再生元对TCR-CD3和pMHC复合物的结构分析

第一个TCR结构(Nature,2019)是哈工大黄志伟教授团队揭示的，八聚体TCR–CD3复合物以TCRαβ:CD3γε:CD3δε:CD3ζζ的1:1:1:1化学计量组装，通过疏水和离子相互作用将TCR-αβ的跨膜螺旋插入桶状结构，导致TCR-CD3复合体的跨膜组装。同样，哈工大也是第一次报道TCR结合胆固醇的数据(Mol Cell,2022)，揭示胆固醇抑制TCR的结构基础。这些研究为TCR触发提供了线索，并为合理设计针对复合物的免疫疗法奠定了基础。同时也为后期的研究积累了可参考的研究方法。

在这里，再生元报告了两个来自人源化小鼠的μM级亲和力全长α/β TCR-CD3复合体与其pMHC配体，癌症-睾丸抗原HLA-A2/MAGE-A4(230-239)结合的冷冻电镜(cryoEM)结构。还测定了含有MAGE-A4(230-239)肽和密切相关的MAGE-A8(232-241)肽的pMHC在没有TCR的情况下的cryoEM结构，并提出了两个TCRs优先与MAGE-A4结合的结构机制，这为TCR表现出MAGE-A4偏好提供了结构解释。这些发现为临床相关癌症抗原的TCR识别提供了洞察力，并证明了cryoEM在TCR-pMHC相互作用的高分辨率结构分析中的作用。

全长PN45545 TCR-CD3的冷冻电镜结构

从MAGE-A4 230-239多肽免疫的人源化VelociT小鼠中分离到两个α/β TCR，分别为PN45545和PN45428。首先对PN45545 TCR进行了研究，采用先前哈工大研究的方法，在HEK293细胞中表达了一个全长的PN45545 TCR-CD3εδγζ复合体，并在没有化学交联剂的情况下将其纯化到均一状态。确定了PN45545 TCR-CD3复合体的冷冻电镜结构，分辨率为3.0Å (图1a，b，表1)。该复合体中每个亚基的胞外(ECD)和跨膜(TM)结构域的大多数残基的侧链密度都得到了很好的分辨。在TCRα(N58、N150、N184、N195)、TCRβ(N84、N107、N184)、CD3δ(N38、N74)和CD3γ(N52、N92)(图1b)上检测到N-连接的聚糖密度。还注意到位于TCRβ、CD3γ和CD3ζ亚基的TM螺旋之间的脂密度，由于其形状特征匹配并且存在于纯化缓冲液中，暂时将其命名为胆固醇琥珀酸半酯(CHS)(图1a，c)。在哈工大的研究中，在这个位置观察到了类胆固醇密度，提出了这种脂的功能作用。有趣的是，冷冻电镜图表明CD3δ残基C124上的S-棕榈酰化的可能性，与棕榈酰化分析研究相一致，该研究表明CD3δ是一个高置信度靶标。CD3亚基的细胞质尾部在冷冻电镜图中没有被分辨，可能是由于灵活性的原因。TCR恒定区和CD3亚基的结构和排列与哈工大已发表的TCR-CD3复合结构(图1c-e)几乎相同。然而，TCR可变区和恒定区之间的肘角略有不同，可能反映了它们不同的Vα/Vβ序列(图1e)。结合已发表针对不同α/β对的冷冻电镜研究，PN45545 TCR-CD3复合结构支持TCR-CD3的整体结构和组装不受TCR可变区序列差异的影响。此外，PN45545 TCR-CD3结构证实在人源化小鼠中发现的抗原特异性TCR具有预期的结构特征。

图1 PN45545 TCR-CD3复合体的冷冻电镜结构。

表1 CryoEM数据、结构改进和验证

全长PN45545 TCR-CD3和PN45428 TCR-CD3复合物与HLA-A2/MAGE-A4(230-239)的冷冻电镜结构

为了深入了解两个不同的TCR识别MAGE-A4(230-239)肽的结构基础，测定了与HLA-A2/β2M/MAGE-A4(230-239) (MAGE-A4 pMHC)连接的全长PN45545和PN45428 TCR-CD3复合体的冷冻电镜结构的分辨率分别为2.7和3.3Å (图2)。这些结构是在商业上可用的抗β2M单抗2M2的Fab片段的存在下确定的，该片段被用作改善MAGE-A4 pMHC的冷冻电镜信号的基准标记(图2a，d)。冷冻电镜图显示了MAGE-A4肽及附近区域清晰的侧链密度，从而能够明确地建立模型和评估TCR-pMHC界面上的氨基酸水平相互作用(图2b，e)。比较未结扎和结扎的PN45545 TCR-CD3结构时，唯一显著的差异存在于CDRs。然而，建议谨慎解释这些结构差异，因为在没有pMHC的情况下计算的PN45545 TCR-CD3图中没有很好地定义CDR。

图2 TCR-CD3与MAGE-A4 pMHC复合物的冷冻电镜结构。

PN45545和PN45428的TCR-pMHC结合方向遵循对产生辅受体结合重要的典型对接极性，Vα区域朝向HLA α2螺旋，Vβ区域朝向HLA α1 (图2c，f)。然而，这两个TCR与pMHC以不同的结合模式结合，其特征是PN45545和PN45428的对接角度分别为45°和94°(图2c，f，g)。为了评估CD8共受体结合的几何形状，使用已发表的小鼠CD8αβ与MHC结合的晶体结构，在两个全长MAGE-A4 TCR-CD3复合物的背景下模拟CD8αβ的结合(下图)。如哈工大的研究一致，尽管它们有不同的对接角度，但PN45545和PN45428都与MAGE-A4 pMHC结合，使得CD8αβ Ig结构域的C末端朝向T细胞膜，有利于TCR/CD3/CD8的顺式构型和pMHC/CD8的反式结合。这说明了辅受体结合的几何约束如何适应TCR/pMHC结合角度的范围。

虽然它们的对接角度和CDR序列是不同的(图3a)，但两个TCR都有一个向MAGE-A4肽的N-末端移动的结合足迹(图3b-e)。在这两种情况下，TCR接触(原子间距离在4Å)仅限于多肽残基D4、G5和R6，它们形成暴露在溶剂中的凸起。多肽(E7-V10)的C末端部分没有接触，表明它在TCR识别中不起直接作用。值得注意的是，报道的来自健康供者的α/β TCR在MAGE-A4 pMHC上也显示了N端移位的结合模式，这表明在人类和人源化小鼠模型中，该肽的N端部分和附近的HLA区域可能是免疫优势的。

图3 TCR-MAGE-A4 pMHC相互作用。

PN45545和PN45428的多肽接触主要由CDR3β介导。在PN45545的情况下，CDR3β残基F95和Y99分别与多肽R6和D4发生明显的阳离子-π和氢键相互作用(图3d)。这些和CDR3β中的其他残基也使范德华与G5肽相互作用。CDR 1α(S31)和3α(G97)为多肽D4(图3d)提供了额外的接触。对于PN45428，CDR3β的E103与多肽R6形成盐桥，而CDR3β中的额外残基接触多肽G5和R6的主干原子(图3e)。PN45428α链残基R31和N97分别与多肽D4发生盐桥和极性作用(图3e)。除了通过独特的TCR特异性相互作用稳定的不同的R6侧链旋转体外，这两种结构中的多肽构象几乎相同(图3f)。因此，R6侧链的流动性对于不同的TCRs识别这种MAGE-A4多肽抗原似乎是至关重要的，这一点以前在没有TCR的MAGE-A4 pMHC的晶体结构中已经注意到。

高度相似的MAGE-A4和MAGE-A8多肽之间TCR区分的结构基础

HLA-A2/MAGE-A4(230-239)反应性TCR先前已表现出与MAGE-A8(232-241)残基衍生的类似的HLA-A2限制性多肽的交叉反应。MAGE-A4(230-239)和MAGE-A8(232-241)肽的不同之处只有两个保守的替换：在位置2(V2L)的缬氨酸到亮氨酸的替换，以及在第9位(T9S)中等表面暴露的残基上的苏氨酸到丝氨酸的替换。为了评估PN45545和PN45428与MAGE-A4/MAGE-A8的交叉反应性，首先在原代人T细胞中表达TCRs，并用pMHC四聚体试剂进行流式细胞术分析。有趣的是，PN45428显示与HLA-A2/MAGE-A8(232-241)结合，但与HLA-A2/MAGE-A4(230-239)结合程度较小(图4a)。而对于PN45545，未检测到与HLA-A2/MAGE-A8结合的信号。为了证实与MAGE-A8抗原的亲和力降低，用SPR结合试验测定了去垢剂溶解的TCR-CD3和MAGE-A4/MAGE-A8 pMHC的平衡结合亲和力(图4b，c)。PN45428与MAGE-A4的亲和力约为MAGE-A8的10倍，PN45445与MAGE-A4的亲和力约为MAGE-A4的70倍，这与流式细胞仪观察到的PN45545 TCR的更高特异性一致(图4a)。

图4 TCRs与MAGE-A4 pMHC的优先结合高于MAGE-A8 pMHC。

为了确定两个取代位中的哪一个(V2L和T9S)比MAGE-A8更优先地与MAGE-A4结合，用流式细胞术测试了含有单一取代肽V2L或T9S的pMHC四聚体试剂与表达PN45545或PN45428 TCRs的Jurkat细胞的结合(下图)。观察到，与野生型MAGE-A4相比，V2L突变体与PN45545的结合可以忽略不计，与PN45428的结合减少。T9S突变多肽与PN45545和PN45428的结合水平与MAGE-A4相似。因此，TCR对HLA-A2/MAGE-A8的亲和力降低可归因于V2L锚基的替代。

这两个TCR对MAGE-A4(230-239)比MAGE-A8(232-241)的偏好不能直接用PN45545或PN45428(图3b-e)的肽结合模式来解释；两个不同的肽之间的两个残基都不能被TCRs接触。为了进一步研究这两个多肽表位之间的结构差异，在没有TCR的情况下对MAGE-A4和MAGE-A8 pMHC进行了冷冻电镜分析。这些实验使用了单链二硫键稳定的pMHC试剂，并将抗β2M抗体2M2的Fab片段添加到样品中作为基准，以便于冷冻电镜数据处理。分别获得了MAGE-A4和MAGE-A8 pMHC的3.1和4.8 Å分辨率重建(图5a，b)。这些图谱具有足够的分辨率来定义包埋在HLA上的多肽的构象。中心R6残基的侧链没有很好的分解，这与它在没有TCR的情况下的灵活性一致。正如从它们的保守序列所预期的那样，MAGE-A4和MAGE-A8肽的结构高度相似(图5c)。最显著的差异出现在多肽残基D4处。D4侧链向下突出到MAGE-A4肽中的HLA-α2螺旋，而向上突出，远离MAGE-A8肽中的HLA槽，似乎与HLA-α1上的R65侧链形成盐桥相互作用(图5d-f)。不同的D4构象可归因于第2位的V/L取代；MAGE-A8中较大的亮氨酸侧链导致多肽骨架的轻微重塑，从而有利于多肽D4/HLA R65盐桥的形成。在以前报道的MAGE-A4 pMHC晶体结构中，也观察到在缺少和存在TCR的情况下，D4肽的向下构象，这表明这是MAGE-A4肽的一个相对稳定的特征，当在第2位引入亮氨酸时，它会受到干扰。

图5 MAGE-A4和MAGE-A8 pMHC与2M2 Fab形成的复合物的冷冻电镜结构显示出不同的MHC展示的多肽构象。

MAGE-A4和MAGE-A8 pMHC的结构表明，D4肽残基的不同构象是区分的关键。事实上，这两个TCR都与采用下行构象的多肽D4侧链进行多次接触(图3d，e；5g，h)。此外，这两种TCR都通过CDR2β中的残基直接与HLA-A2 α1螺旋残基R65相互作用。值得注意的是，R65经常作为HLA“限制三联体”的一部分参与TCR相互作用。对于PN45545，来自CDR2β的Y50似乎与R65发生阳离子-π相互作用(图5g)，而在PN45428中，来自CDR2β的E52与R65形成静电相互作用(图5h)。这些相互作用可能在HLA-A2/MAGE-A8的背景下受到影响，其中R65的正电荷被其与多肽D4的相互作用所中和。综上所述，结构数据表明，这些TCR与MAGE-A4的优先结合可能是由于相互作用要求多肽D4处于向下构象，其中它不与HLA残基65相互作用。MAGE-A8采用MAGE-A4样肽构象需要破坏多肽D4-R65盐桥(图5f)，这在能量上可能是不利的。

总结

总体而言，这项研究建立在哈工大报告的基础上，作为冷冻电镜在TCR-pMHC识别结构研究中应用的原则证明，预计这将加速机制研究的进展，并有助于癌症免疫疗法的发展。

Dong, D., Zheng, L., Lin, J., Zhang, B., Zhu, Y. & Li, N. et al. Structural basis of assembly of the human T cell receptor-CD3 complex. Nature 573, 546–552 (2019).

Chen, Y. et al. Cholesterol inhibits TCR signaling by directly restricting TCR-CD3 core tunnel motility. Mol. Cell. 82, 1278–1287.e5 (2022).

Susac, L. et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell 185, 3201–13.e19 (2022).

Dhillon, S. Tebentafusp: First approval. Drugs 82, 703–710 (2022).

Saotome, K., Dudgeon, D., Colotti, K. et al. Structural analysis of cancer-relevant TCR-CD3 and peptide-MHC complexes by cryoEM. Nat Commun 14, 2401 (2023).