mRNA疫苗的递送载体LNP和给药途径

mRNA疫苗递送载体——LNP

含有可电离脂质的脂质纳米颗粒(LNPs)是最先进的核酸载体，能够有效地在体内传递mRNA。用于mRNA递送和疫苗应用的LNP系统的开发利用了在开发用于siRNA临床应用的非病毒递送系统期间获得的广泛的临床前和临床知识。LNPs已被广泛用于传递对抗感染病原体的常规和自复制的mRNA。

LNP配方通常由可电离阳离子脂质(例如KC2、MC3和C12-200)、两性离子脂质(如DOPE)、胆固醇和脂质锚定的聚乙二醇酯(图1)的精确摩尔比组成。阳离子/可电离头部基团与带负电的mRNA之间的静电相互作用产生带正电的脂质双层的层状结构，它们之间被带负电的核酸片断隔开。为了提高LNPs的效力和耐受性，已经合理地设计了可电离脂质。另一方面，两性离子脂被掺入LNPs中，以调节囊泡流动性，改善与膜磷脂的离子配对，并促进货物的内体释放。胆固醇的加入增强了LNP产品的质量属性(即延长了保质期)，通过增加纳米颗粒膜的结构(物理)支撑减少了循环中(体内)的自发解离，并通过热力学上有利的纳米颗粒-质膜重排过程改善了内体释放。低摩尔比(1-2%)的PEG型锚定脂可提高胶体稳定性，减少蛋白质的表面吸附，略微延长体内半衰期(*10-15min)，并改善表面水合作用。

图1 mRNA-LNPs的细胞摄取和内吞途径以及mRNA释放到细胞质。

mRNA-LNPs通过内吞作用(即网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞作用和巨噬细胞吞噬作用)、通过内体网络的运输和以内源性内吞囊泡(外泌体或胞外囊泡)形式的胞吐作用进入细胞。一小部分mRNAs从早期的内体逃逸并进入细胞质，在细胞质它们被翻译成蛋白质，这些蛋白质可以被定向到细胞内或细胞外的各种隔室(即，细胞质、细胞外间隙或质膜)。未经修饰的mRNAs(非复制或SAM)由模式识别受体(PRRs)检测。PRR的激活诱导促炎细胞因子(如I型干扰素)的分泌，从而减少蛋白表达和mRNA的分泌(红色箭头路径)。绿色圆圈代表可电离脂质，而红色圆圈代表用于制备脂质纳米颗粒的两性离子脂质(即，DOPE)。大胞体、早期和晚期内体中的淡蓝色圆圈代表内吞的脂质纳米颗粒，而离开细胞的淡橙色圆圈代表内源性形成的细胞外小泡(EndoEVs)，包含IVT mRNA和来自内吞LNPs的可电离脂质。

mRNA疫苗的给药途径

mRNA疫苗的给药途径在阻止疫苗效力方面起着重要作用。图2描述了最常用的注射途径，包括皮内(ID)、皮下(SC)、肌肉(IM)、结内(IN)和静脉(IV)给药。其他途径，如鼻腔注射、阴道内注射和肿瘤内注射，也进行了测试。由于免疫细胞和淋巴器官是常见的接种目标，接种部位(皮肤、肌肉、淋巴器官和全身循环)的解剖和生理特性可能会影响疫苗的安全性和有效性。当选择了mRNA疫苗的类型(常规的或自复制)和递送形式(载体介导的、裸露的或基于细胞的)时，这些信息对于选择给药途径是有用的。

图2 mRNA疫苗注射的常见途径

皮内注射(ID)将mRNA疫苗直接输送到真皮区域，这是致密的结缔组织(图2a)。真皮组织中的抗原提呈细胞(APC)，如真皮树突状细胞(DC)和巨噬细胞，可以内化和处理mRNA疫苗。这一层皮肤中的血管和淋巴管也有助于将mRNA疫苗和APC输送到引流的淋巴结处，以激活T和B细胞。由于这些特性，ID注射剂被用于输送编码狂犬病病毒糖蛋白的mRNA疫苗的临床研究中。结果表明，用无针装置接种ID疫苗比IM注射能产生更好的抗体反应。虽然ID注射剂优先进入免疫细胞和淋巴器官，并显示出疫苗接种效果，但该方法注射量小，局部不良反应风险高，包括肿胀、疼痛、红斑和瘙痒。为了增加注射量和mRNA的剂量，在一项临床试验中，患者在每次就诊的不同部位接受多次ID注射。

皮下注射(SC)将mRNA疫苗注射到表皮和真皮下的皮下区域(图2b)。这一层皮肤主要由松散的脂肪组织网络组成，与真皮相比，免疫细胞很少。与ID注射相比，SC注射部位疏松的脂肪组织允许更大的注射量，引起的疼痛更少，压力更低。此外，较大的注射量可能会补偿这一层皮肤中较低效率的引流活动。值得注意的是，SC区的吸收速度很慢，这可能会导致mRNA疫苗的意外降解。

肌肉注射(IM)将疫苗注射到肌肉，肌肉是真皮和皮下更深的组织(图2c)。肌肉包含一个巨大的血管网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞，如渗透的APCs，到注射部位。一项研究表明，肌肉注射LNPs包裹的mRNA后，至少在注射和引流淋巴结部位28h可检测到放射性标记的mRNA，详细的流式细胞术分析表明，肌肉中的APCs以及引流淋巴结中的APCs和B细胞都含有放射性标记的mRNA。人体IM注射量大于ID注射量。此外，与ID和SC途径相比，IM注射可能会引起较轻的局部副作用。因此，肌注是佐剂疫苗最广泛使用的给药途径。

结内注射(IN)直接将mRNA疫苗引入周围淋巴器官，在那里APCs和预置的T或B细胞相互作用(图2e)。IN注射被认为是一种有效的疫苗接种方式，因为淋巴器官中的APCs可以很容易地吞噬注射的mRNA疫苗。尽管有研究报道，与DNA、多肽和蛋白质疫苗的其他注射方法相比，IN传递途径的疫苗接种效率更高，但IN传递途径与其他mRNA疫苗途径之间的并列比较仍然有限。此外，注射用IN很少使用，主要是因为程序相对复杂。例如，IN注射需要在人体内进行超声引导。

由于黏膜部位淋巴器官中存在可获得的APCs细胞，以及它们对各种病原体的保护作用，因此研究了mRNA疫苗的粘膜递送。黏膜给药途径主要有鼻腔给药和阴道给药两种。鼻腔注射将mRNA疫苗输送到鼻黏膜和鼻相关淋巴组织(NALT)，这两种组织都含有丰富的APCs和相关免疫细胞。因此，有报道称，鼻腔递送抗原编码的mRNA可以诱导体液免疫和细胞免疫。鼻腔给药也可以将mRNA通过气管输送到肺部。与鼻黏膜和NALT类似，肺中可获得的未成熟和激活的APCs可以吞噬并处理mRNA疫苗。此外，通过鼻腔注射将mRNA疫苗注射到肺上皮细胞，并表达了针对病毒感染的中和抗体。阴道内注射是将mRNA疫苗运送到感染部位以表达中和抗体的另一种方法。在一份报告中，阴道内注射编码抗HIV抗体的mRNA疫苗在绵羊和恒河猴的生殖道中诱导了高水平的抗体表达。免疫荧光染色显示表达的抗原主要分布在宫颈上皮细胞和间质细胞中。

静脉注射(IV)将mRNA疫苗输送到体循环(图2d)。在上述给药途径中，静脉注射量是最大的。与其他途径相比，静脉注射产生的蛋白质总量往往是最高的。因此，当循环中需要功能性浓度的抗体时，选择IV途径来递送编码中和抗体的mRNA。一般来说，静脉注射的LNP将mRNA输送到肝脏，更具体地说，根据不同类型的输送载体，向肝细胞、Kupffer细胞和肝内皮细胞输送mRNA。此外，静脉注射还可能允许mRNA疫苗直接进入循环系统中的免疫细胞和淋巴器官，这可能会增强疫苗接种效果。例如，以往的研究发现，静脉注射针对脾DCs的mRNA疫苗，并在小鼠体内诱导抗肿瘤免疫反应。尽管静脉注射有上述优点，但血液中的血浆蛋白质、酶和机械力可能会阻碍疫苗的递送。此外，向循环中注入mRNA和递送载体可能会引起全身副作用，如脾损伤和淋巴细胞耗竭。

表1 mRNA疫苗的主要给药途径

综上所述，不同给药途径的生物学特性可能会影响疫苗接种的安全性和有效性。表1总结了几种主要的mRNA疫苗传递途径的特点。对于给定的mRNA型和递送载体的组合，仔细比较几种给药途径将有助于确定最合适的注射方法，并促进有效的mRNA疫苗的开发。