protein-Coupled Receptor），即G蛋白偶联受体，是一大类膜蛋白受体的统称。GPCR是人类基因组编码的最大蛋白家族，广泛分布于中枢神经系统、免疫系统、心血管及视网膜等器官和组织，参与机体发育以及多种生理功能的调控。

GPCR的主体由7段跨细胞质膜的α螺旋结构构成，将信号由胞外转导到胞内（图1）。基于进化同源性和氨基酸序列，GPCR超家族被细分为5类，目前大都数GPCR药物靶向A类GPCR（图2）。GPCR是重要的药物开发靶点，涉及许多热门治疗领域。市场上通过FDA审批的药物中有近40%靶向GPCR，销售总额占全球市场的27%。

图1. GPCR信号传导示意图 【1】

图2.上市和临床阶段GPCR药物靶点类型对比（左：上市GPCR药物；右：临床阶段GPCR药物）来源：网页链接

02、上市和临床阶段GPCR药物对比——药物形态、靶点及适应症

从药物形态的角度来看，多肽/蛋白等药物形态占比正逐渐升高。对比上市和临床阶段GPCR药物形态(图4)可以发现，多肽类药物已成为GPCR开发的新趋势：在处于临床阶段的GPCR药物中，多肽类药物占比11%，而在上市阶段中，占比仅为5%。此外，有许多GPCR的内源性配体是多肽（由50个或更少的氨基酸组成）——例如在非嗅觉GPCR中，约有33%（130种）为肽或蛋白质受体。【2】这些均表明了多肽作为GPCR药物新形态的潜力。【3】

图4.上市和临床阶段GPCR药物形态对比（左：上市GPCR药物；右：临床阶段GPCR药物）来源：网页链接

从药物的作用形式上看，处于临床阶段的药物与已上市的相比也具有差异（图5）。我们可以看到，GPCR药物开发由正构位点转向别构位点。上市阶段的GPCR药物大部分为拮抗剂（antagonist）和激动剂（agonist），比例高达95%。两者的作用形式均为靶向GPCR结构中的正构位点（orthosteric sites）——正构位点通常是敞开的且位于细胞膜外区域，有利于配体结合。然而，不同的受体在正构位点包含高度保守的残基，这会导致相同的正构药物分子可以激活同类型受体，进而降低GPCR药物的特异性并引起额外的毒副作用。在临床阶段的GPCR药物中，作用于非传统正构位点的药物作用形式的比例有所提高，包括正变构调节剂（positive allosteric modulators, PAM）、负变构调节器（negative allosteric modulator, NAM）。关于GPCRs结构的最新研究进展显示，除传统的正构位点外，配体还可以结合到偏远的变构位点，进而调控GPCR相关的生物学效应，进而达到治疗目的。

图5.上市和临床阶段GPCR药物作用形式对比（左：上市GPCR药物；右：临床阶段GPCR药物）来源：网页链接

从药物靶点的选择方面来看，GPCR药物更加关注特异性。处于临床阶段（尤其是临床Ⅰ期）的GPCR药物靶向单个靶点的占比远高于处于上市阶段的占比（图6）——在临床Ⅰ期阶段，其占比高达80%；在上市阶段仅占比50%。这表明随着GPCR药物开发的进展，人们更多地关注靶点选择性，而不是多药理学性质。【4】

图6.上市、临床及终止试验的GRCR药物的靶标选择性或多药理学性质对比。【4】

从适应症角度看，GPCR药物的适应症正逐渐扩展到阿尔兹海默症、肥胖、多发性硬化症和低钙血症等领域。（图7）。

图7. GPCR药物适应症的变化趋势。

横坐标表示对应适应症中，已获批GPCR药物数量；纵坐标表示对应适应症中，处于临床阶段的GPCR药物数量。

阿尔茨海默病和肥胖症是临床试验药物与批准药物比例最高的适应症，其次是哮喘、糖尿病、帕金森病和肿瘤。【4】

此外，肿瘤已逐渐成为GPCR药物的重要适应症。GPCR可通过激活诸如MAPKs、AKT/mTOR和Hippo等下游多条信号通路，进而影响细胞的异常增殖；同时还可通过改变细胞骨架和激活Rho GTPases以促进肿瘤侵袭和转移。GPCR家族的多个成员都被证实与各种癌症的发生和进展相关，目前以GPCR为靶点的药物已表现出良好的治疗效果。当前已经获批的以GPCR为靶点的抗肿瘤药物如表1所示。

表1：以GPCR为靶点的抗肿瘤药物

数据来源：Citeline Pharma Intelligence

03、现有GPCR药物的局限及开发难点

GPCR是治疗药物中最大的靶标，但大多是GPCR药物都受到特异性低、毒副作用大的困扰，限制了它们的效用。目前，药物选择性有限、缺乏对受体信号通路的精确调控以及耐受性和脱敏是制约GPCR药物开发的几大主要原因。

此外，值得一提的是，由于对GPCR结构的认识有限，当前还难以进行基于结构的药物设计——GPCR靶点结构不稳定、低表达等原因导致了GPCR获取难度较大，大多数GPCR的结构目前仍未被解析，进而难以进行基于结构的药物设计来对GPCR功能进行准确的调控。

与此同时，GPCR药物开发还面临着诸多其它挑战：GPCR结构和功能的关系不明确、GPCR相关疾病的病理机制不明确、GPCR测活技术难点、药物开发的多目标优化过程以及GPCR抗体药物开发等。

04、未来方向

一、基于结构的药物设计（SBDD）

基于SBDD的大规模药物筛选是GPCR药物开发的有效途径。常规的SBDD往往只探索了所有化学空间的一小部分，化合物的可用性和多样性不足限制了筛选配体的数量。利用大规模、高质量的化合物库进行GPCR药物的筛选是解决上述问题的关键。Lyu等人在虚拟药物筛选中提出了一个“越大越好”的优秀模型。【5】基于130个表征良好的反应，他们生成了1.7亿个按需合成的化合物，最终的文库非常多样化，有1070万个以前无法获得的骨架。通过将1.38亿分子与DRD4对接，他们发现了81种新的化学型(24%的命中率)，其中30种具有亚微摩尔活性，包括180-pM亚型选择性和Gi偏向DRD4激动剂。其他大规模虚拟库针对GPCR的筛选结果也证明了超大型和定制文库在发现有效的GPCR调节剂方面的重要性和优势。

SBDD筛选指标的优化也是GPCR药物开发的重要因素。除了高质量大规模的筛选库，打分函数也是影响SBDD效果的重要因素和挑战。正确选择和排序配体结合袋中化合物的对接姿势一直是SBDD的挑战，特别是对于嵌入细胞膜的具有显著构象适应性的GPCR。为了解决这个问题，许多基于物理的评分功能与一些用户友好的计算机程序(例如，Dock, GOLD, AutoDock, Glide和rDock)被集成在SBDD中被使用。近年来，分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积(MM/PB(GB)SA)、自由能摄动(FEP)、量子力学/MM计算、碎片分子轨道等自由能计算方法得到了较好的应用。与经验评分函数相比，MM/PB(GB)SA和FEP是物理上更严格的自由能计算方法，但计算成本增加，已被用于DNA -配体、蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用的研究。通过引入基于最小化的MM/GBSA精炼和对接姿态的重新评分，Zhou等人鉴定出7种具有新型化学支架的5-HT2B拮抗剂，其中最有效的一种在细胞检测中IC50为27.3 nM。[6] Lenselink等人使用FEP设计A2AR拮抗剂，并鉴定出Ki为1.2 nM的高效分子。[7]然而，对20种A类晶体结构和934种已知配体的计算研究表明，MM/PBSA预测的结合自由能与实验数据之间的相关性存在显著差异。观察到的差异存在于个体受体之间，并且具有高度的系统特异性，这表明MM/PBSA的成功应用可能需要在验证实验数据和优化模拟/计算参数方面做出额外的努力。另外，从现有晶体结构中提取的蛋白质-配体相互作用指纹为蛋白质-配体结合模式信息的对接评分提供了动力，并提高了β2AR(53%)和HRH1(73%)的VS虚拟命中率，具有高达nM的亲和力和效价。

总的来说，虚拟筛选和对接结果评估的创新，以及计算硬件的发展，极大地推进了SBDD，并有望将GPCR药物发现和设计的效率提升到一个新的高度。GPCR可以形成不同的构象，具有多个下游信号通路，负责不同的功能或后果，不同亚型之间高度的序列和口袋相似性要求新的配体具有优异的特异性和选择性。在这方面，针对GPCR进行SBDD可能可以使药物能够选择性作用域同一受体的不同位点或构象，从而得到变构或偏倚调节剂，提供额外的药理学益处。

二、基于受体动力学的药物筛选（偏向性配体）

GPCR偏向性配体具有高特异性低毒副作用等潜力。我们对受体激活的了解随着偏向性激动的概念而增加，合适的偏向性配体可以优先激活所需的细胞内信号通路，同时最大限度地减少由于激活其他途径而产生的不良副作用，是未来开发高效率低副作用GPCR药物的方向。通过四个主要G蛋白家族之一及其细胞内效应物（如腺苷酸环化酶和磷脂酶C）或通过β-抑制蛋白依赖的激酶和其他激活来激活适当的细胞反应，对于产生有利的生理反应至关重要。优先触发这些途径之一的分子被称为偏倚激动剂，它提供了一种减少副作用的新机制。GPCR的构象多样性是偏向性传导的前提，偏倚激动剂的发现暗示了GPCR受体存在不同的构象状态，这些构象状态由不同的配体稳定，并可能导致特定信号传导和调节蛋白的激活（图9）。

图9. GPCR不同的构象状态 [8]

偏倚激动剂的机制如图10所示，GPCRs被认为在与配体结合时可以采用多种构象，从而激活多种信号通路（图10.A）。无偏倚变构调节剂可以同等地增强（图10.B）或抑制（图10.C）所有被激动剂激活的信号通路。然而，一些PAMs和NAMs可能会对GPCR信号传导产生偏倚，并选择性地调节GPCR与特定信号通路的关联，而对其他信号通路几乎没有影响（图10.D和图10.E）。偏倚调节剂在激活GPCRs下游的两种或多种多重反应方面的相对功效各不相同，可以有限刺激特定途径，调节特定的受体介导的信号通路，并通过允许受体激活向最大有益的方向引导，具有巨大的治疗潜力。最早发现的偏倚信号传导的例子之一是血管紧张素II (AngII) 1型受体（AT1R）。内源性激动剂AngII的某些β-抑制蛋白偏向类似物被发现不会明显激活Gq信号（例如IP3和Ca2+的增加），但仍会诱导受体磷酸化、内化和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导。其他Gq偏置类似物显示出功能的增强而不是功能的丧失，比AngII更有效地刺激Gq，但与AngII相比却可以激活β-抑制素途径。这些和其他GPCR的类似观察结果表明，G蛋白介导的和GRK/β-阻滞蛋白介导的反应可以在一定程度上被差异调节。【9】

图10.变构调节剂对GPCR信号偏倚的影响 【10】

GPCR构象与细胞信号/生物学效应的关系理解是关键。为了充分利用偏倚信号传导的潜力并微调细胞内对治疗的反应，需要对GPCR的信号传导库有更多的了解，同时也需要阐明受体所采用的大量不同构象和高阶复合物如何以不同的方式调节各种信号通路。【10】在动物模型中验证偏倚信号的新方法将有助于开发将偏倚配体转变为临床前候选药物和其他药物开发所需的工具。【4】偏向性配体可能会产生难以预测的生物效应。偏向性配体以一种不太自然的方式激活受体，如果对GPCR与偏向性配体作用后的构象及产生的效应理解不当，可能产生意想不到的target on效应。【11】要全面了解不同配体如何产生不同的信号模式，需要来自多种生物物理技术的数据，这些技术提供了高分辨率的结构细节和GPCR构象的动态信息。

计算方法成为研究GPCR构象和效应的趋势。此外，鉴于GPCR动力学以及不同的构象状态在配体识别、受体激活、偏向性转到中起着关键作用，许多计算方法（包括rotamer sampling, induced-fit docking, and ensemble docking）已经被采用，显示出很大的前景，特别是在寻找偏向性调节剂方面。在ensemble docking的过程中，配体被对接到可能代表不同构象状态的多个结构，而不是单一结构，其中目标可以是多个晶体结构，也可以从MD/Monte Carlo (MC)模拟或normal mode analysis (NMA)中提取的多个GPCR构象。Miao等人将加速MD模拟和Glide induced-fit的M2R配合对接相结合，提供了大大改进的富集因子，并鉴定出四种PAM和一种具有前所未有化学多样性的NAM。【12】对于晶体结构未知的5-HT1A, Warszycki等人采用MC和NMA方法，以同源模板和已知活性化合物为输入，生成了一个结合口袋集合，最终通过虚拟筛选发现了两个新的活性配体。【13】Suomivuori等人进行了广泛的MD模拟，以确定分别与阻滞蛋白或G蛋白有效结合的两种主要信号构象。【14】然后，他们通过轻微的化学修饰设计配体，从而产生强烈的阻滞偏倚或Gq偏倚信号转导。同时，McCorvy及其同事发现，特定的ECL2配体接触与β-阻滞蛋白募集有关，而TM5相互作用的阻断则会减少Gi/o信号传导。【15】因此，制造出一种抑制偏置DRD2的调节剂，其相对于喹匹罗的偏置系数为20。此外，Mannel等人对含有2,3-二氯苯基哌嗪的DRD2定制虚拟文库进行了VS，发现18种化合物占据了正构和变构位点，其中4种化合物刺激β-阻滞蛋白募集（EC50 = 320 nM, Emax = 16%），而没有检测到G蛋白信号。【16】

偏向激动或功能选择性为更精确的GPCR功能调节提供了机会，因此为治疗提供了增强的功效和/或减少的不良副作用。偏倚配体作为新一代药物的优点已经在几种GPCR中通过人临床试验中的研究药物例如TRV130进行了例证，其正在等待FDA批准。事实上，有偏见的激动作用已成为GPCR药物发现的主要范例。然而，值得注意的是，配体在特定受体上的偏倚性质可能不一定总是在治疗上有利，但是应该考虑到。

三、GPCR的变构调节剂筛选

在过去的5年中，越来越多的受体-变构调节剂复合物结构揭示了变构位点的不同位置和多种结合方式，从而加深了我们对变构调节的潜在机制和结构基础的认识。正性变构调节剂PAM可以增加激动剂信号强度以达到最大疗效，而负性变构调节剂NAM可以降低激动剂的信号强度。

靶向变构位点具有高特异性低毒副作用等潜力。靶向正构位点导致的非特异性、毒性等问题，有望通过解构独特的GPCR变构位点（allosteric receptor sites），进而特异性地调节正构配体的活性来解决。关于GPCRs结构的最新研究进展显示，除了与传统的正构位点结合外，配体还可以结合到偏远的变构位点，进而调控GPCR相关的生物学效应从而达到治疗的目的。这种通过变构位点（不同于内源性配体的结合位点）调节GPCR的方式，可以改变受体的结构、动力学和功能，从而获得潜在的治疗优势，例如更高的选择性（可能通过与具有相同内源性配体的受体家族中不太保守的位点结合），时间选择性（与内源性配体释放相关的作用），通路特异性（变构偏向性配体可以选择性地参与治疗相关的信号通路。【4】同时，针对变构位点有潜力针对过去不可撑腰的GPCR进行药物开发。以前由于正构结合位点的独特几何形状或内源性配体异常高的位点占用，某些GPCR被认为是不可成药靶点，而这或许可以通过变构调节剂的筛选改善。【11】变构调节剂的另一个潜在优势是饱和效应。由于变构调节剂需要依赖内源性配体，因此具有“天花板效应”，从而提高了过量剂量下的安全性。【11】

开发GPCR的偏向性配体，针对变构位点进行筛选更高效。根据GPCR家族的平均信息数(m)，即每个受体对应的配体，得到了图11的分析。系统的状态数为2H，其中m = 0对应于一状态系统，m = 1对应于两状态系统，m = 3对应于四状态系统，以此类推。图9的结果表明受体家族分为两组，趋化因子受体形成了大多数高熵受体的第二峰。第一组GPCR的平均位熵为~1，对应于一个双态系统。因此，预计这些GPCR只编码/解码一条外部消息，并且很可能是两状态full-on/full-off模型的示例。它们包括肾上腺素能、多巴胺能、神经紧张素、血管紧张素和γ-氨基丁酸B (GABAB)受体家族。对于包含第一个峰的受体家族，配体仅结合正构位点并赋予信号偏倚可能很难找到。在这种情况下，结合正构位点外的变构位点才可能产生需要的非二元的结果，即5.2提到的偏向性作用。这一分析支持了一种假设，即对于许多GPCR来说，将偏向性作用的化合物的搜索限制在正构位点上可能是无效的，而变构位点的筛选可能更有效。【11】

图11.内源性受体-配体相互作用的分析表明，需要超越正构位点来开发偏向GPCR配体。【11】

Korczynska等人筛选了460万个针对M2R变构位点的分子，并鉴定出一种PAM可增强拮抗剂n -甲基东莨菪碱(NMS)的作用。【17】随后的优化得到了一个亚型选择性化合物628，它以5.5的协同因子和1.1μm的KB增加了NMS的结合。另外，Lückmann等人对去除激动剂的FFAR1进行了MD模拟，发现潜在变构位点的关闭与激动剂结合有关，与该位点结合的化合物可以阻止变构激动剂的关闭。【18】显然，在82个受体的400个结构的帮助下，SBDD现在进入了一个新的时代，对GPCR信号和候选药物属性有了充分的了解。

多肽具有靶向变构位点的潜在优势。值得注意的是，正构位点往往位于膜外侧，而许多变构位点可能位于膜内，传统大分子药物（如抗体等）往往难以靶向这类别构位点。而多肽具备较好的穿膜性质，具备高亲和力高效靶向别构位点的潜力。

四、非天然氨基酸修饰：potency and PK/PD

非天然氨基酸的修饰是GPCR多肽药物开发的趋势。最近批准的GPCR多肽药物中出现了一种趋势，即GPCR多肽药需要具备高持续靶点效力，同时有较长的血浆半衰期和低的酶代谢和肾脏消除，这些要求仅靠天然氨基酸无法达到。仅由天然氨基酸组成的多肽药在体内的稳定性有限，会被肽酶快速降解和肾脏排出。针对A类GPCRs的含非天然氨基酸的合成修饰肽具有较高的高亲和力（中位数pKi = 8.8），这与天然肽相似。但修饰肽的血浆半衰期中位数大幅增加（3小时，不包括具有flip-flop动力学的化合物，而天然肽等效物为~5分钟）。在49个已批准的G蛋白偶联受体(gpcr)肽药物中，22个包含所有天然氨基酸，3个包含至少一种非天然氨基酸，3个具有至少一种化学修饰，21个同时具有化学修饰和非天然氨基酸（图12）。

图12. GPCR多肽药物的修饰类型

参考文献：

【1】Wootten, D., Christopoulos, A., Marti-Solano, M. et al. Mechanisms of signalling and biased agonism in G protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 19, 638–653 (2018). 网页链接

【2】Mullard, A. 2016 EMA drug approval recommendations. Nat Rev Drug Discov 16, 77 (2017). 网页链接

【3】Davenport, A.P., Scully, C.C.G., de Graaf, C. et al. Advances in therapeutic peptides targeting G protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov 19, 389–413 (2020). 网页链接

【4】Hauser, A., Attwood, M., Rask-Andersen, M. et al. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat Rev Drug Discov 16, 829–842 (2017). 网页链接

【5】Lyu, J., Wang, S., Balius, T.E. et al. Ultra-large library docking for discovering new chemotypes. Nature 566, 224–229 (2019). 网页链接

【6】Yu Zhou, Jing Ma, Xingyu Lin, Xi-Ping Huang, Kaichun Wu, and Niu Huang. Journal of Medicinal Chemistry 2016 59 (2), 707-720 DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5b01631

【7】Alexander Heifetz, Ewa I. Chudyk, Laura Gleave, Matteo Aldeghi, Vadim Cherezov, Dmitri G. Fedorov, Philip C. Biggin, and Mike J. Bodkin. Journal of Chemical Information and Modeling 2016 56 (1), 159-172

DOI: 10.1021/acs.jcim.5b00644

【8】Thal, D.M., Glukhova, A., Sexton, P.M. et al. Structural insights into G-protein-coupled receptor allostery. Nature 559, 45–53 (2018). 网页链接

【9】Wingler LM, Lefkowitz RJ. Conformational Basis of G Protein-Coupled Receptor Signaling Versatility. Trends Cell Biol. 2020;30(9):736-747. doi:10.1016/j.tcb.2020.06.002

【10】Foster DJ, Conn PJ. Allosteric Modulation of GPCRs: New Insights and Potential Utility for Treatment of Schizophrenia and Other CNS Disorders. Neuron. 2017;94(3):431-446. doi:10.1016/j.neuron.2017.03.016

【11】Slosky LM, Caron MG, Barak LS. Biased Allosteric Modulators: New Frontiers in GPCR Drug Discovery. Trends Pharmacol Sci. 2021;42(4):283-299. doi:10.1016/j.tips.2020.12.005

【12】Miao Y, Goldfeld DA, Moo EV, et al. Accelerated structure-based design of chemically diverse allosteric modulators of a muscarinic G protein-coupled receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(38):E5675-E5684. doi:10.1073/pnas.1612353113

【13】Warszycki D, Rueda M, Mordalski S, et al. From Homology Models to a Set of Predictive Binding Pockets-a 5-HT1A Receptor Case Study. J Chem Inf Model. 2017;57(2):311-321. doi:10.1021/acs.jcim.6b00263

【14】Suomivuori CM, Latorraca NR, Wingler LM, et al. Molecular mechanism of biased signaling in a prototypical G protein-coupled receptor. Science. 2020;367(6480):881-887. doi:10.1126/science.aaz0326

【15】McCorvy JD, Butler KV, Kelly B, et al. Structure-inspired design of β-arrestin-biased ligands for aminergic GPCRs. Nat Chem Biol. 2018;14(2):126-134. doi:10.1038/nchembio.2527

【16】Männel B, Jaiteh M, Zeifman A, et al. Structure-Guided Screening for Functionally Selective D2 Dopamine Receptor Ligands from a Virtual Chemical Library. ACS Chem Biol. 2017;12(10):2652-2661. doi:10.1021/acschembio.7b00493

【17】Korczynska M, Clark MJ, Valant C, et al. Structure-based discovery of selective positive allosteric modulators of antagonists for the M2 muscarinic acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115(10):E2419-E2428. doi:10.1073/pnas.1718037115

【18】Lückmann M, Trauelsen M, Bentsen MA, et al. Molecular dynamics-guided discovery of an ago-allosteric modulator for GPR40/FFAR1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(14):7123-7128. doi:10.1073/pnas.1811066116

END