分化型甲状腺癌存在RAS和其他致癌基因共突变，意味着预后较差

RAS突变可见于不同类型的甲状腺肿瘤，需要更多的标志物来更好地评估预后。本研究旨在评估在RAS突变甲状腺癌，特别是分化型甲状腺癌（DTC）中，其他关键基因突变的预后意义。分析了2014年1月至2021年12月期间在布莱根妇女医院和/或丹娜法伯癌症研究院接受治疗并进行了NGS检测的连续的DTC、低分化甲状腺癌（PDTC）或甲状腺未分化癌（ATC）患者的临床和基因特征，纳入了携带RAS突变的患者，基于是否存在其他致癌变异比较了临床特征和结局。纳入了78例患者，其中22%（17/78）携带RAS驱动突变伴其他致癌变异。所有6例（100%）ATC均存在其他突变。与仅携带RAS突变的DTC相比，同时携带RAS和其他突变的DTC患者根据美国甲状腺协会（ATA）复发风险分层评估系统被归为复发风险高（77% vs 12%; P<0.001），原发性肿瘤较大（4.7 vs 2.5 cm; P=0.002）和诊断时为晚期（III或IV期）（67% vs 3%; P<0.001）的可能性更高。重要的是，平均随访65个月，如果同时携带其他突变，DTC特异性死亡率高出10倍以上（20% vs 1.8%，P=0.011）。本研究表明，在RAS突变DTC中，同时携带其他关键突变的甲状腺癌更具侵袭性，死亡风险更高，并可以解释RAS突变甲状腺癌的多样性。这些数据支持DTC进行基因检测，为预后评估和临床决策提供信息。

研究背景

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，过去几十年中，其发病率不断上升。尽管大多数患者预后较好，但仍有一小部分患者表现为侵袭性疾病，复发风险较高，甚至最终死亡。

在过去十年中，我们对甲状腺癌的基因特征有了更多了解，特别是在具有里程碑意义的癌症基因组图谱（TCGA）研究之后。研究表明，RAS癌基因（NRAS>HRAS>KRAS）在人类甲状腺肿瘤的发生中起着重要作用，是继BRAFV600E之后甲状腺肿瘤中第二常见的变异。RAS基因突变导致MAPK通路组成性激活，是驱动甲状腺癌转化的起始事件，但其致癌潜力低于BRAFV600E变异。RAS突变可见于所有类型的滤泡起源的甲状腺肿瘤，从滤泡腺瘤（20-25%），到甲状腺癌，包括甲状腺滤泡状癌（FTC）和滤泡型甲状腺乳头状癌（FVPTC）（30-45%），再到更具侵袭性的甲状腺恶性肿瘤，包括低分化甲状腺癌（PDTC）（20-40%）和甲状腺未分化癌（ATC）（10-20%）。对RAS突变已经开展了广泛研究，探索其诊断和预后作用。然而，由于上述异质性，目前其作为生物标志物的潜在效用有限。

分析更具侵袭性的甲状腺癌（如ATC和PDTC）的基因组和转录组学特征，发现关键致癌变异的逐渐积累导致从惰性病变转变为更具侵袭性的癌症。一个典型的例子是TERT启动子突变，BRAFV600E和RAS突变PTC同时存在TERT启动子突变与更差的临床病理结果相关。我们最近的一项研究表明，PI3K通路突变与BRAFV600E突变PTC疾病特异性死亡率独立相关。据我们所知，尚未有研究全面探索了RAS突变甲状腺癌中其他致癌突变对预后的影响。

了解不同类型的RAS突变甲状腺癌的特征有助于临床医生进行个体化管理，无论是对于治疗，还是为了更好的预后和个体化随访。本研究分析了NGS数据与临床病理学特征的相关性，以识别更具侵袭性、死亡风险更高的肿瘤。我们假设，异质性的RAS突变甲状腺肿瘤初诊时进行全面基因检测有助于评估风险，以及为治疗决策提供信息。

研究结果

RAS突变甲状腺癌的基线特征和基因特征

患者和肿瘤特征如表1所示。该队列包括78例RAS突变甲状腺癌患者（图1）。65%为PTC（主要是FVPTC），13%为FTC，1%为Hurthle细胞癌或嗜酸性细胞癌（HCC），4%为PDTC，8%为ATC，9%被重新归类为具有乳头状核特征的非浸润性甲状腺滤泡性肿瘤（NIFTP）。平均年龄为52.3±15.3岁，63%（n=49）为女性。

表1. 基线特征

图1. 纳入甲状腺癌患者的流程，以及基于组织学类型和是否存在其他致癌突变的分类

所有RAS突变甲状腺癌基因检测结果显示中位±四分位距（IQR）4±4个变异/肿瘤（范围1-15）。重要的是，22%（17/78）的患者携带其他致癌突变。这些肿瘤的Oncoprint和选定突变列表如图2A和表2所示。这些选定的其他突变是克隆事件，其次等位基因频率（MAF）与RAS驱动突变相似（中位MAF分别为35%和32%，Mann-Whitney P = 0.9083 ns; 图2B）。 

图2. 具有其他致癌突变的RAS突变甲状腺癌的基因特征。

A. 具有其他致癌突变的RAS突变甲状腺癌的Oncoprint检测结果。B. RAS与其他致癌突变次等位基因频率（MAF）的比较。选定的其他突变是克隆事件，其MAF与RAS驱动突变的相似（中位MAF：分别为35%和32%，Mann-Whitney P = 0.9083 ns）。

表2. 在17例RAS突变甲状腺癌中发现的其他相关致癌突变

其他致癌突变在晚期甲状腺癌中富集

所有RAS突变ATC患者（100%，6/6）均存在其他致癌突变，最常见的是TP53突变，有83%的患者检出。正如预期的那样，ATC患者的预后较差，死亡率为83%（5/6）。本研究审查时唯一存活的患者是唯一没有TP53突变的患者（在诊断后96个月时存活）。从诊断起的中位生存期为18个月。5/6例ATC患者诊断时患有IVc期疾病，远处转移主要发生于肺部。

本研究队列还包括3例低分化甲状腺癌患者，其中2例仅存在RAS突变（即不存在其他选定的致癌变异），而剩下的1例携带NRAS加CDKN2A移码突变。NRAS+CDKN2A突变患者在诊断后96个月死于甲状腺癌，而2例仅RAS突变患者分别在诊断后156个月和25个月时存活。这2例患者中，一例患者临床病程更具侵袭性，出现几处远处骨转移，而另一例患者对治疗反应较好，术后25个月未见疾病，这可能是在病程早期及时干预的结果。

其他致癌突变预测分化型甲状腺癌死亡率

排除ATC或PDTC患者，分析69例DTC患者。59例DTC仅携带RAS突变，而10例同时携带RAS和其他致癌基因突变。具体的突变见图2A和表2。 

比较携带其他甲状腺癌发生发展相关基因突变的患者（RAS+其他突变组，N = 10）与仅携带RAS突变的患者（N = 59），发现两组年龄和性别相似，前一组FTC比例更高（50% vs 8.5%，p = 0.002）。两组的风险显著不同（详见表3），RAS+其他突变组原发性肿瘤较大（4.7±2.2 cm vs 2.5±1.8 cm，p=0.002），诊断时AJCC分期较高（III期或IV期）[67%（N=6）vs 3%（N=2），p<0.001]，根据ATA复发风险分层评估系统被归为疾病复发风险高的肿瘤比例较高 [77%（N=7）vs 12%（N=7），p<0.001]（图3A）。RAS+其他突变组中60%（n=6）的患者在诊断时有远处转移，而仅RAS组为8%（n=5）（p=0.002）。 

表3. 仅携带RAS突变的DTC与携带RAS+其他致癌突变的DTC的临床和病理特征比较

图3. 仅携带RAS突变的DTC与携带RAS+其他致癌突变的DTC之间的临床病理特征比较。

A. ATA疾病复发风险的比较。B. 复发/持续性疾病发生率的比较。C. 比较仅RAS突变DTC与RAS+其他致癌突变DTC的疾病特异性死亡率的Kaplan Meier曲线。D. AJCC分期校正后比较仅RAS突变DTC与RAS+其他致癌突变DTC的疾病特异性死亡率的Kaplan Meier曲线

重要的是，RAS+其他突变组的患者疾病结局更差，与仅RAS组相比，复发或持续性疾病的发生率显著更高（87.5% vs 11%，p<0.001）（图3B）。携带突变的肿瘤更具侵袭性也体现在需要全身治疗（56%（n = 5）vs 4%（n = 2），p<0.001）和外照射放疗（56%（n = 5）vs 4%（n = 2），p<0.001）的患者比例更高。RAS+其他突变组的死亡率高出10倍（20% vs 1.8%）。仅RAS突变DTC患者的5年疾病特异性生存率为98%，而RAS+其他突变患者为70%（p = 0.007，图3C）。ATA复发风险低的仅RAS突变患者无人出现复发，远处转移，或死于甲状腺癌。

值得注意的是，在Cox回归分析中，携带其他突变与疾病特异性死亡率相关（HR 12.27（1.11-135.43），p=0.041）。当纳入AJCC晚期分期（≥3期）和性别时，其他突变仍然与疾病特异性死亡率独立相关（HR 28.03（1.54-509.33），p=0.024）。图3D展示了AJCC晚期分期调整后比较不同基因特征的Kaplan Meier曲线。

最后，分析了在本研究DTC队列中，在RAS突变FVPTC和PDTC中报告的染色体22q拷贝数缺失是否与更具侵略性的特征有关。发现染色体22q拷贝数为2的DTC（N=44）与杂合性缺失的DTC（N=25）的临床病理特征无显著差异。

讨 论 

在甲状腺癌常规临床实践中，基因检测得到越来越广泛的应用，特别是对于晚期疾病，寻找靶向治疗的患者。然而，结果解读和数据转化应用并不简单。本研究全面分析了78例RAS突变甲状腺癌患者的临床病理学和基因组特征。本研究中，ATC预后不良，且所有ATC都携带其他致癌突变。更重要的是，我们发现，即使在分化良好的RAS突变甲状腺癌中，其他致癌突变也预测更具侵袭性的临床病理行为，更具侵袭性的组织学特征，更差的预后，复发/持续性疾病的发生率显著更高，以及更高的疾病特异性死亡率。Cox回归分析显示，校正AJCC分期和性别后，基因特征与死亡率有关。本研究数据强调了高度异质性的RAS突变DTC进行基因检测的价值，可以辅助风险评估和治疗决策。

RAS致癌突变导致下游MAPK和PI3K / AKT信号通路的组成性异常激活，这是甲状腺肿瘤发生的关键事件。然而，与BRAFV600E相比，RAS突变对反馈抑制信号有反应，缓和MAPK活化程度。这导致RAS突变发生于不同类型的滤泡来源肿瘤。据推测，RAS突变滤泡腺瘤是RAS突变FTC和FVPTC的前体病变。尽管先前有研究表明RAS可能导致更具侵略性的表型，但最近一项研究并未发现RAS突变为疾病特异性死亡率的预测因子。因此，尚未证明RAS突变能够可靠地判断预后，需要其他标志物将更具侵袭性的肿瘤在病程更早期阶段识别出来。本研究表明RAS与其他选定基因变异共存可以作为侵袭性行为的有用生物标志物。

本研究纳入了大量RAS突变甲状腺癌，深入分析了基因特征与临床病理学特征的相关性。先前有研究显示，在ATC中，存在RAS和其他关键致癌突变是预后不良因素，本研究结果与其一致。在RAS突变DTC中，之前对基因协同作用的了解仅限于DTC同时存在RAS和TERT启动子突变与预后较差相关，而本研究数据将该概念扩展到RAS驱动DTC的其他致癌突变。我们使用Oncopanel NGS对数百个癌症相关基因进行了全面检测，然后选出了与甲状腺癌发生发展和生物学相关的突变。虽然本研究队列包含了不同类型的RAS突变甲状腺癌，但中高风险甲状腺癌较多，这些患者的临床管理通常具有挑战性。所以我们记录了基因突变特征未得到大量研究的肿瘤的遗传事件。值得注意的是，2016年，有研究描述NIFTP主要为惰性肿瘤。虽然未来更大队列研究专门探索这类肿瘤会很有趣，但我们没有排除这类肿瘤，因为仍然存在诊断不确定性，当前的WHO分类没有将其归类为良性，在临床实践中，这些肿瘤的治疗策略通常与非侵袭性FTC和FVPTC相同。 

目前，临床管理决策主要基于组织学分类和ATA疾病复发风险，其次基于对治疗的反应。然而，对于疾病复发风险中等的肿瘤，治疗和随访存在不确定性。这些肿瘤的基因检测结果可以帮助更好地进行风险分层，携带RAS+其他致癌突变的中风险肿瘤可能归类为高风险更好，支持传统的病理评估与分子检测相结合，为患者提供个体化治疗。类似地，本研究表明，ATA复发风险低的仅RAS突变的肿瘤患者无人出现复发，远处转移，或死于甲状腺癌。因此，本研究结果也有助于减轻该亚群患者和临床医生的随访负担。

也有甲状腺癌模型临床前研究探索了其他致癌突变。在转基因小鼠模型中，Hras（在牛甲状腺球蛋白启动子的控制下）和Kras（在高TSH刺激下）突变具有低致癌潜力，但可作为诱发因子。支持这一假设的是，体内研究表明，特定致癌突变可以促进RAS驱动的甲状腺病变向侵袭性肿瘤发展，主要例子是致癌Ras伴p53缺失导致PDTC和ATC的发展。

对肿瘤进行全面基因检测不仅可以更好地评估预后，还可以促进个体化肿瘤管理。在本研究队列中，81%的RAS+其他致癌突变患者接受了某种形式的全身治疗，如上所述，结局大多较差。因此，需要采用更有针对性的方案。尽管过去认为直接靶向RAS蛋白是不可能的，因为RAS蛋白表面缺乏药物结合口袋，但最近已经采用了几种策略，包括靶向上游和下游蛋白，直接RAS，以及RNA干扰。虽然最近已经开发了KRAS抑制剂，开展了临床试验，并获得了FDA批准，但随着耐药性的出现，KRAS抑制剂单药治疗的长期获益潜力不大，因此识别其他致癌突变对于联合疗法的选择至关重要。靶向PI3K/AKT/mTOR通路的治疗在临床前模型中显示出前景，但由于毒性，临床应用大多失败。尽管如此，晚期甲状腺恶性肿瘤发现其他可靶向治疗突变可以扩大治疗选择。

我们承认本研究存在局限性。本研究队列规模相对不大，无法细分具有其他致癌突变的亚组时。然而，这是具有完整的基因和临床病理学特征的最大队列之一，我们先前对BRAFV600E突变PTC进行了研究，本研究中各肿瘤亚型患者比例与该研究中相当。未来的多中心研究可以探索其他不同致癌突变的特定风险。尽管随访数据质量较高，但仍有10%的患者结局信息无法获得。这两个因素限制了本研究结果的统计功效，因此在较大患者队列中验证这些结果非常重要。此外，OncoPanel平台不包括EIF1AX基因。研究显示，在一部分RAS突变甲状腺癌中，EIF1AX突变与RAS突变共存，诱导去分化，因此有理由认为本研究队列中的一些RAS突变肿瘤也携带EIF1AX突变。

总之，本研究数据展现了RAS突变甲状腺癌最广泛的临床病理和基因特征。本研究表明，RAS突变DTC同时存在其他致癌突变不仅与更具侵袭性的组织学表型有关，还与复发和死亡率增加有关。鉴于甲状腺癌中仅RAS突变的诊断不确定性，我们认为全面基因检测有助于更好地评估预后，指导治疗和随访决策。我们承认临床实践中的成本和可及性问题，但这可以更好地为甲状腺癌患者提供个体化治疗。

参考文献：

Bikas A, Ahmadi S, Pappa T, Marqusee E, Wong K, Nehs MA, Cho NL, Haase J, Doherty GM, Sehgal K, Barletta JA, Alexander EK, Landa I. Additional Oncogenic Alterations in RAS-Driven Differentiated Thyroid Cancers Associate with Worse Clinicopathologic Outcomes. Clin Cancer Res. 2023 May 16:CCR-23-0278. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-23-0278. Epub ahead of print. PMID: 37191996.