作者解读丨内蒙古农大: 鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9通过调节肠道代谢物增强抗PD-1治疗的抗肿瘤反应(国人佳作)

编译：九卿臣

编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读

益生菌已被研究者提出用于增强免疫检查点阻断(ICB)治疗癌症的疗效。然而，它与免疫疗法疗效作用的关系仍不清楚，因此本研究旨在探索益生菌鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9是否以及如何操纵肠道微生物组以达到预期效果。首先通过多组学方法评估了Probio-M9对抗PD-1治疗小鼠结直肠癌的影响，然后综合分析共生肠道菌群的宏基因组和代谢物以及宿主的免疫因子和血清代谢组，确定Probio-M9介导的抗肿瘤免疫的机制。结果显示，Probio-M9干预增强了抗PD-1疗法的肿瘤抑制作用，并且Probio-M9的预防性和治疗性干预在ICB治疗抑制肿瘤生长方面均有显著作用。补充Probio-M9通过促进有益微生物的生长(如乳杆菌和动物双歧杆菌)、产生有益代谢产物(如肠道中的丁酸，血液中的α-酮戊二酸、N-乙酰-L-谷氨酸和吡哆醇)，从而促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的浸润和激活，并抑制肿瘤微环境(TME)中调节性T细胞(Tregs)的功能来增强免疫治疗反应。随后，通过将益生菌治疗后的肠道菌群或肠道代谢物移植到新的荷瘤小鼠身上，结果发现这种增强的免疫治疗反应是可以传递的。综上所述，本研究对Probio-M9在改善影响抗PD-1疗效的肠道菌群缺陷方面的作用提供了宝贵的见解，它可以作为与ICB的替代协同剂用于临床癌症治疗。

论文ID

原名：Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9 enhanced the antitumor response to anti-PD-1 therapy by modulating intestinal metabolites

译名：鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9通过调节肠道代谢物增强抗PD-1治疗的抗肿瘤反应

期刊：eBioMedicine

IF：11.205

发表时间：2023.4

通讯作者：张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1016/j.ebiom.2023.104533

实验设计

在本实验中，6-8周大的小鼠被随机分为四组(n=12)，包括未接受任何治疗的空白对照组(Model，M)、预防性Probio-M9干预和抗PD-1联合治疗组(PreM9+抗PD-1，Pre)、治疗性Probio-M9干预和抗PD-1联合治疗组(PostM9+抗PD-1，Post)和仅使用抗PD-1治疗的医学对照组(抗PD-1，αPD-1)。通过在第0天皮下注射5×105个CT26细胞，建立结直肠癌肿瘤小鼠模型。从第-14天到第0天和第7天到第18天，分别给Pre组和Post组的小鼠每天口服5×109 CFU的Probio-M9，而两个非益生菌接受组则给予等量的正常生理盐水。对于ICB治疗，Pre、Post和αPD-1组的小鼠腹腔注射100 mg小鼠抗PD-1单克隆抗体，而M组的小鼠腹腔注射100 mg大鼠免疫球蛋白(Ig)G2a作为同型对照，从第7天开始每3天注射一次。肿瘤细胞注射后第7、10、13、16和19天测量肿瘤大小，并在第-14、0、7和19天收集粪便品。小鼠在第19天被处死，收集血液，并手术分离出肿瘤，称重并适当保存以进行相应检查。对于粪便移植，将供体小鼠的新鲜结肠粪便溶解在PBS中，通过多次离心分成沉淀物和上清液，其中上清液进一步通过0.22 μm无菌尼龙过滤器过滤。粪便菌群移植组(FMT+αPD-1)和粪便上清液移植组(FST+αPD-1)的受体小鼠以一对一灌胃的方式接受沉淀物和上清液。  

图1 实验设计图。

前言

免疫治疗作为癌症治疗领域的一个革命性方法，通过增强宿主的免疫系统以产生抗肿瘤作用，其中在治疗各种恶性肿瘤方面取得了显著的进展。这种治疗方法可以通过单克隆抗体阻断肿瘤微环境(TME)中的负面免疫调节因子，以改善肿瘤免疫监视并增强宿主对肿瘤的免疫活性。在这一领域，科学研究和临床应用中最具吸引力的抑制剂包括细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡受体-1(PD-1)和程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)。然而，只有一小部分患者对ICB治疗产生有意义的反应。因此，迫切需要新的方法来改善免疫检查点抑制疗法的宿主反应和结果。

虽然已经探索出许多新的免疫检查点分子和途径，以提高现有ICB治疗的疗效，但它们可能会增加免疫相关不良事件的发生率和严重程度。同时，新的证据表明，ICB疗法的疗效与接受者的基线肠道菌群密切相关。此外，癌症治疗效率低下与肠道菌群失调有关，而健康的肠道菌群往往对免疫治疗的结果有益。因此，将调节肠道菌群与抑制免疫检查点相结合，可以成为开发新一代抗肿瘤治疗方案的策略。外源性益生菌可以直接或间接地在体内产生有益的代谢物，以激活和促进抗肿瘤免疫反应。例如，双歧杆菌(如B. longum、B. breve和B. bifidum)的富集或补充增强了TME中树突状细胞(DCs)的抗原呈递，进一步促进了肿瘤中细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的浸润和激活，从而提高了基于PD-1/PD-L1阻断免疫疗法的疗效。B. pseudolongum产生的肌苷可以在体内通过腺苷2A受体调节T辅助细胞1(Th1)的分化，同时抗PD-1或抗CTLA-4诱导IFN-γ释放，这种联合作用优化了小鼠的ICB治疗。更重要的是，来自肠道共生菌的短链脂肪酸(SCFAs)可以通过调节CD8+ T细胞反应在癌症治疗中发挥免疫促进作用。然而，辅助性的益生菌往往以菌株特异性的方式实现与ICB的协同治疗效果。因此，有必要将益生菌-ICB的协同机制背景融入典型的益生菌菌株。

在之前的研究中，从人类初乳中分离出了一株益生菌：鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9(L. rhamnosus Probio-M9，Probio-M9)，并验证了其在肿瘤预防和协同治疗方面的功能。这些研究表明，Probio-M9治疗后可以有效恢复由炎症或抗生素引起的肠道菌群失调，从而提高正交和异位结直肠癌治疗中的抗肿瘤疗效。在此，我们评估了Probio-M9协同抗PD-1治疗小鼠结直肠癌的预防和治疗效果。从微生物群代谢、宿主代谢和肿瘤微环境调节等方面进一步探讨了施用益生菌和免疫疗效之间的关系。  

结果

1. Probio-M9的预防性和治疗性干预增强了抗PD-1的肿瘤抑制作用

为了研究益生菌是否能够增强携带完整宿主肠道菌群的ICB的抗肿瘤作用，在注射CT26细胞之前(Pre组)或之后(Post组)，用Probio-M9喂养肿瘤小鼠，并在肿瘤发展到可触摸时用抗PD-1治疗(图2A)。肿瘤的生长和抗肿瘤效果通过肿瘤体积和肿瘤重量来评估。由于对肿瘤生长的抑制，无论是预防性还是治疗性干预，Probio-M9联合抗PD-1治疗显著提高了荷瘤小鼠的存活率(n=12； P<0.05)(图2B)。在第19天，Pre组的平均肿瘤大小最小，平均体积为1143.00±86.87 mm3，平均重量为1.65±0.05 g，其次是Post组，其肿瘤体积和重量分别为1411.96±167.73 mm3和1.93±0.17 g。两个Probio-M9治疗组的肿瘤都明显小于空白对照组(M组)(1877.86±90.62 mm3，2.43±0.16 g)和医学对照组(αPD-1组)(1876.76±144.33 mm3，2.59±0.25 g)(P<0.05)(图2C、D)。与只用抗PD-1治疗的小鼠相比，Probio-M9的预防性干预在肿瘤生长的早期阶段(第10天)表现出显著协同作用，而治疗性Probio-M9干预则在其灌胃6天后(第13天)表现出共同抑制作用(图2C)。这表明Probio-M9的预防性和治疗性给药都能协同促进抗PD-1的抗肿瘤免疫能力。

图2 Probio-M9联合抗PD-1的抗肿瘤作用。

(A)显示实验设计的示意图。肿瘤移植当天设为第0天，在这一天给小鼠皮下注射CT26细胞。Probio-M9预防性治疗从第-14天到第0天每天口服灌胃Probio-M9(PreM9+抗PD-1组)，其余各组同时给予生理盐水。从第7天到第16天进行基于抗PD-1的ICB治疗。在此期间，将Probio-M9补充给PostM9+抗PD-1组的小鼠，而模型组仅接受大鼠IgG2a作为同型对照。在最后一次注射抗PD-1后3天(第19天)处死小鼠。在第-14、0、7和19天采集粪便样本进行宏基因组测序和SCFAs鉴定，在第19天采集血清和肿瘤组织样本用于相应研究。

(B)四组小鼠的存活率。

(C) CT26肿瘤生长动力学。

(D)处死小鼠后手术分离肿瘤的重量。通过Wilcoxon检验评估显著差异(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。数据以平均值±SEM(n=12)表示。

2. Probio-M9治疗和PD-1阻断的协同抗肿瘤作用与肿瘤微环境中的免疫力提高有关

除了缩小肿瘤体积，Probio-M9和抗PD-1的联合治疗还显著降低了小鼠移植肿瘤中Ki67的阳性率(P<0.01)，这表明肿瘤细胞的增殖受到了抑制(图3A和B)。基于这一结果，进一步观察肿瘤浸润性T淋巴细胞是否增加。结果显示，CD3的阳性率显著上升(P＜0.05)(图3C和D)，同时，用Probio-M9治疗的小鼠肿瘤中CD8+和CD4+ T细胞的比例也显著增加(P＜0.05)(图3E和F)。尽管与模型组相比，单独的抗PD-1治疗呈现出更高的CD8+ T细胞比例(P<0.05)，但Probio-M9的辅助给药更显著地促进了这种免疫增强作用(Pre组或Post组与M组，P<0.01；Pre组或Post组与αPD-1组，P<0.01)。此外，各组之间的IL-6浓度没有差异，而ProBio-M9治疗组的IFN-γ表达量增加，并且与其他两个非益生菌组相比，IL-10和FoxP3的释放量显著下降(P<0.05)(图3G-J)。这些结果表明，Probio-M9可以通过促进CTL和Th1细胞的浸润和激活，并抑制TME中调节性T细胞(Tregs)的功能来改善抗PD-1的免疫治疗效果。

图3 Probio-M9和抗PD-1的协同治疗增强了抗肿瘤反应。

(A和B) IHC染色和肿瘤中Ki67的阳性细胞密度。(C和D) IHC染色和肿瘤中CD3的阳性细胞密度。(E和F)肿瘤中CD8+和CD4+ T细胞占总CD3+细胞的百分比。(G–J)肿瘤组织匀浆中细胞因子的浓度。通过Wilcoxon检验评估显著性差异(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。

3. Probio-M9通过增加共生有益微生物改善肠道菌群

为了研究Probio-M9通过调节肿瘤小鼠的肠道菌群对抗PD-1治疗效果的潜在作用，进行了多时间点的宏基因组学分析。结果显示，α和β多样性受到灌服Probio-M9的显著影响。使用益生菌后，Pre组和Post组的肠道菌群丰度都显著增加(P<0.05)(图4A)。在基线时，所有四个组中的物种结构组成表现为相对聚集，而在Probio-M9治疗后，Pre组和其他组之间的Bray-Curtis距离显著增加(P<0.05)(图4B)。这种动态变化通过与各组初始菌群结构相比的Bray-Curtis距离的差异显示出来(图4C)。可以证明Probio-M9处理使肠道菌群的组成和结构发生了显著的变化，而且这种影响在灌胃的早期阶段更为显著。 进一步分析了各组微生物组成随时间变化的情况。在属水平上，Probio-M9处理后，Lactobacillaceae的含量增加，而Bacteroides、Mucispirillum、Candidatus Arthromitus和Clostridium的含量下降(图4D，表S2)。Lactobacillaceae在调节肠道菌群和增强宿主免疫力方面发挥作用，而Mucispirillum可以在严重免疫缺陷的宿主中诱发结肠炎，Candidatus Arthromitus则与系统性促炎因子的升高有关。在物种水平上，Probio-M9干预增加了Lacticaseibacillus rhamnosus(基线中没有发现内源性L. rhamnosus)、Lactobacillus Johnsoii、Bifidobacterium animalis和其他对人类健康有益的细菌物种的丰度(图4E，表S3)。

为了找出肠道菌群与ICB疗效之间的关系，随后确定了对Probio-M9和抗PD-1联合治疗有响应的且丰度具有显著差异的物种。首先，筛选出与Probio-M9干预(前和后)相关的富集物种。与两个非益生菌治疗组(M和αPD-1)相比，在Probio-M9处理组中，Bifidobacterium animalis、Acinetobacter lwoffii、Staphylococcus lentus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii和Lacticaseibacillus rhamnosus的丰度都显著增加(P<0.05)。此外，在抗PD-1治疗后，两个免疫反应增强组(Pre和Post)中增加的物种(P<0.05)包括Acinetobacter lwoffii、Aerococcus viridans、Bacillus isronensis、Bifidobacterium animalis、Enterococcus faecali、Enterococcus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosu、Lysinibacillus unclassified和Staphylococcus lentus(图4F)。

图4 Probio-M9和抗PD-1联合给药对荷瘤小鼠肠道菌群的动态变化。

(A和B)每组小鼠在所有四个采样时间点的肠道菌群的Chao1指数和主坐标分析(PCoA，Bray-Curtis)。(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。(C)基线与其他采样时间点的Bray-Curtis距离差异。(D和E)粪便微生物在属和种水平上的组成。(F) Probio-M9灌胃和与抗PD-1联合治疗的差异物种。顶部和中间的图表分别表示Pre组中的微生物，其丰度在补充Probio-M9和抗PD-1处理后分别发生了显著变化。底部的热图表示联合治疗后Post组微生物的显著变化。所有图中的T1、T2、T3和T4分别代表第-14、0、7和19日的采样时间点。

4. Probio-M9通过上调特定的细菌种类和菌株增加短链脂肪酸的代谢

鉴于共生微生物群经常通过表达特定的代谢物来影响宿主的生理状况，如短链脂肪酸参与宿主的免疫调节。因此，对小鼠粪便中的乙酸、丙酸和丁酸进行了定性和定量鉴定，这些样品与宏基因组测序的样品平行。结果发现，在Probio-M9和抗PD-1联合治疗后，乙酸和丙酸的含量在Pre组和Post组都显著增加，而丁酸在Pre组显著富集(P<0.05)。相比之下，非益生菌组的大多数SCFAs没有显著变化(只有αPD-1组的丙酸含量显著增加，P<0.05)(图5A)。这表明，灌服Probio-M9可以改善小鼠SCFAs的积累。随后，对各组四个时间点的肠道菌群和SCFA含量进行了Spearman相关性分析，探索小鼠肠道中与SCFAs富集有关的微生物。结果显示，在非益生菌治疗组(M和αPD-1)中，很少有细菌物种与SCFAs含量相关，而在Probio-M9治疗组(Pre和Post)中，正相关的物种数量有所增加(r>0.3)。这些物种包括Pre组中的Acinetobacter lwoffii、Aerococcus viridans、Staphylococcus lentus、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus johnsonii、Enterococcus gallinarum、Lysinibacillus unclassified、Enterococcus faecali和Bacillus isronensis，以及Post组中的Acinetobacter lwoffii、Bifidobacterium animalis、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii和Lactobacillus rhamnosus(图5B)。这些结果表明，Probio-M9通过增加相关的微生物种类来促进SCFA的产生。

此外，构建宏基因组组装基因组，从种水平进一步确定与SCFAs相关的肠道细菌。系统发育树显示，肠道菌群主要由Firmicutes组成，其他菌株分布在Bacteroidota、Proteobacteria、Deferribacterota、Desulfobacterota、Actinobacteriota和Cyanobacteria(图5C)。然后，我们分析了组装菌株的信息与SCFAs含量之间的相关性。与之前物种水平的相关研究结果一致，两个Probio-M9干预组中与SCFAs正相关(r>0.3)的菌株数量高于α-PD-1组(Pre、Post和α-PD-1组中分别有25、18和13个菌株)(图5D)。同时，进一步筛选了在物种水平和菌株水平上与SCFAs含量显著正相关的细菌。其中有8个在Pre组中特异性增加的菌株，包括Lactobacillus reuteri、 Lactobacillus murinus、Lactobacillus johnsonii、Staphylococcus lentus、Enterococcus gallinarum、Eubacterium plexicaudatum、Eubacterium plexicaudatum和Lysinibacillus sp.(图5E)。因此，推测Probio-M9的预防性干预可以富集更多产生SCFA的菌株，这也可能是该组在后续抗肿瘤免疫治疗中取得更好疗效的原因。

图5 Probio-M9增加了微生物产生的SCFA与特定物种或菌株之间的相关性。

(A)联合治疗前后小鼠粪便中短链脂肪酸的浓度。T1和T4分别代表第-14天和第19天的采样时间点。通过Wilcoxon检验评估显著差异(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。

(B)与各组小鼠肠道中的乙酸、丙酸和丁酸呈正相关的细菌种类。实线的粗细表示相关性的强弱。

(C)由宏基因组组装基因组(MAG)构建的系统发育树。不同的颜色用于区分组装菌株所在的门。

(D)各组小鼠肠道中与乙酸、丙酸和丁酸呈正相关的菌株。实线的粗细表示相关性的强弱。

(E)在物种水平和菌株水平上与SCFAs含量显著正相关的细菌。曲线表示Pre组中这些菌株的相对丰度的动态变化，Probio-M9干预后除大肠杆菌外的所有菌株均显著增加。所有图中的T1、T2、T3和T4分别代表第-14、0、7和19天的采样时间点。

5. Probio-M9通过调节代谢与肿瘤小鼠免疫产生相互作用

荷瘤小鼠在接受或不接受Probio-M9治疗时，其肠道环境和宿主免疫存在差异，因此本研究继续探索它们之间是否存在联系。依据代谢组学技术对血清代谢物进行检测，共有1,643个化合物被注释，并根据是否使用抗PD-1或Probio-M9筛选了208个差异表达代谢物(DEMs)(表S4和5)。这些DEMs富集在嘌呤代谢、烟酸和烟酰胺代谢、精氨酸生物合成、间隙连接、昼夜节律调节、醛固酮合成和分泌以及C5-支链二元酸代谢等功能途径中。Spearman相关性分析显示，27个DEMs与肿瘤体积显著正相关(r≥0.2，P＜0.05)，而其他23个DEMs与肿瘤体积显著负相关(r≤-0.2，P＜0.05)(图6A)。此外，被Probio-M9上调并与肿瘤生长负相关，被Probio-M9下调并与肿瘤生长正相关的功能代谢物可被视为候选生物代谢标志物，包括鸟苷、α-酮戊二酸(α-KG)、6-羟基-3-琥珀酰吡啶、N-乙酰-L-谷氨酸、吡哆醇、多巴醌、黄嘌呤、醛固酮、L-threo-3-甲基天门冬氨酸、3'-aenylic acid、5'-二磷酸腺苷、oleandolide和terpentedienyl diphosphate(图6B，表S6)。这一结果表明，Probio-M9可能会调节小鼠血清中某些与肿瘤抑制相关的代谢物。

然后，进一步从Probio-M9上调的微生物、SCFAs、小鼠代谢物和抗肿瘤免疫之间的整体相关性来解释肠道环境与宿主免疫之间的潜在关系。结果显示，SCFAs通过血清代谢物与Ki67呈负相关，与CD3呈正相关，而这又与Probio-M9上调的微生物种类有关(图6C)。因此，我们推断出Probio-M9联合抗PD-1改善ICB抗肿瘤反应的机制。Probio-M9通过增加有益细菌来调节肿瘤小鼠的肠道菌群，从而促进乙酸、丙酸和丁酸在肠道的积累，这些SCFAs进一步增加了小鼠血液循环中的特定代谢物，包括α-KG、N-乙酰-L-谷氨酸和吡哆醇，进一步促进了CTLs的浸润和激活，抑制了TME中Tregs的功能(图6D)。

图6 Probio-M9和抗PD-1通过微生物衍生代谢物和宿主代谢物的相互作用，提出了协同抗肿瘤作用机制。

(A)筛选出小鼠血清中与肿瘤生长呈正相关或负相关的差异表达代谢物。热图中仅显示相关系数绝对值大于0.2且P值小于0.05的代谢物。

(B)每组小鼠中筛选出的代谢物的平均丰度比较。通过Wilcoxon检验评估(A)和(B)的显著性差异(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。

(C)血清代谢物、粪便SCFA和肠道菌群之间的相关性。金色实线代表正相关，银色虚线代表负相关。线条的粗细表示相关性的强度。

(D) Probio-M9促进抗PD-1疗效的示意图。黑色箭头曲线表示促进作用。相应文本旁边的棕色箭头表示它们的上调或下调。

6. Probio-M9在增强抗PD-1方面的有益作用可以通过粪便菌群移植(FMT)或粪便上清液移植(FST)来传递

为了直接确认Probio-M9对抗PD-1的协同机制是否通过调节肠道菌群来介导，将ICB治疗下显示出最佳结果的Pre组小鼠粪便移植到另两组小鼠中，接受粪便菌群(FMT+αPD-1组)或粪便上清液(FST+αPD-1组)，并在肿瘤植入后进行抗PD-1治疗(图7A)。结果发现，两组受体小鼠都显示出显著的抗肿瘤疗效，肿瘤小鼠的存活率提高，肿瘤的生长受到了抑制(图7B-D)。 然后对供体和受体小鼠的粪便进行了宏基因组分析。供体粪便中包括乳杆菌物种，如Lactobacillus murinus、Lactobacillus reuteri和Lactobacillus johnsonii(图8A)。粪便移植后，随着时间的推移，FMT+αPD-1组的样本与Pre组的样本趋于相似(Adonis检验，P=0.4279)。相反，只接受粪便上清液移植的小鼠(FST+αPD-1组)的粪便菌群与供体分离(Adonis检验，P<0.05)(图8B)。进一步分析发现，在之前试验被Probio-M9显著上调且与SCFAs显著相关的11种细菌中，其中6种也因FMT或FST而在验证组中增加，包括Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus murinus、Acinetobacter lwoffii、Lactobacillus reuteri、Aerococcus viridans和Lactobacillus gasseri(图8C)。然后根据对粪便SCFAs的分析，移植菌群或上清液后，乙酸、丙酸和丁酸的含量显著增加(图8D)。最后，根据血清代谢组分析，α-KG的浓度在FMT或FST处理的小鼠中显著升高(P< 0.05)(图8E)。虽然粪便上清液没有显著改变受体小鼠的群落多样性，但仍可获得与Probio-M9干预类似的结果。为了探索可能的原因，进一步确定了粪便上清液的代谢物组成，其中包括高丰度的胆汁酸和氨基酸(表S7)。

总之，受体小鼠大多再现了在供体小鼠身上观察到的类似的微生物、代谢和抗肿瘤的功效。这些结果进一步验证了辅助性益生菌对肿瘤免疫治疗的协同机制和作用。由此得出结论，Probio-M9可以通过调节肠道菌群，增加有益的代谢物，如SCFAs和氨基酸，来改善宿主对抗PD-1的反应。

图7 粪便移植传递的抗肿瘤作用。

(A)粪便移植实验设计示意图。以前研究中抑瘤效果最好的Pre组作为粪便供体小鼠，粪便菌群移植组(FMT+αPD-1)和粪便上清液移植组(FST+αPD-1)的受体小鼠接受沉淀物和上清液一对一灌胃。

(B)与抗PD-1单独治疗组相比，粪便受体小鼠的存活率。

(C)肿瘤生长和(D)肿瘤重量。通过Wilcoxon检验评估显著差异(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。数据表示为平均值±SEM(n=12)。

图8 粪便移植小鼠肠道菌群和代谢物的再现性。

(A和B)来自3组小鼠所有四个采样时间点的肠道菌群的Chao1指数和主坐标分析(PCoA，Bray-Curtis)。

(C) Probio-M9对特定物种的上调作用在粪便移植小鼠中得到了验证。

(D)粪便移植小鼠中SCFAs含量的动态变化。

(E)在粪便移植小鼠中被Probio-M9显著上调的所选血清代谢物的含量。通过Wilcoxon检验评估显著差异(*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001)。数据以平均值±SEM(n=12)表示。  

讨论

众所周知，肠道菌群会影响ICB抗肿瘤治疗的疗效，但其作用机制仍然难以确定。新的研究表明，人类或动物的肠道菌群失调导致宿主对免疫疗法反应不佳。此外，服用辅助性益生菌鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9可通过恢复被抗生素破坏的肠道菌群来增强抗PD-1抗肿瘤治疗的效果。本研究进一步证明，辅助性的Probio-M9改善了抗PD-1的抗肿瘤效果，表现为抑制肿瘤生长和减少细胞增殖标志物(如Ki67)的表达。在用M9联合抗PD-1治疗的肿瘤小鼠中，CD8+和CD4+ T细胞的比例和IFN-γ的表达处于较高水平，而IL-10和FoxP3的分泌水平相对较低，表明CTL和Th1的增加以及Tregs的减少。Probio-M9增加了TME中效应T细胞的浸润，而抗PD-1促进了它们的活化，从而提高了对肿瘤细胞的杀伤力。与本研究一致，其他一些益生菌株，如双歧杆菌、Lactobacillus johnsonii、Olsenella sp.和鼠李糖乳酪杆菌GG在与ICB联合治疗中也起到了促进免疫细胞浸润的作用。因此，这些定植于宿主肠道的益生菌可以直接或间接地影响TME的重编程。一方面，共生细菌可以通过与肠道树突状细胞的直接接触触发抗原呈递过程，然后激活的T细胞可能通过肠系膜淋巴结迁移到肿瘤引流淋巴结。另一方面，肠道菌群表达的特定代谢物促进粘膜Th1转录分化。 考虑到这一点，进一步分析了肠道菌群和受Probio-M9调控的代谢物，以探索其改善抗PD-1疗法的可能途径。

与非益生菌治疗组相比，在Probio-M9干预下，肿瘤小鼠的肠道菌群的结构和功能都发生了改变。给予Probio-M9后，共生细菌(即乳杆菌物种Acinetobacter lwoffii、Bifidobacterium animalis、Enterococcus faecalis、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus johnsonii和Lactobacillus reuteri)的相对丰度显著增加，这些菌种对宿主免疫有益。因此，在本研究中，Probio-M9诱导的特定常驻肠道物种或菌种的变化与基于抗PD-1的治疗的疗效增强有关。 此外，本研究还探讨了Probio-M9通过微生物和宿主代谢物之间的调节关系促进抗肿瘤免疫的潜在机制。研究发现，经Probio-M9处理的小鼠粪便中积累了更丰富的乙酸、丙酸和丁酸。这些SCFAs的丰度与上述共生细菌在物种和菌株水平上都显著相关。因此，推断Probio-M9通过增加小鼠肠道内特定有益细菌的定植来改善SCFAs的产生。并且微生物SCFAs可以通过组蛋白乙酰化抑制途径和G-蛋白偶联受体途径影响宿主的转录和代谢。因此，为了研究肠道菌群代谢和宿主代谢之间的关系，在肿瘤小鼠中筛选了在Probio-M9处理组之间含量不同，并且与肿瘤抑制显著相关的血清代谢物，特别是α-KG。作为谷氨酸的前体和三羧酸循环的重要中间体，α-KG在肿瘤抑制和免疫调节中起着重要作用。研究表明，α-KG可以通过DNA去甲基化修复与致癌有关的异常表观遗传修饰，还可以促进Th1和CD8+ T细胞的分化；并且口服α-KG对健康有益，如增强免疫力和抗肿瘤，表明α-KG可以进入循环系统，在调节人类或动物的生理功能中发挥关键作用。此外，α-KG的摄入也能调节肠道菌群，增加乳杆菌和SCFAs的丰度。

根据上述发现，α-KG应该是一种重要的中介类代谢物，参与肠道菌群和宿主免疫之间的关键交叉联系。在本研究中，血清中的α-KG含量随着Probio-M9的摄入而增加，并与粪便中的SCFAs和肿瘤浸润性T细胞的数量呈正相关。而且在Probio-M9的干预下，参与免疫调节的另外两种上调的血清代谢物可能与粪便中的SCFAs有关(即N-乙酰-L-谷氨酸和吡哆醇)。总之，研究结果表明Probio-M9改变的肠道菌群有利于SCFAs的产生，促进与小鼠免疫增强有关的代谢分子的积累。 最后，本研究首先尝试使用粪便菌群和上清液移植策略来验证益生菌调控的肠道菌群与宿主表型变化(即肿瘤大小减少)之间的因果关系。FMT和FST的受体小鼠再现了在供体小鼠身上观察到的相似的肠道菌群、代谢变化和抗肿瘤功效。这些结果表明，益生菌处理后的肠道菌群和代谢产物都可以调节宿主小鼠的免疫水平，影响ICB治疗的疗效。

结论

基于上述研究，总结了补充Probio-M9在抗PD-1免疫疗法中的潜在机制：

(1)灌服Probio-M9丰富了各种常驻的共生肠道菌群；

(2) Probio-M9调节的肠道菌群产生更多有益的SCFAs；

(3)这些微生物代谢产物进一步促进了免疫调节分子在小鼠血液中的积累。

(4)这些物质通过调节CD4+、CD8+ T细胞的分化、浸润和激活，进一步增强了TME的免疫反应；

(5) 抗PD-1通过PD-1/PD-L1靶点阻断了肿瘤细胞与T细胞的结合，维持并增强T细胞的免疫杀伤作用，抑制肿瘤的生长。以益生菌-菌株特异性的方式阐明这些机制将大大有助于我们进一步了解益生菌、肠道菌群和宿主免疫之间的相互作用，以便在未来合理制定治疗策略，有效预防癌症。

打赏