NGS小知识 ‖ 浅谈时下火热的MRD检测技术

在讲MRD技术之前，先让我们简单复习下MRD的概念。

MRD，全称为minimal resideal disease，即微小残留病灶，指的是患者达到完全缓解后，仍残存于患者的体内的微小癌病灶，这些微小病灶难以通过常规的形态学检测方法检出，是患者疾病复发的重大隐患。

通过MRD检测，医生不仅可以精准地评估不同治疗方案的实际效果，判断患者的复发风险，而且可以针对性地采取更合适和个体化的治疗方案。

现在我们把目光聚焦到检测技术方面。技术的边界取决于生物学的极限。按目前临床可接受的抽血上限20ml计算，可获得的DNA拷贝数约2w+，经提取，建库约50%的损耗，最终推导出ctDAN的丰度在0.01%~0.02%，对应的生物学极限在0.01%的水平。意味着，当我们想进行MRD的检测时，ctDNA的检测敏感性要触及到万分之一的数量级。当前的NGS技术的应用从晚期走向早期时，敏感性是最大的瓶颈。

另外，技术及生物噪音也给MRD检测特异度带来难题。不同的位点，在不同的变异方向有不同的噪音水平，一刀切的固定阈值会损失灵敏度与特异性。而克隆性造血带来的生物学噪音，也会对检测信号的判读产生重要的影响。

NGS检测MRD的技术方法

循环肿瘤DNA（ctDNA）已成为实时评估MRD和复发风险的一种动态生物标志物。为MRD检测而优化的ctDNA分析必须能够在最低水平残余疾病负荷下检测到ctDNA，这是患者最有可能从治疗干预中受益的点。

当癌细胞死亡时，它们会释放DNA到血液中。通过收集血液样本中的所有cfDNA，可以对样本进行癌细胞标志物分析，以确定患者体内是否仍有癌细胞存在。

目前有两种检测MRD的方法，肿瘤知情分析（Tumor-informed 路径）和肿瘤不知情分析（Tumor-naive 路径），前者需要组织结果作为参考或定制panel，后者仅需分析血浆ctDNA的变异情况。

通常先采集患者肿瘤组织进行全外显子测序（WES）检测，针对每位患者选取肿瘤特异性的克隆位点进行个性化定制NGS Panel（或使用多重PCR方法)，在监测时提取血浆中的ctDNA进行超高深度测序，通常在术后约四周进行MRD检测。目前Tumor-informed 路径的代表性产品包括Signatera™（Natera）、PCM™（Archer DX）。

Signatera™利用配对的全血测序选择来自原发肿瘤组织WES的前16个体细胞突变（SNVs或indels），以过滤掉种系变异和克隆造血突变。根据克隆性、可检测性和突变频率来确定体细胞变异的优先次序。针对前16个肿瘤突变中的每一个设计引物，然后对在MRD情况下明确治疗后收集的后续血样中分离出的血浆cfDNA进行16-plex PCR。

Trace X II研究，在这个基础上，又增加了UMI，增加突变追踪数，从16muts提升到200muts，最大限度的在血中追踪组织突变。Archer分析性能的评估显示，追踪50muts的条件下，input DNA 30ng时，在0.01%的频率下可达到80%的灵敏性。同时，随着追踪突变数量的提升，可改善LOD。

图1. Signatera和PCM产品检测技术路径

通常采用预先设计的与癌症驱动基因相关的固定panel，常结合ctDNA甲基化或片段组学等多组学方法进行检测。目前Tumor-naive 路径的极致代表是CAPP-seq。

CAPP-seq是癌症个体化深度测序，是超高性价比的肺癌ctDNA检测技术，从COMIC数据库中挑选潜在驱动基因中的外显子，再从TCGA中407位NSCLC WES的测序结果中筛选，设计Panel覆盖NSCLC超过95%的突变，最后用一种最大化迭代算法设计出NSCLC ctDNA的“筛选器”。2016年，引入IDES技术，即分子标签+背景抛光算法，使CAPP-Seq性能提升15倍。2020年，开发Lung clip机器学习方法，旨在实现早期肺癌患者的鉴别筛查。增大Panel，加深测序深度。

图2. CAPP-seq产品进化演示路程

Tumor-informed assays和Tumor-agnostic assays各有特色，国内外企业在这两种技术路径的布局基本各占一半。MRD 检测在多种实体瘤中均有价值，包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌 等。但是，各癌种的 MRD 检测技术难度、术后复发率不同，同时，国内外企业在癌种上的布局上也有差异，国内更多企业主要聚焦在实体瘤上。在实体瘤 MRD 检测领域，布局泛癌种的企业越来越多，泛癌种 MRD 检测不局限癌种，获益人群更广泛，能够对接受根治性手术或根治性治疗的患者进行动态监控，评估复发的风险，是近来备受关注的实体瘤 MRD 检测产品。

针对同一癌种，单癌种和泛癌种 MRD 检测产品在同样的技术路径下性能是一样的，且成本差别不大，Tumor-informed 技术路径下，WES+个性化 panel 天然适合泛癌种 MRD 检测。所以，泛癌种 MRD 检测的经济性、普适性较高，机制更兼容、获益人群更广。

无论使用定制化panel还是固定panel，都是为了寻找cfDNA中的肿瘤特异性突变。我们把寻找肿瘤特异性突变比做从鱼塘里捕鱼，想要抓到更多的鱼，可以把渔网往更深的水里撒（定制化panel with 多重 PCR），也可以把渔网做的更大（固定化大panel）。

MRD检测方法的优劣势

固定化panel不需要根据每个患者进行定制，开发成本低，仅需要成熟的捕获平台，但是需要更多的数据量，敏感度相对低一点，会有假阴性的可能，最适用于晚期肿瘤患者，因为晚期患者的肿瘤负荷高，体内的 ctDNA 含量也非常高，对检测敏感度的要求相对不高。晚期患者在治疗过程中会 出现新的耐药基因的突变，需要通过一个大 panel 来进行评估，肿瘤组织未知分析在这 种场景下有很好的应用前景。

个性化panel敏感度特别高，因此最适合应用于对敏感度要求非常高的场景。比如根治性手术之后，体内的肿瘤负荷非常小，此时就需要通过高敏感度的检测方法来进行更好的 MRD 评估，而对于晚期患者治疗过程当中的一些新突变的检测，这种检测方法就不是特别适合。但是，个性化 panel 的样本可及性差，因为必须有组织样本，所以不适合根治性放化疗等无组织的患者，同时，对于组织异常如肿瘤细胞含量低、组织结果阴性的情况也无法追踪。

表1. 不同MRD检测策略的优劣势

除了 Tumor-agnostic 和 Tumor-informed 两种主流的技术路径外，MRD 检测技术还有其他的多创新方案，这些创新解决方案主要是通过检测更多生物标志物，提高单次检测的灵敏度，主要包括增加生物标志物的数量与种类等。我们看到探索的方向有增加检测突变数量的多突变检测、增加检测种类的突变+甲基化多组学联合检测以及突变+染色体的联合检测等。同时，在算法平台和 AI 应用上，有开发特定的算法平台及 AI 赋能挖掘突变位点的方案等。

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